Summary

Analyse von Mikroglia und Monozyten-abgeleiteten Makrophagen aus dem Zentralnervensystem durch Durchflusszytometrie

Published: June 22, 2017
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Summary

Dieses Protokoll liefert eine Analyse der Makrophagen-Subpopulationen in das erwachsene Maus-Zentralnervensystem durch Durchflusszytometrie und ist hilfreich für die Untersuchung von mehreren Markern, die von diesen Zellen exprimiert werden.

Abstract

Zahlreiche Studien haben gezeigt, die Rolle der Immunzellen, insbesondere Makrophagen, in zentralen Zerversystem (ZNS) Pathologien. Es gibt zwei Hauptmakrophagenpopulationen im ZNS: (i) die Mikroglia, die die residenten Makrophagen des ZNS sind und von Dottersack-Progenitoren während der Embryogenese abgeleitet sind, und (ii) die Monozyten-abgeleiteten Makrophagen (MDM), die infiltrieren können Das ZNS während der Krankheit und werden aus Knochenmark-Vorläufern abgeleitet. Die Rollen jeder Makrophagen-Subpopulation unterscheiden sich je nach der untersuchten Pathologie. Darüber hinaus gibt es keinen Konsens über die histologischen Marker oder die für diese Makrophagen-Subpopulationen verwendeten Unterscheidungskriterien. Die Analyse der Expressionsprofile der CD11b- und CD45-Marker durch Durchflusszytometrie erlaubt es uns jedoch, die Mikroglia (CD11b + CD45 med ) vom MDM (CD11b + CD45 high ) zu unterscheiden. In diesem Protokoll zeigen wir, dass die DichtegradientenzentrifugationUnd die Durchflusszytometrieanalyse kann verwendet werden, um diese ZNS-Makrophagen-Subpopulationen zu charakterisieren und mehrere von diesen Zellen exprimierte Marker zu untersuchen, wie wir vor kurzem veröffentlicht haben. So kann diese Technik unser Verständnis der Rolle von Makrophagen in Mausmodellen von neurologischen Erkrankungen weitergeben und kann auch zur Bewertung von Arzneimittelwirkungen auf diese Zellen verwendet werden.

Introduction

Die Mikroglia sind die parenchymalen Gewebe-residenten Makrophagen des Zentralnervensystems (ZNS). Sie spielen zwei wichtige Funktionsrollen: Immunabwehr und Wartung der ZNS-Homöostase. Im Gegensatz zu den MDM, die kontinuierlich aus den hämatopoetischen Stammzellen im Knochenmark erneuert werden, unterscheiden sich die Mikrogliazellen von primitiven hämatopoetischen Vorläuferzellen aus dem Dottersack (YS), die das Gehirn während der embryonalen Entwicklung 1 , 2 , 3 kolonisierten. Bei Nagetieren spielt der Transkriptionsfaktor Myb eine entscheidende Rolle bei der Entwicklung aller von Knochenmark abgeleiteten Monozyten und Makrophagen, aber für YS-abgeleitete Mikroglia ist dieser Faktor entbehrlich und die Differenzierung bleibt abhängig vom Transkriptionsfaktor PU.1 4 .

Im gesunden ZNS sind Mikroglia dynamische Zellen, die ständig ihre Umgebung abtasten, scaNning und Vermessung zum Eindringen von Krankheitserregern oder Gewebeschäden 5 . Die Erkennung solcher Signale leitet einen Weg ein, um die Verletzung zu lösen. Die Mikroglia wechselt schnell von einer verzweigten Morphologie zu einer amöboiden, die von Phagozytose und Freisetzung verschiedener Mediatoren wie pro- oder entzündungshemmenden Zytokinen gefolgt wird. So kann abhängig von ihrer Mikroumgebung aktivierte Mikroglia ein Spektrum unterschiedlicher Priming-Zustände 6 erwerben.

