Summary
Este protocolo proporciona un análisis de las subpoblaciones de macrófagos en el sistema nervioso central del ratón adulto mediante citometría de flujo y es útil para el estudio de múltiples marcadores expresados por estas células.
Abstract
Numerosos estudios han demostrado el papel de las células inmunitarias, en particular los macrófagos, en las patologías del sistema nervioso central (SNC). Existen dos poblaciones principales de macrófagos en el SNC: (i) la microglia, que son los macrófagos residentes del SNC y se derivan de progenitores del saco vitelino durante la embriogénesis, y (ii) los macrófagos derivados de monocitos (MDM), que pueden infiltrarse El SNC durante la enfermedad y se derivan de progenitores de médula ósea. Los roles de cada subpoblación de macrófagos difieren dependiendo de la patología que se estudia. Además, no hay consenso sobre los marcadores histológicos o los criterios distintivos utilizados para estas subpoblaciones de macrófagos. Sin embargo, el análisis de los perfiles de expresión de los marcadores CD11b y CD45 mediante citometría de flujo nos permite distinguir la microglia (CD11b + CD45 med ) del MDM (CD11b + CD45 alto ). En este protocolo, mostramos que la centrifugación de gradiente de densidadY el análisis de citometría de flujo se puede utilizar para caracterizar estas subpoblaciones de macrófagos del SNC, y para estudiar varios marcadores de interés expresados por estas células como hemos publicado recientemente. Por lo tanto, esta técnica puede ampliar nuestra comprensión de la función de los macrófagos en ratones modelos de enfermedades neurológicas y también se puede utilizar para evaluar los efectos de los medicamentos sobre estas células.
Introduction
Los microglios son los macrófagos residentes en el tejido parenquimatoso del sistema nervioso central (SNC). Ellos juegan dos funciones funcionales clave: la defensa inmune y el mantenimiento de la homeostasis del SNC. En contraste con el MDM, que se renuevan continuamente de las células madre hematopoyéticas en la médula ósea, las células microgliales se diferencian de las células progenitoras hematopoyéticas primitivas originadas en el saco vitelino (YS) que colonizaron el cerebro durante el desarrollo embrionario 1 , 2 , 3 . En los roedores, el factor de transcripción Myb desempeña un papel crucial en el desarrollo de todos los monocitos y macrófagos derivados de la médula ósea, pero para la microglia derivada de YS, este factor es dispensable y la diferenciación sigue dependiendo del factor de transcripción PU.1 4 .
En el SNC sano, microglia son células dinámicas que constantemente muestrean su ambiente, scaY detección de patógenos invasores o daño tisular 5 . La detección de tales señales inicia un camino para resolver la lesión. La microglia cambia rápidamente de una morfología ramificada a una ameboidea, seguida de fagocitosis y liberación de diversos mediadores, tales como citoquinas pro- o antiinflamatorias. Así, dependiendo de su microambiente, microglia activado puede adquirir un espectro de diferentes estados de cebado [ 6] .
La microglia afecta profundamente el desarrollo y progresión de muchos trastornos neurológicos. En los modelos de roedores de la enfermedad de Alzheimer (EA) 7 , la esclerosis lateral amiotrófica (ELA) 8 , la esclerosis múltiple (EM) 9 o la enfermedad de Parkinson (PD) 10 , se demuestra que la microglia desempeña un doble papel, induciendo neurotoxicidad perjudicial o actuando De una manera neuroprotectora, que depende deN la enfermedad específica, la etapa de la enfermedad y si la enfermedad estaba influenciada por el compartimento inmunológico sistémico 7 , 8 , 9 , 10 , 11 . La mayoría de las lesiones del SNC observadas en las enfermedades citadas anteriormente contienen una población heterogénea de células mieloides, incluyendo no sólo microglia parenquimatosa, sino también macrófagos perivasculares y meníngeos, así como MDM infiltrante al SNC. Estos tipos de células pueden contribuir de forma diferencial a los mecanismos fisiopatológicos relacionados con la lesión y la reparación 7 , 12 , 13 , 14 , 15 . El desafío actual para los investigadores que estudian estos modelos de enfermedad es establecer si los monocitos periféricos y los macrófagos se infiltran en el SNC y, en caso afirmativo, distAngustia la microglia residente de estas células. De hecho, las células microgliales son muy plásticas; Cuando se activan, las microglias vuelven a expresar los marcadores que suelen expresarse por monocitos periféricos y macrófagos. La cuestión, por lo tanto, se basa en la identificación de marcadores que pueden distinguir la microglia residente de los monocitos infiltrados y macrófagos.
