Summary

تحليل الخلايا الدبقية الصغيرة والبلاعم المستمدة من الخلايا العصبية من الجهاز العصبي المركزي عن طريق التدفق الخلوي

Published: June 22, 2017
doi:

Summary

يوفر هذا البروتوكول تحليلا للقطاعات السكانية البلاعم في الماوس الكبار الجهاز العصبي المركزي عن طريق التدفق الخلوي ومفيد لدراسة علامات متعددة التي أعربت عنها هذه الخلايا.

Abstract

وقد أظهرت دراسات عديدة دور الخلايا المناعية، وخاصة الضامة، في الجهاز العصبي المركزي (نس) الأمراض. هناك نوعان من البلاعم الرئيسية في الجهاز العصبي المركزي: (1) الخلايا الدبقية الصغيرة، والتي هي الضامة المقيمين من الجهاز العصبي المركزي وتستمد من أسلاف الكيس المحي خلال التطور الجنيني، و (2) الضامة المستمدة الوحيدات (مدم)، والتي يمكن أن تتسلل الجهاز العصبي المركزي أثناء المرض وتستمد من الأسلاف نخاع العظم. الأدوار من كل فرعية بلاعم تختلف اعتمادا على علم الأمراض التي تجري دراستها. وعلاوة على ذلك، لا يوجد توافق في الآراء حول علامات النسيجية أو المعايير المميزة المستخدمة لهذه المجموعات السكانية البلاعم. ومع ذلك، فإن تحليل ملامح التعبير من علامات CD11b و CD45 عن طريق التدفق الخلوي يسمح لنا لتمييز الخلايا الدبقية الصغيرة (CD11b + CD45 ميد ) من مدم (CD11b + CD45 عالية ). في هذا البروتوكول، وتبين لنا أن كثافة الطرد المركزي التدرجوتحليل التدفق الخلوي يمكن استخدامها لتوصيف هذه المجموعات السكانية الفرعية البلاعم نس، ودراسة عدة علامات من الفائدة التي أعربت عنها هذه الخلايا كما نشرنا مؤخرا. وهكذا، فإن هذه التقنية يمكن أن تزيد فهمنا لدور الضامة في نماذج الماوس من الأمراض العصبية ويمكن أيضا أن تستخدم لتقييم آثار المخدرات على هذه الخلايا.

Introduction

الخلايا الدبقية الصغيرة هي الضامة المنسوجة الأنسجة المتضخم من الجهاز العصبي المركزي (نس). أنها تلعب دورين وظيفيين رئيسيين: الدفاع المناعي وصيانة التوازن الجهاز العصبي المركزي. على النقيض من مدم، التي تجدد باستمرار من الخلايا الجذعية المكونة للدم في نخاع العظام، والخلايا ميكروغليال التفريق بين الخلايا البدائية المكونة للدم السلف التي تنشأ في كيس المحي (يس) التي استعمرت الدماغ خلال التطور الجنيني 1 ، 2 ، 3 . في القوارض، عامل النسخ ميب يلعب دورا حاسما في تطوير جميع الخلايا النخاعية المستمدة من العظام والضامة، ولكن ل يس المستمدة الدبقية الصغيرة، وهذا العامل هو الاستغناء عن والتمايز يبقى يعتمد على عامل النسخ PU.1 4 .

في الجهاز العصبي المركزي صحية، الدبقية الصغيرة هي خلايا ديناميكية التي باستمرار عينة بيئتهم، سكانينغ والمسح لغزو مسببات الأمراض أو تلف الأنسجة 5 . الكشف عن مثل هذه الإشارات يبدأ مسار لحل الاصابة. تتحول الخلايا الدبقية الصغيرة بسرعة من التشكل التشعب إلى واحد أموبويد، الذي يتبعه البلعمة وإطلاق سراح مختلف الوسطاء، مثل السيتوكينات الموالية أو المضادة للالتهابات. وهكذا، اعتمادا على المكروية الخاصة بهم، يمكن أن الدبقية الصغيرة تنشيطها الحصول على مجموعة من الدول فتيلة متميزة 6 .

