Summary

Analyse de la microglie et des macrophages dérivés de monocytes du système nerveux central par cytométrie de flux

Published: June 22, 2017
doi:

Summary

Ce protocole fournit une analyse des sous-populations de macrophages dans le système nerveux central de souris par cytométrie de flux et est utile pour l'étude de marqueurs multiples exprimés par ces cellules.

Abstract

De nombreuses études ont démontré le rôle des cellules immunitaires, en particulier des macrophages, dans les pathologies du système nerveux central (SNC). Il existe deux principales populations de macrophages dans le SNC: (i) la microglie, qui sont les macrophages résidents du SNC et dérivent des progéniteurs du sac vésiculaire pendant l'embryogenèse, et (ii) les macrophages dérivés des monocytes (MDM), qui peuvent infiltrer Le SNC pendant la maladie et sont dérivés de progéniteurs de moelle osseuse. Les rôles de chaque sous-population de macrophages diffèrent en fonction de la pathologie étudiée. En outre, il n'y a pas de consensus sur les marqueurs histologiques ou les critères distinctifs utilisés pour ces sous-populations de macrophages. Cependant, l'analyse des profils d'expression des marqueurs CD11b et CD45 par cytométrie en flux nous permet de distinguer la microglie (CD11b + CD45 med ) du MDM (CD11b + CD45 haute ). Dans ce protocole, nous montrons que la centrifugation à gradient de densitéEt l'analyse par cytométrie de flux peut être utilisée pour caractériser ces sous-populations de macrophages du SNC et pour étudier plusieurs marqueurs d'intérêt exprimés par ces cellules au fur et à mesure de notre publication. Ainsi, cette technique peut favoriser notre compréhension du rôle des macrophages dans les modèles de souris de maladies neurologiques et peut également être utilisée pour évaluer les effets sur ces cellules.

Introduction

Les microglies sont les macrophages résiduels du système nerveux central (SNC) parenchymateux. Ils jouent deux rôles fonctionnels clés: la défense immunitaire et le maintien de l'homéostasie du SNC. Contrairement au MDM, qui sont renouvelés continuellement à partir des cellules souches hématopoïétiques dans la moelle osseuse, les cellules microgliales se différencient des cellules progénitrices hématopoïétiques primitifs provenant du sac vellé (YS) qui ont colonisé le cerveau pendant le développement embryonnaire 1 , 2 , 3 . Chez les rongeurs, le facteur de transcription Myb joue un rôle crucial dans le développement de tous les monocytes et macrophages dérivés de la moelle osseuse, mais pour la microglie dérivée de YS, ce facteur est dispensable et la différenciation reste dépendante du facteur de transcription PU.1 4 .

Dans le SNC sain, les microglies sont des cellules dynamiques qui échantillonnent constamment leur environnement, scaEt l'arpentage pour les agents pathogènes envahissants ou les dommages aux tissus 5 . La détection de ces signaux déclenche une voie pour résoudre la blessure. La microglie passe rapidement d'une morphologie ramifiée à une amiboïde, suivie d'une phagocytose et d'une libération de divers médiateurs, tels que des cytokines pro ou anti-inflammatoires. Ainsi, selon leur microenvironnement, la microglie activée peut acquérir un spectre d'états d'amorçage distincts 6 .

La microglie a un impact profond sur le développement et la progression de nombreux troubles neurologiques. Dans les modèles de rongeurs de la maladie d'Alzheimer (AD) 7 , de la Sclérose latérale amyotrophique (ALS) 8 , de la Sclérose en plaques (MS) 9 ou de la maladie de Parkinson (PD) 10 , la microglie joue un double rôle, induisant une neurotoxicité néfaste ou agissant De manière neuroprotective, qui dépend deN la maladie spécifique, le stade de la maladie et si la maladie a été influencée par le compartiment immunitaire systémique 7 , 8 , 9 , 10 , 11 . La plupart des lésions du SNC observées dans les maladies citées ci-dessus contiennent une population hétérogène de cellules myéloïdes, y compris non seulement la microglie parenchymateuse, mais aussi les macrophages périvasculaires et méningés, ainsi que le MDM infiltrant le SNC. Ces types de cellules peuvent contribuer de manière différentielle aux mécanismes pathophysiologiques liés aux blessures et à la réparation 7 , 12 , 13 , 14 , 15 . Le défi actuel pour les chercheurs qui étudient ces modèles de maladie est d'établir si les monocytes et les macrophages périphériques s'infiltrent dans le SNC et, dans l'affirmative,Astuce la microglie résidante de ces cellules. En effet, les cellules microgliales sont très plastiques; Lorsqu'ils sont activés, les marqueurs de réticine de microglie sont habituellement exprimés par des monocytes périphériques et des macrophages. La question, par conséquent, repose sur l'identification de marqueurs qui peuvent distinguer la microglie résidante des monocytes et des macrophages infiltrants.

La discrimination de ces populations sur les tranches de cerveau par des applications immunohistologiques est limitée en raison du manque d'anticorps spécifiques. Cependant, l'analyse par cytométrie en flux est une technique efficace pour évaluer l'expression de plusieurs marqueurs et pour distinguer les populations cellulaires (par exemple, lymphocytes, macrophages / MDM CD11b + CD45 haute et microglie CD11b + CD45 med ), ainsi que les sous-populations cellulaires 16 , 17 , 18 . Ce protocole décrit les procédures pour isoler lesDes cellules mononucléaires du SNC de souris dans des modèles de maladies neurologiques en utilisant une dissociation de tissu enzymatique optimisée et une centrifugation en gradient de densité; Ainsi qu'une méthode pour différencier les populations de microglie et MDM dans le SNC en utilisant la cytométrie en flux.