La discriminación de estas poblaciones sobre rodajas de cerebro por aplicaciones inmunohistológicas es limitada debido a la falta de anticuerpos específicos. Sin embargo, el análisis de citometría de flujo es una técnica eficiente para evaluar la expresión de varios marcadores y para distinguir las poblaciones celulares (por ejemplo, linfocitos, macrófagos MDM CD11b + CD45 alto y microglia CD11b + CD45 med ), así como las subpoblaciones celulares 16 , 17 , 18 . Este protocolo describe los procedimientos para aislar elCélulas mononucleares del SNC de ratón en modelos de enfermedad neurológica utilizando una disociación enzimática optimizada de tejido y una centrifugación de gradiente de densidad; Así como un método para diferenciar las poblaciones de microglia y MDM en el SNC mediante citometría de flujo.
Otra aproximación es eliminar la mielina y purificar las células usando perlas magnéticas conjugadas con anticuerpos específicos 19 , 20 , 21 . La eliminación de mielina utilizando perlas magnéticas anti-mielina es más caro y afecta a la viabilidad y el rendimiento de las células aisladas [ 22] . Esta etapa y la siguiente separación inmunomagnética de la microglia, limitan los estudios adicionales de las poblaciones específicas de células inmunes 21 , 22 .
Estos procedimientos proporcionan una manera fácil de estudiar las subpoblaciones de macrófagos en el desarrollo de la enfermedad, yPara determinar los efectos de los fármacos o modificaciones genéticas en fenotipos de macrófagos y estados de activación.
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Protocol
Todos los métodos descritos aquí han sido aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales en el Instituto ICM y por el Comité de Ética Animal de Darwin y están cubiertos por el protocolo 01407.02.
1. Preparación
- Preparar el cóctel de digestión en un tubo de 1,5 ml combinando lo siguiente para cada ratón: 1 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS); 123 mu l de enzima de digestión (ver tabla de materiales) a 13 wunsch / mL (solución madre), concentración final 1,6 wunsch / mL; Y 5 μl de DNasa I (ver tabla de materiales) a 100 mg / ml (solución madre), concentración final 0,5 mg / ml.
2. Perfusión y disección
- Euthanize los ratones con una dosis letal de pentobarbital (100 μ l a 400 mg / ml).
- Coloque al animal en decúbito supino y humedezca el cuerpo con etanol al 70%.
- Corte la piel ventral con unas tijeras finas justo debajo del proceso xifoide para exponer el cavit torácicoY.
- Hacer una incisión en el diafragma y cortar los aspectos laterales de la caja torácica con tijeras finas en una dirección caudal a rostral para exponer el corazón (y evitar el corte de otros órganos). Identificar el ventrículo izquierdo (LV) y la aurícula derecha (RA).
- Inserte un catéter de mariposa con una aguja de 25 G dentro del LV. Hacer una incisión en la RA con tijeras finas y al comienzo del flujo sanguíneo, iniciar la perfusión a 10 ml / min de flujo a través del LV con 20 ml de PBS para eliminar las células y la sangre de los vasos; La perfusión exitosa se observa por el blanqueamiento de los pulmones y el hígado a medida que la sangre se desplaza.
- Decapitar al animal con tijeras medianas. Disecar la columna vertebral con tijera fina y separarla del cuerpo mediante la excisión de la musculatura de la pared abdominal en el lado ventral de la columna vertebral y cortando la columna vertebral en la base de la cola.
- Inserte una jeringa de 10 ml que contenga PBS y una punta de pipeta montada de 200 μL en el lado lumbar deLa columna vertebral y enjuague la médula espinal en el lado cervical.