الدبقية الصغيرة تؤثر تأثيرا عميقا على تطور وتقدم العديد من الاضطرابات العصبية. في نماذج القوارض من مرض الزهايمر (أد) 7 ، التصلب الجانبي الضموري (ألس) 8 ، التصلب المتعدد (مس) 9 أو مرض باركنسون (بد) 10 ، وتظهر الدبقية الصغيرة للعب دور مزدوج، إما إحداث العصبية الضارة أو التمثيل في طريقة اعصاب، والتي تعتمد سن مرض معين، ومرحلة المرض، وعما إذا كان هذا المرض يتأثر مقصورة المناعة المناعية 7 ، 8 ، 9 ، 10 ، 11 . معظم الآفات الجهاز العصبي المركزي لوحظ في الأمراض المذكورة أعلاه تحتوي على السكان غير متجانسة من خلايا الدم النخاعي، بما في ذلك ليس فقط الدبقية الصغيرة متني، ولكن أيضا الضامة المحيطة بالأوعية والسحايا، وكذلك نس-ترشح مدم. هذه الأنواع من الخلايا قد تساهم بشكل تفاضلي في الآليات الفيزيولوجية المرضية المتعلقة إصابة وإصلاح 7 ، 12 ، 13 ، 14 ، 15 . التحدي الحالي للمحققين الذين يدرسون هذه النماذج المرض هو تحديد ما إذا كانت أحيدات الطرفية والضامة التسلل في الجهاز العصبي المركزي وإذا كان الأمر كذلك، إلى ديستإنغويش الخلايا الدبقية الصغيرة المقيمين من هذه الخلايا. في الواقع، خلايا ميكروغليال هي البلاستيك جدا. عندما يتم تنشيطها، الخلايا الدبقية الصغيرة إعادة التعبير عن علامات التي يتم التعبير عنها عادة من قبل وحيدات الطرفية والضامة. وبالتالي، فإن المسألة تعتمد على تحديد علامات التي يمكن أن تميز الخلايا الدبقية الصغيرة المقيمين من حيدات تسلل والضامة.

التمييز بين هؤلاء السكان على شرائح الدماغ عن طريق التطبيقات المناعية محدودة بسبب عدم وجود الأجسام المضادة المحددة. ومع ذلك، وتحليل التدفق الخلوي هو تقنية فعالة لتقييم التعبير عن عدة علامات والتمييز بين السكان الخلية (على سبيل المثال، الخلايا الليمفاوية، الضامة / مدم CD11b + CD45 عالية ، والدبقية الصغيرة CD11b + CD45 ميد )، فضلا عن المجموعات السكانية الفرعية 16 ، 17 ، 18 . يصف هذا البروتوكول إجراءات لعزلخلايا وحيدات النوى من الجهاز العصبي المركزي الماوس في نماذج الأمراض العصبية باستخدام الأمثل، والتفكك الأنسجة الأنزيمية والطرد المركزي التدرج الكثافة. وكذلك، وسيلة للتمييز بين الخلايا الدبقية الصغيرة و مدم في الجهاز العصبي المركزي باستخدام التدفق الخلوي.

نهج آخر هو القضاء على المايلين وتنقية الخلايا باستخدام الخرز المغناطيسي مترافق لأجسام مضادة محددة 19 ، 20 ، 21 . إزالة الميلين باستخدام المضادة للمايلين الخرز المغناطيسي هو أكثر تكلفة ويؤثر على بقاء وعائد الخلايا المعزولة 22 . هذه الخطوة والفصل إمونوماغنيتيك التالية من الخلايا الدبقية الصغيرة، والحد من دراسات أخرى من السكان الخلايا المناعية محددة 21،22.

هذه الإجراءات توفر وسيلة سهلة لدراسة المجموعات السكانية الفرعية البلاعم في تطور المرض، ولتحديد آثار المخدرات أو التعديلات الجينات على الظواهر البلاعم والدول التنشيط.

Protocol

وقد تمت الموافقة على جميع الطرق الموصوفة هنا من قبل اللجنة المؤسسية رعاية الحيوان واستخدامها في معهد إيسم ولجنة داروين الأخلاقية الفرنسية الحيوان، وتغطي بموجب البروتوكول 01407.02. 1. إعداد <li style=";text-align:right;dir…

Representative Results

بعد كثافة الطرد المركزي التدرج وتلطيخ الأجسام المضادة، تم الحصول على الخلايا على مقياس التدفق الخلوي وتحليلها باستخدام استراتيجية الصرف المورفولوجية على النحو التالي. تم تعريف البوابة الأولى في مؤامرة نقطة إلى الأمام متناثرة منطقة (فسك-A) مقابل<…