Une autre approche est d'éliminer la myéline et de purifier les cellules en utilisant des billes magnétiques conjuguées à des anticorps spécifiques 19 , 20 , 21 . L'élimination de la myéline à l'aide de perles magnétiques anti-myéline est plus coûteuse et affecte la viabilité et le rendement des cellules isolées 22 . Cette étape et la séparation immunomagnétique suivante de la microglie, limitent les études supplémentaires de populations de cellules immunitaires spécifiques 21 , 22 .

Ces procédures fournissent un moyen simple d'étudier les sous-populations de macrophages dans le développement de la maladie, etPour déterminer les effets des médicaments ou les modifications des gènes sur les phénotypes et les états d'activation des macrophages.

Protocol

Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvées par le Comité institutionnel pour les soins et l'utilisation des animaux à l'Institut ICM et par le Comité d'éthique française de Darwin, et sont couverts par le protocole 01407.02. 1. Préparation Préparez le cocktail de digestion dans un tube de 1,5 mL en combinant les suivants pour chaque souris: 1 ml de solution salée tamponnée au phosphate (PBS); 123 μL enzyme de digestion (voir tableau de matériau…

Representative Results

Après la centrifugation en gradient de densité et la coloration d'anticorps, les cellules ont été acquises sur un cytomètre de flux et analysées à l'aide d'une stratégie de fermeture morphologique comme suit. Une première grille a été définie dans la zone de répartition par points (FSC-A) par rapport à la hauteur réversible (FSC-H) pour discriminer les cellules individuelles des doublets ( Figure 3A ). Les cellules individ…

Discussion

Il a été démontré que la microglie et le MDM ont différentes fonctions et phénotypes dans le SNC, et donc l'identification et l'analyse de ces sous-populations de macrophages sont essentielles pour mieux comprendre les maladies neurologiques 9 , 18 , 25 . L'analyse de cytométrie de flux utilisant deux marqueurs (CD11b et CD45) permet la distinction entre chaque sous-population ( Figure 3C…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ce travail a été soutenu par des subventions de l'Agence Nationale pour la Recherche (ANR-12-MALZ-0003-02-P2X7RAD), de l'Association France Alzheimer et de Bpifrance. Notre laboratoire est également soutenu par l'Inserm, le CNRS, l'Université Pierre et Marie-Curie et le programme "Investissements d'avenir" ANR-10-IAIHU-06 (IHU-A-ICM). Nous tenons à remercier l'assistance de l'établissement de base CELIS de la culture cellulaire.

Materials

5-month-old Mice Janvier C57BL/6J
Liberase TL Research Grade Sigma-Aldrich 5401020001 Digestion enzyme
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas Sigma-Aldrich DN25
Percoll GE Healthcare Life Sciences 17-0891-01  Density gradient medium
Cell Strainer size 70 µm Nylon Corning 731751
Venofix 25G BRAUN 4056370
Piston syringe 10 mL Terumo SS+10ES1
Pasteur pipette 230 mm Dustcher 20420
1,5 mL  tube Eppendorf 0030 123.328
15 mL  tube TPP 91015
50 mL  tube TPP 91050
5 mL polystyrene round bottom tube BD Falcon 352054
D-PBS (1X) without Ca2+/Mg2+ Thermo Fisher Scientific 14190-094
D-PBS (10X) without Ca2+/Mg2+ Thermo Fisher Scientific 14200-067
Fetal bovine serum Thermo Fisher Scientific 10270-106
EDTA Sigma-Aldrich E4884
Bovine Serum Albumin solution 30% Sigma-Aldrich A7284
Paraformaldehyde 32% Solution Electron Microscopy Sciences 15714-S Caution -Toxic
Saponin Sigma-Aldrich S2002
Sodium Azide Sigma-Aldrich 47036
PerCPCy5.5 Rat anti-mouse CD11b (clone M1/70) eBioscience 45-0112
Rat IgG2b K Isotype Control PerCP-Cyanine5.5 eBioscience 45-4031 
BV421 Rat anti-mouse CD45 (clone 30-F11) BD Biosciences 563890
BV421 Rat IgG2b, κ Isotype Control RUO BD Biosciences 562603
Rabbit anti-mouse TMEM119 (clone28-3) Abcam ab209064
AlexaFluor 647 Donkey anti-rabbit IgG Life Technologies A31573
Anti-Mouse CD16/CD32 Purified eBioscience 14-0161 Mouse Fc Block
Fixable Dead Cell Stain Kits Invitrogen L34969
Mouse CCR2 APC-conjugated Antibody R&D FAB5538A
Rat IgG2B APC-conjugated Isotype Control R&D IC013A
Mouse CX3CR1 PE-conjugated Antibody R&D FAB5825P
Goat IgG PE-conjugated Antibody R&D IC108P
Centrifuge Eppendorf 5804R
Cell analyzer BD Biosciences BD FACSVERSE
Data Analysis Software FlowJo LLC FlowJo
Fine scissors F.S.T 14090-11
Standard Pattern Forceps F.S.T 11000-13
Mayo Scissors F.S.T 14010-15
Dumont #5 Forceps F.S.T 11251-20

References

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Cite This Article
Martin, E., El-Behi, M., Fontaine, B., Delarasse, C. Analysis of Microglia and Monocyte-derived Macrophages from the Central Nervous System by Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (124), e55781, doi:10.3791/55781 (2017).

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