NOTA: La punta de la pipeta de 200 μL se corta con tijeras en su extremo más ancho (aproximadamente 1 cm) y se inserta firmemente en una jeringa de 10 ml previamente llena de PBS. - Retire la piel por encima del cráneo y use fórceps para exponer el cerebro. Insertar una hoja de tijera en la base del cráneo y cortar el cráneo después de la sutura sagital. Inserte una pinza pequeña en el corte y suavemente levante el cráneo. Diseccionar el cerebro de la cabeza del ratón y quitar el bulbo olfatorio y el cerebelo.
- Recoger el cerebro y la médula espinal en un tubo de 1,5 ml que contiene 1,128 ml de PBS con cóctel de digestión (de la etapa 1.1).
3. Disociación de células
- Corte finamente el cerebro y la médula espinal en el tubo de 1,5 ml (paso 2.9) en 1-2 mm 3 piezas con tijeras pequeñas ( Figura 1 ).
- Incubar el tubo de 1,5 ml que contiene los tejidos picados durante 30 min en una incubadoraA 37 ° C con 5% de CO 2 .
NOTA: Prepare el gradiente de densidad en este paso. - Añadir 20 μL de EDTA 0,5 M (solución madre), concentración final 10 mM, al tubo de 1,5 ml para detener la reacción enzimática.
- Hacer suavemente una suspensión de células pipeteando hacia arriba y hacia abajo con una pipeta de 5 ml.
- Pasar la suspensión celular a través de una malla de nylon (tamaño de poro de 70 μm) en un tubo de 50 ml usando el émbolo de una jeringa de 10 ml.
- Lavar la malla de nylon con 20 ml de suero bovino fetal al 5% (FBS) -PBS.
- Centrifugar durante 7 min (300 xg) a temperatura ambiente (18 ° C). Desechar el sobrenadante por aspiración y pasar al siguiente paso. Tenga mucho cuidado al retirar el sobrenadante; No perturbe el gránulo, que puede ser aspirado fácilmente por la pipeta de aspiración.
4. Gradiente de densidad
- Preparar una solución madre del medio de gradiente de densidad añadiendo la cantidad apropiada de 10x PBS al medio de gradiente de densidad.
NOTA: Agregue una parte 10X PBS a nueve densidad de gradiente de densidad de piezas. - Diluir el medio de gradiente de densidad de reserva con 1x PBS para los diferentes porcentajes como se describe en la Tabla 1 .
- Resuspender el gránulo (del paso 3.7) con 4 ml de medio de gradiente de densidad al 30% y transferir a un tubo de 15 ml.
- Coloque una pipeta Pasteur en el fondo del tubo de 15 mL y lentamente subyacente 4 mL de medio de gradiente de densidad al 37%.
- Añadir 4 ml de medio de gradiente de densidad al 70%, como se ha descrito anteriormente.
- Centrifugar el gradiente durante 40 min (800 xg) a temperatura ambiente (18ºC). Asegúrese de que la centrífuga se detiene con un mínimo o ningún freno para que la interfase no se altere.
NOTA: El tubo aparecerá estratificado. Las células acodadas en la interfase del gradiente de densidad del 70% al 37% son las células inmunes mononucleadas (subpoblaciones de microglia y macrófagos); Los niveles superiores son restos celulares y mielina, respectivamente ( Figura 2 ). - Recoger 3-4 mL de la interfase de gradiente de densidad 70-37% que contiene las células de las subpoblaciones de macrófagos en un tubo limpio de 15 mL.
- Lavar las células 3x con PBS, volumen total de 15 mL. Asegúrese de que el medio de gradiente de densidad que contiene las células se diluye al menos tres veces con PBS y se centrifuga durante 7 min (500 xg, 4 ° C) con el freno encendido.
- Resuspender el sedimento de células con 1 mL de PBS para el marcaje celular o para otros ensayos funcionales.
5. Etiquetado de células para citometría de flujo
- Transferir las células (paso 4.10) en un tubo de citometría de flujo.
- Añadir 1 μl de reactivo de tinción de células muertas fijables a cada muestra de células obtenida en el paso 4.10. Incubar durante 30 minutos en hielo, protegido de la luz.
- Lavar las células una vez con 2 ml de PBS y centrifugar durante 5 min (300 xg, 4 ° C).