Discussion

وقد ثبت أن الخلايا الدبقية الصغيرة و مدم لها وظائف مختلفة والمظاهر الظاهرية في الجهاز العصبي المركزي، وبالتالي تحديد وتحليل هذه المجموعات السكانية البلاعم ضرورية من أجل فهم أفضل الأمراض العصبية 9 ، 18 ، 25 . تحليل الت?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من الوكالة الوطنية للبحث العلمي (أنر-12-مالز-0003-02-P2X7RAD)، ورابطة فرنسا الزهايمر وببيفرانس. ويدعم مختبرنا أيضا من قبل إنسيرم، نرس، جامعة بيير وماري كوري وبرنامج "إنفستسيمنتس أفينير" أنر-10-إايهو-06 (إيهو-A-إيسم). نود أن نشكر المساعدة من مرفق سيليس ثقافة الخلية الأساسية.

Materials

5-month-old Mice Janvier C57BL/6J
Liberase TL Research Grade Sigma-Aldrich 5401020001 Digestion enzyme
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas Sigma-Aldrich DN25
Percoll GE Healthcare Life Sciences 17-0891-01  Density gradient medium
Cell Strainer size 70 µm Nylon Corning 731751
Venofix 25G BRAUN 4056370
Piston syringe 10 mL Terumo SS+10ES1
Pasteur pipette 230 mm Dustcher 20420
1,5 mL  tube Eppendorf 0030 123.328
15 mL  tube TPP 91015
50 mL  tube TPP 91050
5 mL polystyrene round bottom tube BD Falcon 352054
D-PBS (1X) without Ca2+/Mg2+ Thermo Fisher Scientific 14190-094
D-PBS (10X) without Ca2+/Mg2+ Thermo Fisher Scientific 14200-067
Fetal bovine serum Thermo Fisher Scientific 10270-106
EDTA Sigma-Aldrich E4884
Bovine Serum Albumin solution 30% Sigma-Aldrich A7284
Paraformaldehyde 32% Solution Electron Microscopy Sciences 15714-S Caution -Toxic
Saponin Sigma-Aldrich S2002
Sodium Azide Sigma-Aldrich 47036
PerCPCy5.5 Rat anti-mouse CD11b (clone M1/70) eBioscience 45-0112
Rat IgG2b K Isotype Control PerCP-Cyanine5.5 eBioscience 45-4031 
BV421 Rat anti-mouse CD45 (clone 30-F11) BD Biosciences 563890
BV421 Rat IgG2b, κ Isotype Control RUO BD Biosciences 562603
Rabbit anti-mouse TMEM119 (clone28-3) Abcam ab209064
AlexaFluor 647 Donkey anti-rabbit IgG Life Technologies A31573
Anti-Mouse CD16/CD32 Purified eBioscience 14-0161 Mouse Fc Block
Fixable Dead Cell Stain Kits Invitrogen L34969
Mouse CCR2 APC-conjugated Antibody R&D FAB5538A
Rat IgG2B APC-conjugated Isotype Control R&D IC013A
Mouse CX3CR1 PE-conjugated Antibody R&D FAB5825P
Goat IgG PE-conjugated Antibody R&D IC108P
Centrifuge Eppendorf 5804R
Cell analyzer BD Biosciences BD FACSVERSE
Data Analysis Software FlowJo LLC FlowJo
Fine scissors F.S.T 14090-11
Standard Pattern Forceps F.S.T 11000-13
Mayo Scissors F.S.T 14010-15
Dumont #5 Forceps F.S.T 11251-20

