यह प्रोटोकॉल प्रवाह कोशिका द्वारा वयस्क माउस केंद्रीय तंत्रिका तंत्र में मैक्रोफेज उप-जनसांख्यिकी का एक विश्लेषण प्रदान करता है और इन कोशिकाओं द्वारा व्यक्त किए गए कई मार्करों के अध्ययन के लिए उपयोगी है।
कई अध्ययनों ने केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) विकृतियों में विशेष रूप से मैक्रोफेज में प्रतिरक्षा कोशिकाओं की भूमिका का प्रदर्शन किया है। सीएनएस में दो मुख्य बृहतभक्षककोशिका आबादी हैं: (i) माइक्रोलिया, जो सीएनएस के निवासी मैक्रोफेज हैं और भ्रूणजनन के दौरान जर्दी कोशिकाओं से उत्पन्न होते हैं, और (ii) मोनोसाइट डेरेक्टेड मैक्रोफेज (एमडीएम), जो घुसपैठ कर सकता है बीमारी के दौरान सीएनएस और अस्थि मज्जा प्रजनन से ली गई हैं। प्रत्येक मैक्रोफेज उप-जनसंख्या की भूमिका का अध्ययन किया जा रहा विकृति पर निर्भर करता है। इसके अलावा, हिस्टोलल मार्करों पर कोई आम सहमति नहीं है या इन मैक्रोफेज उप-जनसंख्या के लिए उपयोग किए जाने वाले विशिष्ट मापदंड हैं। हालांकि, फ्लो साइटमैट्री द्वारा सीडी 11 बी और सीडी 45 मार्करों की अभिव्यक्ति प्रोफाइल का विश्लेषण हमें एमडीएम (सीडी 11 बी + सीडी 45 उच्च ) से माइक्रोग्लिया (सीडी 11 बी + सीडी 45 एमडी ) में अंतर करने की अनुमति देता है। इस प्रोटोकॉल में, हम दिखाते हैं कि घनत्व ढाल केन्द्रापरक्षाऔर प्रवाह साइटेमेट्री विश्लेषण का उपयोग इन सीएनएस बृहतभक्षककोशिका उप-पोपों को चिह्नित करने के लिए किया जा सकता है, और हाल ही में प्रकाशित किए गए इन कोशिकाओं द्वारा व्यक्त किए गए ब्याज के कई मार्करों का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है। इस प्रकार, यह तंत्र तंत्रिका संबंधी रोगों के माउस मॉडल में मैक्रोफेज की भूमिका को समझने के लिए और इन कोशिकाओं पर दवा प्रभावों का मूल्यांकन करने के लिए भी इस्तेमाल किया जा सकता है।
माइक्रोलिया केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) के पैरेन्चिमल टिशू-निवासी मैक्रोफेज हैं वे दो प्रमुख कार्यात्मक भूमिकाएं निभाते हैं: सीएनएस होमोस्टैसिस की प्रतिरक्षा रक्षा और रखरखाव। एमडीएम के विपरीत, जो अस्थि मज्जा में हीमेटोपोएटिक स्टेम कोशिकाओं से लगातार नए सिरे हुए होते हैं, माइक्रोग्लियल कोशिकाएं ग्रीक विकास 1 , 2 , 3 के दौरान मस्तिष्क में उपनिवेश करते हुए जर्दी के थैली (वाईएस) में पैदा होने वाले आदिम हेमटोपोएटिक पूर्व कोशिकाओं से अंतर करती हैं। कृन्तकों में, प्रतिलेखन कारक मायब सभी अस्थि मज्जा व्युत्पन्न मोनोसाइट्स और मैक्रोफेज के विकास में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है, लेकिन वाईएस व्युत्पन्न माइक्रोग्लिया के लिए, यह कारक अवयव है और भेदभाव प्रतिलेखन कारक पर निर्भर करता है PU.1 4 ।
स्वस्थ सीएनएस में, माइक्रोलिया गतिशील कोशिकाएं हैं जो लगातार अपने पर्यावरण का नमूना करते हैं, स्कैरोगी या ऊतक क्षति पर हमला करने के लिए एनएनजी और सर्वेक्षण इस तरह के संकेतों का पता लगाने के लिए चोट को हल करने के लिए एक मार्ग की शुरुआत की गई। माइक्रोग्लिया तेजी से एक वर्गीकृत आकारिकी से एक एमोइबियस से स्विच करता है, जिसके बाद फॅगोसिटासिस और विभिन्न मध्यस्थों की रिहाई होती है, जैसे समर्थक या विरोधी भड़काऊ साइटोकिन्स। इस प्रकार, उनके microenvironment, सक्रिय microglia के आधार पर अलग भड़काना राज्यों के एक स्पेक्ट्रम प्राप्त कर सकते हैं 6