- Retirar el sobrenadante, y resuspender el sedimento celular con400 mu l de PBS 1% de BSA, 0,1% de azida.
- Añadir 1 μg de anticuerpos CD16 / CD32 a 100 μl de las células para bloquear los receptores Fc. Incubar 10-15 min en hielo, protegido de la luz.
- Preparar la mezcla de anticuerpos primarios en PBS 1% de BSA, 0,1% de azida o PBS 1% de BSA, 0,1% de azida, 0,25% de saponina, para la permeabilización celular para la tinción intracelular.
- Añadir 100 μL de anticuerpos primarios mezclar (2x) e incubar durante 30 minutos en hielo, protegido de la luz.
NOTA: Todos los anticuerpos deben ser titulados antes de realizar el experimento para asegurar resultados óptimos. - Lavar las células con 2 ml de PBS y centrifugar durante 5 min (300 xg, 4 ° C). Repita este paso tres veces.
- Añadir 100 μl de un anticuerpo secundario si los anticuerpos primarios no están directamente conjugados con un fluoróforo, e incubar durante 30 minutos en hielo, protegido de la luz.
- Lavar las células con 2 ml de PBS y centrifugar durante 5 min a 300 xg a 4 ° C). Repita este paso tres veces.
- Arregla elCon 100 μl de PFA al 1% durante 15 minutos a temperatura ambiente, protegido de la luz.
NOTA: Precaución: El PFA es tóxico. Utilizar en una campana extractora y usar equipo de protección personal. - Lavar las células con 2 ml de PBS y centrifugar durante 5 min a 300 xg a 4 ° C. Repita este paso tres veces.
- Resuspender el sedimento de células con 200 μ l de PBS y proceder a la citometría de flujo de adquisición y análisis. Siga la estrategia de apertura en la Figura 3 .
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Representative Results
Después de la centrifugación de gradiente de densidad y tinción de anticuerpos, las células se adquirieron en un citómetro de flujo y se analizaron usando una estrategia de bloqueo morfológico como sigue. Se definió una primera puerta en la zona de dispersión hacia delante (FSC-A) de trama de puntos frente a la altura dispersada hacia delante (FSC-H) para discriminar células individuales de dobletes ( figura 3A ). Las células individuales fueron entonces cerradas en FSC-A frente a parcelas de puntos de área dispersa lateral (SSC-A) para excluir los restos celulares y las células picnóticas, basándose en el tamaño de celda relativo y la granularidad celular ( Figura 3B ). El MDM se identificaron en función de sus niveles de expresión de los marcadores CD11b y CD45 ( Figura 3C , 3D ). Finalmente, se analizaron otros marcadores de expresión para cada subpoblación de macrófagos ( Figura 3E -3G ). El microglIa se informó que expresan el CX3CR1 pero no el marcador CCR2 en contraste con MDM [ 23] . Recientemente, se demostró que Tmem119 es un marcador específico para microglia [ 19] . Los marcadores siguientes (Tmem119, CX3CR1 y CCR2) se evaluaron mediante citometría de flujo usando anticuerpos detectores específicos para cada marcador; Todas las células CD11b + CD45 med fueron positivas para los marcadores Tmem119 y CX3CR1, pero no para el marcador CCR2, lo que valida esta estrategia de gating ( Figura 3E -3G ).
En ausencia del aislamiento del gradiente de densidad, las subpoblaciones de macrófagos no pudieron definirse en el diagrama de puntos FSC-A frente a SSC-A debido a la presencia de muchas células y restos de mielina ( Figura 3H ). De nota, el tratamiento de permeabilización induce una encogimiento celular y por lo tanto las subpoblaciones de macrófagos parecían smAller en el FSC frente a SSC punto trama ( Figura 3I , J ) como se describe anteriormente [ 24] . La viabilidad de las células se determinó usando el kit de tinción de células muertas fijable. Después del gradiente de densidad, el 85-95% de las células están vivas ( Figura 3K ). Las poblaciones de microglia y MDM pueden ser definidas por los marcadores CD45 y CD11b en una parcela de puntos después del aislamiento del cerebro y de las células de la médula espinal en una sola muestra ( Figura 3L ), y también del cerebro o médula espinal solos ( Figura 3M , 3N ).