References

  1. Ginhoux, F., et al. Fate mapping analysis reveals that adult microglia derive from primitive macrophages. Science. 330 (6005), 841-845 (2010).
  2. Ginhoux, F., Lim, S., Hoeffel, G., Low, D., Huber, T. Origin and differentiation of microglia. Front Cell Neurosci. 7, 45 (2013).
  3. Ginhoux, F., Jung, S. Monocytes and macrophages: developmental pathways and tissue homeostasis. Nat Rev Immunol. 14 (6), 392-404 (2014).
  4. Schulz, C., et al. A lineage of myeloid cells independent of Myb and hematopoietic stem cells. Science. 336 (6077), 86-90 (2012).
  5. London, A., Cohen, M., Schwartz, M. Microglia and monocyte-derived macrophages: functionally distinct populations that act in concert in CNS plasticity and repair. Front Cell Neurosci. 7, 34 (2013).
  6. Miron, V. E., Franklin, R. J. Macrophages and CNS remyelination. J Neurochem. 130 (2), 165-171 (2014).
  7. Mildner, A., et al. Distinct and non-redundant roles of microglia and myeloid subsets in mouse models of Alzheimer’s disease. J Neurosci. 31 (31), 11159-11171 (2011).
  8. Boillee, S., et al. Onset and progression in inherited ALS determined by motor neurons and microglia. Science. 312 (5778), 1389-1392 (2006).
  9. Yamasaki, R., et al. Differential roles of microglia and monocytes in the inflamed central nervous system. J Exp Med. 211 (8), 1533-1549 (2014).
  10. Wu, D. C., et al. Blockade of microglial activation is neuroprotective in the 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine mouse model of Parkinson disease. J Neurosci. 22 (5), 1763-1771 (2002).
  11. Cartier, N., Lewis, C. A., Zhang, R., Rossi, F. M. The role of microglia in human disease: therapeutic tool or target?. Acta Neuropathol. 128 (3), 363-380 (2014).
  12. Ajami, B., Bennett, J. L., Krieger, C., McNagny, K. M., Rossi, F. M. Infiltrating monocytes trigger EAE progression, but do not contribute to the resident microglia pool. Nat Neurosci. 14 (9), 1142-1149 (2011).
  13. Funk, N., et al. Characterization of peripheral hematopoietic stem cells and monocytes in Parkinson’s disease. Mov Disord. 28 (3), 392-395 (2013).
  14. Butovsky, O., et al. Modulating inflammatory monocytes with a unique microRNA gene signature ameliorates murine ALS. J Clin Invest. 122 (9), 3063-3087 (2012).
  15. Lewis, C. A., Solomon, J. N., Rossi, F. M., Krieger, C. Bone marrow-derived cells in the central nervous system of a mouse model of amyotrophic lateral sclerosis are associated with blood vessels and express CX(3)CR1. Glia. 57 (13), 1410-1419 (2009).
  16. Sedgwick, J. D., et al. Isolation and direct characterization of resident microglial cells from the normal and inflamed central nervous system. Proc Natl Acad Sci U S A. 88 (16), 7438-7442 (1991).
  17. Ford, A. L., Goodsall, A. L., Hickey, W. F., Sedgwick, J. D. Normal adult ramified microglia separated from other central nervous system macrophages by flow cytometric sorting. Phenotypic differences defined and direct ex vivo antigen presentation to myelin basic protein-reactive CD4+ T cells compared. J Immunol. 154 (9), 4309-4321 (1995).
  18. Martin, E., Boucher, C., Fontaine, B., Delarasse, C. Distinct inflammatory phenotypes of microglia and monocyte-derived macrophages in Alzheimer’s disease models: effects of aging and amyloid pathology. Aging Cell. , (2016).
  19. Bennett, M. L., et al. New tools for studying microglia in the mouse and human CNS. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (12), E1738-E1746 (2016).
  20. Jin, L. W., et al. Dysregulation of glutamine transporter SNAT1 in Rett syndrome microglia: a mechanism for mitochondrial dysfunction and neurotoxicity. J Neurosci. 35 (6), 2516-2529 (2015).
  21. Bedi, S. S., Smith, P., Hetz, R. A., Xue, H., Cox, C. S. Immunomagnetic enrichment and flow cytometric characterization of mouse microglia. J Neurosci Methods. 219 (1), 176-182 (2013).
  22. Nikodemova, M., Watters, J. J. Efficient isolation of live microglia with preserved phenotypes from adult mouse brain. J Neuroinflammation. 9, 147 (2012).
  23. Mizutani, M., et al. The fractalkine receptor but not CCR2 is present on microglia from embryonic development throughout adulthood. J Immunol. 188 (1), 29-36 (2012).
  24. Lecoeur, H., Ledru, E., Gougeon, M. L. A cytofluorometric method for the simultaneous detection of both intracellular and surface antigens of apoptotic peripheral lymphocytes. J Immunol Methods. 217 (1-2), 11-26 (1998).
  25. Richter, N., et al. Glioma-associated microglia and macrophages/monocytes display distinct electrophysiological properties and do not communicate via gap junctions. Neurosci Lett. 583, 130-135 (2014).
  26. Mahad, D., et al. Modulating CCR2 and CCL2 at the blood-brain barrier: relevance for multiple sclerosis pathogenesis. Brain. 129 (Pt 1), 212-223 (2006).

Play Video

Cite This Article
Martin, E., El-Behi, M., Fontaine, B., Delarasse, C. Analysis of Microglia and Monocyte-derived Macrophages from the Central Nervous System by Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (124), e55781, doi:10.3791/55781 (2017).

View Video