माइक्रोग्लिया कई न्यूरोलोलॉजिकल विकारों के विकास और प्रगति पर गहरा प्रभाव डालता है। अल्जाइमर रोग (एडी) 7 , एमीओट्रॉफ़िक पार्श्व स्केलेरोसिस (एएलएस) 8 , मल्टीपल स्केलेरोसिस (एमएस) 9 या पार्किंसंस रोग (पीडी) 10 के कृंतक मॉडल में, माइक्रोग्लिया को दोहरी भूमिका निभाने के लिए दिखाया जाता है, या तो हानिकारक न्यूरोटॉक्सिसिटी या अभिनय एक न्यूरोप्रोटेक्टिव तरीके से, जो कि ओ पर निर्भर हैविशिष्ट बीमारी, बीमारी के चरण, और क्या यह रोग प्रणालीगत प्रतिरक्षा कम्पार्टमेंट 7 , 8 , 9 , 10 , 11 से प्रभावित था। ऊपर बताए गए रोगों में देखा गया सीएनएस घावों में से अधिकांश माइेलॉयड कोशिकाओं की विषम आबादी में शामिल हैं, जिसमें न केवल पैरेन्चिमल माइक्रोग्लिया शामिल है, बल्कि परिधीय और मैनिन्जियल मैक्रोफेज तथा साथ ही सीएनएस-घुसपैठिंग एमडीएम भी शामिल हैं। ये कोशिका प्रकार चोटों और 7 , 12 , 13 , 14 , 15 की मरम्मत के लिए पथोफिज़ियोलोगिक तंत्र में भिन्न रूप से योगदान कर सकते हैं। इन रोग मॉडल का अध्ययन करने वाले जांचकर्ताओं के लिए मौजूदा चुनौती यह है कि क्या परिधीय मोनोसाइट्स और मैक्रोफेज सीएनएस को घुसपैठ करते हैं और यदि ऐसा है, तो क्याइन कोशिकाओं से निवासी माइक्रोग्लिया को समझें वास्तव में, माइक्रोग्लियल कोशिका बहुत ही प्लास्टिक हैं; जब वे सक्रिय हो जाते हैं, तो माइक्रोग्लिया पुनः एक्सप्रेस मार्कर जिन्हें आमतौर पर परिधीय मोनोसाइट्स और मैक्रोफेज द्वारा व्यक्त किया जाता है। इसलिए यह मुद्दा उन मार्करों की पहचान करने पर निर्भर करता है जो घुसपैठ मोनोसाइट्स और मैक्रोफेज से निवासी माइक्रोग्लिया को अलग कर सकते हैं।
प्रतिरक्षाविज्ञानी अनुप्रयोगों द्वारा मस्तिष्क स्लाइस पर इन आबादी का भेदभाव विशिष्ट एंटीबॉडी की कमी के कारण सीमित है। हालांकि, प्रवाह चिन्हित विश्लेषण कई मार्करों की अभिव्यक्ति का मूल्यांकन करने के लिए और सेल आबादी (उदाहरण के लिए, लिम्फोसाइट्स, मैक्रोफेज / एमडीएम सीडी 11 बी + सीडी 45 उच्च , और माइक्रोग्लिया सीडी 11 बी + सीडी 45 एमडी ) के साथ-साथ सेल उप-प्रजातियां 16 , 17 , 18 यह प्रोटोकॉल अलग करने के लिए प्रक्रियाओं का वर्णन करता हैएक अनुकूलित, एंजाइमेटिक ऊतक पृथक्करण और एक घनत्व ढाल centrifugation का उपयोग करके तंत्रिका संबंधी रोग मॉडल में माउस सीएनएस से मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं; साथ ही, फ्लो साइटमैट्री का उपयोग करके सीएनएस में माइक्रोग्लिया और एमडीएम आबादी को अलग करने के लिए एक विधि।
एक और तरीका है माइेलिन को खत्म करने और विशिष्ट एंटीबॉडी 19 , 20 , 21 के लिए संयुग्मित चुंबकीय मोती का उपयोग करके कोशिकाओं को शुद्ध करना। माइेलिन एंटी-मायेलिन चुंबकीय मोती का उपयोग करना अधिक महंगा है और व्यवहार्यता और पृथक कोशिकाओं 22 की उपज को प्रभावित करता है। यह कदम और माइक्रोग्लिया के निम्नलिखित इम्युनोमॅग्नेटिक जुदाई, विशिष्ट प्रतिरक्षा सेल आबादी 21 , 22 के आगे के अध्ययन को सीमित करें।
बीमारी के विकास में मैक्रोफेज उप-जनसंपर्क का अध्ययन करने के लिए ये प्रक्रियाएं एक आसान तरीका प्रदान करती हैं, औरमैक्रोफेज फेनोोटाइप और सक्रियण राज्यों पर दवा प्रभाव या जीन के संशोधन को निर्धारित करने के लिए।
यह दिखाया गया है कि माइक्रोस्ट्रलाय और एमडीएम के सीएनएस में अलग-अलग फ़ंक्शंस और फेनोटाइप हैं, और इस तरह 9 , 18 , 25 को बेहतर तंत्रिका संबंधी रोगों को समझने के लिए इन बृहतभक?…
The authors have nothing to disclose.