Para el marcaje por citometría de flujo, es importante saber si la proteína y / o el epítopo reconocidos por el anticuerpo son intra o extracelulares. En el caso de los antígenos intracelulares, se requiere un tampón de permeabilización. Tmem119 es una proteína transmembrana pero el epítopo reconocidoPor el anticuerpo manchas como intracelular [ 19] . En ausencia de permeabilización de las células, no hubo etiquetado ( Figura 3O ). La ausencia de este paso de permeabilización podría conducir a resultados negativos falsos. Dado que el anticuerpo Tmem119 no está directamente conjugado con un fluoróforo, las células se marcaron con un anticuerpo secundario; El control negativo era anticuerpo secundario solo (línea negra) ( Figura 3E , 3O-3R ). Cuando se usan anticuerpos conjugados directamente, hay dos estrategias principales para evaluar el etiquetado específico: anticuerpos de isotipo como control negativo o controles de Fluorescence Minus One (FMO). Los controles de FMO contienen todos los anticuerpos marcadores en la mezcla excepto el anticuerpo de control para esa muestra. Por lo tanto, un control FMO es necesario para cada marcador, mientras que sólo una mezcla de etiquetado es necesaria para el control de anticuerpos isotipo, por muestra. Para el etiquetado de las células del cerebro inmune, elegimos el isotYpe, ya que se obtiene un número limitado de células (400.000 células) después del gradiente de densidad de un cerebro de ratón.
Figura 1: Pasos del Procedimiento de Disociación de Células. ( A ) El tejido se colocó en un tubo con enzimas de cóctel de digestión. ( B ) El tejido se cortó finamente en trozos pequeños con tijeras. ( C ) Se incubaron los trozos pequeños de tejido durante 30 minutos (37ºC) para una digestión tisular eficaz. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Esquema del gradiente de densidad después de CenPaso de trifugación. Después de la centrifugación, la mielina está presente en la parte superior del gradiente de densidad y las células inmunes que contienen poblaciones de macrófagos se encuentran en la interfase entre las capas de gradiente de densidad del 37% y el 70%. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Análisis de citometría de flujo representativo de macrófagos. Se aplicó una estrategia de bloqueo lógico: ( A ) La discriminación de doblete se refiere a la trama de puntos FSC-A frente a FSC-H. ( B ) La estrategia de bloqueo morfológico se refiere a la trama de puntos FSC-A frente a SSC-A. ( C ) Las subpoblaciones de macrófagos se refieren al diagrama de puntos CD45 frente a CD11b. ( D ) El gráfico de puntos de las células staCon anticuerpos de isotipo como control para la tinción de CD45 y CD11b. El análisis de los marcadores expresados por estas dos subpoblaciones de macrófagos: Tmem119 ( E ), CX3CR1 ( F ) y CCR2 ( G ) (10.000 eventos en la puerta P2 fueron adquiridos). Los diagramas de puntos que muestran el tamaño de la célula (FSC-A) y granularidad (SSC-A) de las células del cerebro y de la médula espinal antes del gradiente de densidad ( H ) o después del aislamiento del gradiente de densidad y con el tratamiento permeabilizante ( I ) . ( K ) El histograma de citometría de flujo ilustra el porcentaje de células muertas después del gradiente de densidad. Las puertas mostradas en las gráficas de puntos ilustran la población de microglia CD11b + CD45 med y la población MDM CD11b + CD45 alta en el cerebro y la médula espinal ( L ) o en el cerebro ( M ) o la médula espinal ( N ) por separado. El análisis de Tmem119 expresadoPor las subpoblaciones de macrófagos en el cerebro y las células de la médula espinal permeabilizadas ( O ) o no permeabilizadas ( P ), y en el cerebro ( Q ) o las células permeabilizadas de la médula espinal ( R ). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Volumen para 1 tubo (mL) | Medio de gradiente de densidad 1x | PBS 10x | PBS 1x |
| Densidad gradiente medio 30% | 1,5 | 0,15 | 3,35 |
| Densidad gradiente medio 37% | 1,85 | 0,185 | 2.965 |
| Densidad gradiente medio 70% | 3,5 | 0,35 | 1,15 |
Tabla 1: Composición de los diferentes porcentajes del medio de gradiente de densidad.