Die Mikroglia beeinflusst die Entwicklung und den Fortschritt vieler neurologischer Erkrankungen. Bei den Nagetiermodellen der Alzheimer-Krankheit (AD) 7 , der amyotrophischen Lateralsklerose (ALS) 8 , der Multiple Sklerose (MS) 9 oder der Parkinson-Krankheit (PD) 10 wird gezeigt , dass die Mikroglia eine doppelte Rolle spielt, die entweder eine nachteilige Neurotoxizität oder eine wirksame Wirkung hervorruft In einer neuroprotektiven Weise, die abhängig ist oN die spezifische Krankheit, das Krankheitsstadium und ob die Krankheit durch das systemische Immunabteil 7 , 8 , 9 , 10 , 11 beeinflusst wurde . Die meisten der in den oben genannten Krankheiten beobachteten ZNS-Läsionen enthalten eine heterogene Population von myeloiden Zellen, darunter nicht nur parenchymale Mikroglia, sondern auch perivaskuläre und meningeale Makrophagen sowie CNS-infiltrierende MDM. Diese Zelltypen können unterschiedlich zu den pathophysiologischen Mechanismen beitragen, die sich auf Verletzungen und Reparaturen beziehen 7 , 12 , 13 , 14 , 15 . Die gegenwärtige Herausforderung für Forscher, die diese Krankheitsmodelle studieren, besteht darin, festzustellen, ob die peripheren Monozyten und Makrophagen das ZNS infiltrieren und wenn ja, in distLegen Sie die residenten Mikroglia aus diesen Zellen. In der Tat sind die Mikrogliazellen sehr plastisch; Wenn sie aktiviert sind, werden die Mikroglia-Marker, die üblicherweise durch periphere Monozyten und Makrophagen exprimiert werden, erneut exprimieren. Das Problem beruht daher auf der Identifizierung von Markern, die die residenten Mikroglia von den infiltrierenden Monozyten und Makrophagen unterscheiden können.

Die Diskriminierung dieser Populationen auf Gehirnscheiben durch immunhistologische Anwendungen ist aufgrund des Fehlens spezifischer Antikörper begrenzt. Die Durchflusszytometrieanalyse ist jedoch eine effiziente Technik zur Beurteilung der Expression mehrerer Marker und zur Unterscheidung von Zellpopulationen (z. B. Lymphozyten, Makrophagen / MDM CD11b + CD45 hoch und Microglia CD11b + CD45 med ) sowie Zellsubpopulationen 16 , 17 , 18 Dieses Protokoll beschreibt die Verfahren zur Isolierung derMononukleare Zellen aus dem Maus-ZNS in neurologischen Erkrankungsmodellen unter Verwendung einer optimierten, enzymatischen Gewebe-Dissoziation und einer Dichtegradienten-Zentrifugation; Sowie ein Verfahren zur Differenzierung der Mikroglia- und MDM-Populationen im ZNS durch Durchflusszytometrie.

Ein weiterer Ansatz besteht darin, das Myelin zu eliminieren und die Zellen unter Verwendung von magnetischen Perlen zu reinigen, die mit spezifischen Antikörpern 19 , 20 , 21 konjugiert sind. Die Myelinentfernung unter Verwendung von Anti-Myelin-Magnetperlen ist teurer und beeinflusst die Lebensfähigkeit und die Ausbeute an isolierten Zellen 22 . Dieser Schritt und die folgende immunomagnetische Trennung der Mikroglia, beschränken weitere Untersuchungen der spezifischen Immunzellpopulationen 21 , 22 .

Diese Verfahren bieten eine einfache Möglichkeit, die Makrophagen-Subpopulationen in der Krankheitsentwicklung zu untersuchen undUm die Arzneimittelwirkungen oder Genmodifikationen auf Makrophagen-Phänotypen und Aktivierungszuständen zu bestimmen.

Protocol

Alle hier beschriebenen Methoden wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee am ICM Institute und dem Darwin French Ethic Animal Committee genehmigt und sind unter dem Protokoll 01407.02 abgedeckt. 1. Vorbereitung Den Verdauungscocktail in einem 1,5 mL Röhrchen vorbereiten, indem man für jede Maus folgendes kombiniert: 1 ml Phosphatgepufferte Salzlösung (PBS); 123 μl Verdauungsenzym (siehe Materialtabelle) bei 13 wunsch / mL (Stammlösung), Endkonzentration 1,6 wuns…