यह काम एजेंस नेशनेल डेल ला रेफेर्क (एएनआर -12-मालाज-0003-02-पी 2 एक्स 7 आरएडी), एसोसिएशन फ्रांस अल्झाइमर और बीपीआईएफआरएन्स से अनुदान द्वारा समर्थित था। हमारी प्रयोगशाला भी इंसिरर्म, सीएनआरएस, यूनिवर्सिटी पियरे एट मैरी-क्यूरी और "इन्वेस्टमेंट्स डिसेंसर" एएनआर -10-आईएएचयू -06 (आईएचयू-ए-आईसीएम) द्वारा समर्थित है। हम सीईएलआईएस सेल संस्कृति कोर सुविधा की सहायता से शुक्रिया अदा करना चाहते हैं।
5-month-old Mice | Janvier | C57BL/6J | |
Liberase TL Research Grade | Sigma-Aldrich | 5401020001 | Digestion enzyme |
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | DN25 | |
Percoll | GE Healthcare Life Sciences | 17-0891-01 | Density gradient medium |
Cell Strainer size 70 µm Nylon | Corning | 731751 | |
Venofix 25G | BRAUN | 4056370 | |
Piston syringe 10 mL | Terumo | SS+10ES1 | |
Pasteur pipette 230 mm | Dustcher | 20420 | |
1,5 mL tube | Eppendorf | 0030 123.328 | |
15 mL tube | TPP | 91015 | |
50 mL tube | TPP | 91050 | |
5 mL polystyrene round bottom tube | BD Falcon | 352054 | |
D-PBS (1X) without Ca2+/Mg2+ | Thermo Fisher Scientific | 14190-094 | |
D-PBS (10X) without Ca2+/Mg2+ | Thermo Fisher Scientific | 14200-067 | |
Fetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | 10270-106 | |
EDTA | Sigma-Aldrich | E4884 | |
Bovine Serum Albumin solution 30% | Sigma-Aldrich | A7284 | |
Paraformaldehyde 32% Solution | Electron Microscopy Sciences | 15714-S | Caution -Toxic |
Saponin | Sigma-Aldrich | S2002 | |
Sodium Azide | Sigma-Aldrich | 47036 | |
PerCPCy5.5 Rat anti-mouse CD11b (clone M1/70) | eBioscience | 45-0112 | |
Rat IgG2b K Isotype Control PerCP-Cyanine5.5 | eBioscience | 45-4031 | |
BV421 Rat anti-mouse CD45 (clone 30-F11) | BD Biosciences | 563890 | |
BV421 Rat IgG2b, κ Isotype Control RUO | BD Biosciences | 562603 | |
Rabbit anti-mouse TMEM119 (clone28-3) | Abcam | ab209064 | |
AlexaFluor 647 Donkey anti-rabbit IgG | Life Technologies | A31573 | |
Anti-Mouse CD16/CD32 Purified | eBioscience | 14-0161 | Mouse Fc Block |
Fixable Dead Cell Stain Kits | Invitrogen | L34969 | |
Mouse CCR2 APC-conjugated Antibody | R&D | FAB5538A | |
Rat IgG2B APC-conjugated Isotype Control | R&D | IC013A | |
Mouse CX3CR1 PE-conjugated Antibody | R&D | FAB5825P | |
Goat IgG PE-conjugated Antibody | R&D | IC108P | |
Centrifuge | Eppendorf | 5804R | |
Cell analyzer | BD Biosciences | BD FACSVERSE | |
Data Analysis Software | FlowJo LLC | FlowJo | |
Fine scissors | F.S.T | 14090-11 | |
Standard Pattern Forceps | F.S.T | 11000-13 | |
Mayo Scissors | F.S.T | 14010-15 | |
Dumont #5 Forceps | F.S.T | 11251-20 |