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Discussion
Se ha demostrado que la microglia y el MDM tienen funciones y fenotipos diferentes en el SNC, por lo que la identificación y el análisis de estas subpoblaciones de macrófagos son esenciales para comprender mejor las enfermedades neurológicas 9 , 18 , 25 . El análisis de citometría de flujo utilizando dos marcadores (CD11b y CD45) permite distinguir entre cada subpoblación ( Figura 3C ). Esta estrategia se validó previamente mediante el uso de otros marcadores específicos, como CCR2 para el MDM y CX3CR1 para la microglia, y un enfoque recientemente desarrollado con un anticuerpo de Tmem119 ( Figura 3E - 3G ). Realizamos experimentos con CCR2 y CX3CR1 anticuerpos ( Figura 3F , 3G ) como hemos publicado anteriormente [ 18] . El CD11b + CD45Med población altamente expresado Tmem119 y CX3CR1 pero no CCR2 en contraste con el CD11b + CD45 población alta . La alta población CD11b + CD45 se compone de varias subpoblaciones con o sin expresión de CCR2. La identificación y caracterización de estas subpoblaciones de macrófagos (macrófagos perivasculares, macrófagos infiltrantes, etc. ) son un área extensa de investigación. Además, los marcadores para estas poblaciones pueden cambiar dependiendo de los procesos patológicos. De hecho, CCR2 es down-regulado cuando los monocitos cruzan la barrera hematoencefálica [ 26] .
Los anticuerpos CD45 y CD11b reconocen los antígenos de superficie celular, por lo que el tratamiento de permeabilización es innecesario. Por lo tanto, esta técnica también podría utilizarse para purificar cada subpoblación de macrófagos por clasificación celular para el análisis de ARNm u otros ensayos funcionales. Es de notar que el uso de la enzima y densidad gradPuede inducir, en cierta medida, la activación de microglia. Hemos observado previamente que después del aislamiento, la microglia y los macrófagos expresan la óxido nítrico sintasa inducible (iNOS). Sin embargo, el aumento del nivel de expresión iNOS observado en el patológico frente a la condición normal puede ser destacado con este método [ 18] . Además, esta técnica logra una población celular bien separada (singlets) con una alta proporción de células vivas.
Para la replicación exitosa de este protocolo, hay varios parámetros críticos. La configuración del gradiente es más crítica. Nuestra experiencia indica que la preparación de los gradientes en tubos de 15 mL frente a los de 50 mL consigue mejores separaciones. Si no se observan células en la interfaz 70-37%, debe considerarse la cantidad de tejido CNS utilizado para el aislamiento celular. Generalmente recolectamos ~ 400.000 células de un cerebro de ratón. Aunque este rendimiento fluctúa de varias condiciones experimentalesS, una para una mejor visualización de la interfaz 70-37% es hacer que la capa de gradiente de densidad al 37% con PBS y rojo de fenol.
Con la ayuda de diferentes láseres y filtros en el citómetro de flujo, este protocolo puede cuantificar varios marcadores expresados por cada una de las subpoblaciones de macrófagos [ 18] . Esta técnica también es útil para evaluar la participación de otras células inmunitarias tales como células T y células B en la misma muestra. De hecho, las técnicas que utilizan el enriquecimiento inmunomagnético sólo permiten el estudio de las poblaciones previamente seleccionadas [ 21] .