Representative Results

Nach der Dichtegradientenzentrifugation und Antikörperfärbung wurden die Zellen auf einem Durchflusszytometer gewonnen und unter Verwendung einer morphologischen Gating-Strategie wie folgt analysiert. Ein erstes Tor wurde im Punkt-Forward-Scattered-Area (FSC-A) gegenüber der Forward-Scattered-Height (FSC-H) definiert, um einzelne Zellen aus Dubletten zu unterscheiden ( Abbildung 3A ). Die einzelnen Zellen wurden dann auf FSC-A versus Sid…

Discussion

Es wurde gezeigt, dass die Mikroglia und MDM unterschiedliche Funktionen und Phänotypen im ZNS haben und somit die Identifizierung und die Analyse dieser Makrophagen-Subpopulationen wesentlich sind, um neurologische Erkrankungen besser zu verstehen 9 , 18 , 25 . Durchflusszytometrieanalyse unter Verwendung von zwei Markern (CD11b und CD45) ermöglicht die Unterscheidung zwischen jeder Subpopulation ( Abbil…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde unterstützt durch Zuschüsse von Agence Nationale pour la Recherche (ANR-12-MALZ-0003-02-P2X7RAD), Vereinigung Frankreich Alzheimer und Bpifrance. Unser Labor wird auch von Inserm, CNRS, Université Pierre et Marie-Curie und dem Programm "Investissements d'avenir" ANR-10-IAIHU-06 (IHU-A-ICM) unterstützt. Wir danken der Unterstützung der CELIS Zellkultur.

Materials

5-month-old Mice Janvier C57BL/6J
Liberase TL Research Grade Sigma-Aldrich 5401020001 Digestion enzyme
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas Sigma-Aldrich DN25
Percoll GE Healthcare Life Sciences 17-0891-01  Density gradient medium
Cell Strainer size 70 µm Nylon Corning 731751
Venofix 25G BRAUN 4056370
Piston syringe 10 mL Terumo SS+10ES1
Pasteur pipette 230 mm Dustcher 20420
1,5 mL  tube Eppendorf 0030 123.328
15 mL  tube TPP 91015
50 mL  tube TPP 91050
5 mL polystyrene round bottom tube BD Falcon 352054
D-PBS (1X) without Ca2+/Mg2+ Thermo Fisher Scientific 14190-094
D-PBS (10X) without Ca2+/Mg2+ Thermo Fisher Scientific 14200-067
Fetal bovine serum Thermo Fisher Scientific 10270-106
EDTA Sigma-Aldrich E4884
Bovine Serum Albumin solution 30% Sigma-Aldrich A7284
Paraformaldehyde 32% Solution Electron Microscopy Sciences 15714-S Caution -Toxic
Saponin Sigma-Aldrich S2002
Sodium Azide Sigma-Aldrich 47036
PerCPCy5.5 Rat anti-mouse CD11b (clone M1/70) eBioscience 45-0112
Rat IgG2b K Isotype Control PerCP-Cyanine5.5 eBioscience 45-4031 
BV421 Rat anti-mouse CD45 (clone 30-F11) BD Biosciences 563890
BV421 Rat IgG2b, κ Isotype Control RUO BD Biosciences 562603
Rabbit anti-mouse TMEM119 (clone28-3) Abcam ab209064
AlexaFluor 647 Donkey anti-rabbit IgG Life Technologies A31573
Anti-Mouse CD16/CD32 Purified eBioscience 14-0161 Mouse Fc Block
Fixable Dead Cell Stain Kits Invitrogen L34969
Mouse CCR2 APC-conjugated Antibody R&D FAB5538A
Rat IgG2B APC-conjugated Isotype Control R&D IC013A
Mouse CX3CR1 PE-conjugated Antibody R&D FAB5825P
Goat IgG PE-conjugated Antibody R&D IC108P
Centrifuge Eppendorf 5804R
Cell analyzer BD Biosciences BD FACSVERSE
Data Analysis Software FlowJo LLC FlowJo
Fine scissors F.S.T 14090-11
Standard Pattern Forceps F.S.T 11000-13
Mayo Scissors F.S.T 14010-15
Dumont #5 Forceps F.S.T 11251-20

References

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Martin, E., El-Behi, M., Fontaine, B., Delarasse, C. Analysis of Microglia and Monocyte-derived Macrophages from the Central Nervous System by Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (124), e55781, doi:10.3791/55781 (2017).

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