En general, esta técnica constituye una herramienta útil para caracterizar las diferentes subpoblaciones de macrófagos en modelos murinos de enfermedades neurológicas. Esta alternativa única puede evaluar los efectos del tratamiento sobre los procesos inflamatorios en condiciones patológicas.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por subvenciones de la Agencia Nacional para la Investigación (ANR-12-MALZ-0003-02-P2X7RAD), Association France Alzheimer y Bpifrance. Nuestro laboratorio cuenta también con el apoyo del Inserm, el CNRS, la Universidad Pierre et Marie-Curie y el programa "Investissements d'avenir" ANR-10-IAIHU-06 (IHU-A-ICM). Quisiéramos agradecer la ayuda del centro de cultivo celular CELIS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5 month-old Mice | Janvier | C57BL/6J | |
| Liberase TL Research Grade | Sigma-Aldrich | 5401020001 | Digestion enzyme |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | DN25 | |
| Percoll | GE Healthcare Life Sciences | 17-0891-01 | Density gradient medium |
| Cell Strainer size 70 µm Nylon | Corning | 731751 | |
| Venofix 25 G | BRAUN | 4056370 | |
| Piston syringe 10 mL | Terumo | SS+10ES1 | |
| Pasteur pipette 230 mm | Dustcher | 20420 | |
| 1.5 mL tube | Eppendorf | 0030 123.328 | |
| 15 mL tube | TPP | 91015 | |
| 50 mL tube | TPP | 91050 | |
| 5 mL polystyrene round bottom tube | BD Falcon | 352054 | |
| D-PBS (1x) without Ca2+/Mg2+ | Thermo Fisher Scientific | 14190-094 | |
| D-PBS (10x) without Ca2+/Mg2+ | Thermo Fisher Scientific | 14200-067 | |
| Fetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | 10270-106 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E4884 | |
| Bovine Serum Albumin solution 30% | Sigma-Aldrich | A7284 | |
| Paraformaldehyde 32% Solution | Electron Microscopy Sciences | 15714-S | Caution -Toxic |
| Saponin | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| Sodium Azide | Sigma-Aldrich | 47036 | |
| PerCPCy5.5 Rat anti-mouse CD11b (clone M1/70) | eBioscience | 45-0112 | |
| Rat IgG2b K Isotype Control PerCP-Cyanine5.5 | eBioscience | 45-4031 | |
| BV421 Rat anti-mouse CD45 (clone 30-F11) | BD Biosciences | 563890 | |
| BV421 Rat IgG2b, κ Isotype Control RUO | BD Biosciences | 562603 | |
| Rabbit anti-mouse TMEM119 (clone28 - 3) | Abcam | ab209064 | |
| AlexaFluor 647 Donkey anti-rabbit IgG | Life Technologies | A31573 | |
| Anti-Mouse CD16/CD32 Purified | eBioscience | 14-0161 | Mouse Fc Block |
| Fixable Dead Cell Stain Kits | Invitrogen | L34969 | |
| Mouse CCR2 APC-conjugated Antibody | R&D | FAB5538A | |
| Rat IgG2B APC-conjugated Isotype Control | R&D | IC013A | |
| Mouse CX3CR1 PE-conjugated Antibody | R&D | FAB5825P | |
| Goat IgG PE-conjugated Antibody | R&D | IC108P | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5804R | |
| Cell analyzer | BD Biosciences | BD FACSVERSE | |
| Data Analysis Software | FlowJo LLC | FlowJo | |
| Fine scissors | F.S.T | 14090-11 | |
| Standard Pattern Forceps | F.S.T | 11000-13 | |
| Mayo Scissors | F.S.T | 14010-15 | |
| Dumont #5 Forceps | F.S.T | 11251-20 |
References
- Ginhoux, F., et al. Fate mapping analysis reveals that adult microglia derive from primitive macrophages. Science. 330 (6005), 841-845 (2010).
- Ginhoux, F., Lim, S., Hoeffel, G., Low, D., Huber, T. Origin and differentiation of microglia. Front Cell Neurosci. 7, 45 (2013).
- Ginhoux, F., Jung, S. Monocytes and macrophages: developmental pathways and tissue homeostasis. Nat Rev Immunol. 14 (6), 392-404 (2014).
- Schulz, C., et al. A lineage of myeloid cells independent of Myb and hematopoietic stem cells. Science. 336 (6077), 86-90 (2012).
- London, A., Cohen, M., Schwartz, M. Microglia and monocyte-derived macrophages: functionally distinct populations that act in concert in CNS plasticity and repair. Front Cell Neurosci. 7, 34 (2013).
- Miron, V. E., Franklin, R. J. Macrophages and CNS remyelination. J Neurochem. 130 (2), 165-171 (2014).
- Mildner, A., et al. Distinct and non-redundant roles of microglia and myeloid subsets in mouse models of Alzheimer's disease. J Neurosci. 31 (31), 11159-11171 (2011).
- Boillee, S., et al. Onset and progression in inherited ALS determined by motor neurons and microglia. Science. 312 (5778), 1389-1392 (2006).
- Yamasaki, R., et al. Differential roles of microglia and monocytes in the inflamed central nervous system. J Exp Med. 211 (8), 1533-1549 (2014).
- Wu, D. C., et al. Blockade of microglial activation is neuroprotective in the 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine mouse model of Parkinson disease. J Neurosci. 22 (5), 1763-1771 (2002).
- Cartier, N., Lewis, C. A., Zhang, R., Rossi, F. M. The role of microglia in human disease: therapeutic tool or target? Acta Neuropathol. 128 (3), 363-380 (2014).
- Ajami, B., Bennett, J. L., Krieger, C., McNagny, K. M., Rossi, F. M. Infiltrating monocytes trigger EAE progression, but do not contribute to the resident microglia pool. Nat Neurosci. 14 (9), 1142-1149 (2011).
- Funk, N., et al. Characterization of peripheral hematopoietic stem cells and monocytes in Parkinson's disease. Mov Disord. 28 (3), 392-395 (2013).
- Butovsky, O., et al. Modulating inflammatory monocytes with a unique microRNA gene signature ameliorates murine ALS. J Clin Invest. 122 (9), 3063-3087 (2012).
- Lewis, C. A., Solomon, J. N., Rossi, F. M., Krieger, C. Bone marrow-derived cells in the central nervous system of a mouse model of amyotrophic lateral sclerosis are associated with blood vessels and express CX(3)CR1. Glia. 57 (13), 1410-1419 (2009).
- Sedgwick, J. D., et al. Isolation and direct characterization of resident microglial cells from the normal and inflamed central nervous system. Proc Natl Acad Sci U S A. 88 (16), 7438-7442 (1991).
- Ford, A. L., Goodsall, A. L., Hickey, W. F., Sedgwick, J. D. Normal adult ramified microglia separated from other central nervous system macrophages by flow cytometric sorting. Phenotypic differences defined and direct ex vivo antigen presentation to myelin basic protein-reactive CD4+ T cells compared. J Immunol. 154 (9), 4309-4321 (1995).
- Martin, E., Boucher, C., Fontaine, B., Delarasse, C. Distinct inflammatory phenotypes of microglia and monocyte-derived macrophages in Alzheimer's disease models: effects of aging and amyloid pathology. Aging Cell. , (2016).
- Bennett, M. L., et al. New tools for studying microglia in the mouse and human CNS. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (12), E1738-E1746 (2016).
- Jin, L. W., et al. Dysregulation of glutamine transporter SNAT1 in Rett syndrome microglia: a mechanism for mitochondrial dysfunction and neurotoxicity. J Neurosci. 35 (6), 2516-2529 (2015).
- Bedi, S. S., Smith, P., Hetz, R. A., Xue, H., Cox, C. S. Immunomagnetic enrichment and flow cytometric characterization of mouse microglia. J Neurosci Methods. 219 (1), 176-182 (2013).
- Nikodemova, M., Watters, J. J. Efficient isolation of live microglia with preserved phenotypes from adult mouse brain. J Neuroinflammation. 9, 147 (2012).
- Mizutani, M., et al. The fractalkine receptor but not CCR2 is present on microglia from embryonic development throughout adulthood. J Immunol. 188 (1), 29-36 (2012).
- Lecoeur, H., Ledru, E., Gougeon, M. L. A cytofluorometric method for the simultaneous detection of both intracellular and surface antigens of apoptotic peripheral lymphocytes. J Immunol Methods. 217 (1-2), 11-26 (1998).
- Richter, N., et al. Glioma-associated microglia and macrophages/monocytes display distinct electrophysiological properties and do not communicate via gap junctions. Neurosci Lett. 583, 130-135 (2014).
- Mahad, D., et al. Modulating CCR2 and CCL2 at the blood-brain barrier: relevance for multiple sclerosis pathogenesis. Brain. 129 (Pt 1), 212-223 (2006).
