Summary

Analisi dei Macrofagi Microglia e dei Monociti dal Sistema Nervoso Centrale dalla Citometria del Flusso

Published: June 22, 2017
doi:

Summary

Questo protocollo fornisce un'analisi delle subpopulazioni del macrofage nel sistema nervoso centrale del mouse adulto mediante citometria a flusso ed è utile per lo studio di marcatori multipli espressi da queste cellule.

Abstract

Numerosi studi hanno dimostrato il ruolo delle cellule immunitarie, in particolare dei macrofagi, nelle patologie del sistema nervoso centrale (CNS). Esistono due principali popolazioni di macrofagi nel CNS: (i) la microglia, che sono i macrofagi residenti del CNS e sono derivate da progenitori di sacchi di tuorlo durante l'embriogenesi e (ii) i macrofagi derivanti da monociti (MDM), che possono infiltrarsi Il CNS durante la malattia e sono derivate da progenitori del midollo osseo. I ruoli di ciascuna sottopopolazione dei macrofagi variano a seconda della patologia studiata. Inoltre, non esiste un consenso sui marcatori istologici o sui criteri distintivi utilizzati per queste sottopopolazioni macrofagi. Tuttavia, l'analisi dei profili di espressione dei marker CD11b e CD45 mediante citometria a flusso ci consente di distinguere la microglia (CD11b + CD45 med ) dall' MDM (CD11b + CD45 alta ). In questo protocollo mostriamo che la centrifugazione di gradiente di densitàE l'analisi della citometria a flusso può essere utilizzata per caratterizzare queste subpopulazioni del macrofago del CNS e per studiare diversi marcatori di interesse espressi da queste cellule come abbiamo recentemente pubblicato. Così, questa tecnica può ulteriormente comprendere il ruolo dei macrofagi nei modelli di topi di malattie neurologiche e può anche essere usato per valutare gli effetti della droga su queste cellule.

Introduction

La microglia sono i macrofagi del tissue-residuo parenchimale del sistema nervoso centrale (CNS). Essi svolgono due ruoli funzionali chiave: difesa immunitaria e mantenimento dell'omeostasi CNS. In contrasto con l'MDM, che vengono continuamente rinnovate dalle cellule staminali ematopoietiche nel midollo osseo, le cellule microgliali si differenziano dalle cellule progenitrici primitive ematopoietiche originate dal sacco di tuorlo (YS) che colonizzarono il cervello durante lo sviluppo embrionale 1 , 2 , 3 . Nei roditori il fattore di trascrizione Myb svolge un ruolo fondamentale nello sviluppo di tutti i monociti e macrofagi derivanti dal midollo osseo, ma per Yglia microglia, questo fattore è dispensabile e la differenziazione rimane dipendente dal fattore di trascrizione PU.1.

Nel sano CNS, microglia sono cellule dinamiche che continuamente esemplare il loro ambiente, scaNning e indagini per l'invasione di patogeni o danni ai tessuti 5 . La rilevazione di tali segnali inizia un percorso per risolvere il danno. La microglia va rapidamente da una morfologia ramificata a quella amoboide, seguita da fagocitosi e rilascio di vari mediatori, come citochine pro o anti-infiammatorie. Pertanto, a seconda del loro microambiente, la microglia attivata può acquisire uno spettro di stati distinti di preparazione 6 .

La microglia influenza profondamente lo sviluppo e la progressione di molti disturbi neurologici. Nei modelli roditori della malattia di Alzheimer (AD) 7 , della sclerosi laterale amyotrofica (ALS) 8 , della sclerosi multipla (MS) 9 o della malattia di Parkinson (PD) 10 , la microglia dimostra di svolgere un ruolo doppio, o indurre neurotossicità dannosa o agire In modo neuroprotettivo, che è dipendente oN la malattia specifica, la fase della malattia e se la malattia è stata influenzata dal vano immunitario sistemico 7 , 8 , 9 , 10 , 11 . La maggior parte delle lesioni CNS osservate nelle malattie citate sopra contengono una popolazione eterogenea di cellule mieloide, tra cui non solo microglia parenchimale, ma anche macrofagi perivascolari e meningiali, nonché MDM infiltrante CNS. Questi tipi di cellule possono contribuire in modo differenziato ai meccanismi patofisiologici legati alla lesione e alla riparazione 7 , 12 , 13 , 14 , 15 . La sfida attuale per gli investigatori che stanno studiando questi modelli di malattia è stabilire se i monociti e i macrofagi periferici si infiltrano nel CNS e, in caso affermativo, a distInguiare la microglia residente da queste cellule. Infatti, le cellule microgliali sono molto plastiche; Quando sono attivati, i marcatori di re-espressione di microglia che sono solitamente espressi da monociti e macrofagi periferici. La questione si basa pertanto sull'individuazione di marcatori che possono distinguere la microglia residente dai monociti infiammatori e dai macrofagi.

La discriminazione di queste popolazioni sulle fette del cervello mediante applicazioni immunohistologiche è limitata a causa della mancanza di anticorpi specifici. Tuttavia, l'analisi della citometria a flusso è una tecnica efficace per valutare l'espressione di diversi marcatori e per distinguere le popolazioni cellulari (ad esempio, i linfociti, i macrofagi / MDM CD11b + CD45 e microglia CD11b + CD45 med ), così come le sottopopolazioni di cellule 16 , 17 , 18 . Questo protocollo descrive le procedure per l'isolamentoCellule mononucleari del topo CNS nei modelli di malattia neurologica utilizzando una dissociazione tissutale ottimizzata e enzimatica e una centrifugazione di gradiente di densità; Nonché un metodo per differenziare le popolazioni di microglia e MDM nel CNS utilizzando la citometria a flusso.

Un altro approccio è quello di eliminare la mielina e purificare le cellule utilizzando perline magnetiche coniugate a specifici anticorpi 19 , 20 , 21 . La rimozione della mielina usando le perline magnetiche anti-mieline è più costosa e influenza la vitalità e la resa delle cellule isolate 22 . Questo passaggio e la seguente separazione immunomagnetica della microglia, limitano ulteriori studi di popolazioni specifiche delle cellule immunitarie 21 , 22 .

Queste procedure forniscono un modo semplice per studiare le sottopopolazioni dei macrofagi nello sviluppo delle malattie, ePer determinare gli effetti farmacologici o le modificazioni geniche sui fenotipi macrofagi e sugli stati di attivazione.

Protocol

Tutti i metodi qui descritti sono stati approvati dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali presso l'Istituto ICM e dal Comitato per gli animali etnici di Darwin, e sono trattati con il protocollo 01407.02. 1. Preparazione Preparare il cocktail di digestione in un tubo da 1,5 ml combinando le seguenti forme per ogni topo: 1 mL di fosfato bucidato salina (PBS); 123 μL di enzima di digestione (vedere tabella dei materiali) a 13 wunsch / mL (soluzione di r…

Representative Results

Dopo la centrifugazione di gradiente di densità e la colorazione degli anticorpi, le cellule sono state acquisite su un citometro di flusso e analizzate utilizzando una strategia di gating morfologica come segue. Un primo cancello è stato definito nella zona di puntamento di Forward-Spattered-Area (FSC-A) rispetto alla Forward-Spattered-Height (FSC-H) per discriminare singole celle da dublets ( Figura 3A ). Le singole cellule sono state quindi gat…

Discussion

È stato dimostrato che la microglia e l'MDM hanno funzioni e fenotipi diversi nel CNS e quindi l'identificazione e l'analisi di queste subpopulazioni macrofagi sono essenziali per meglio capire le malattie neurologiche 9 , 18 , 25 . L'analisi della citometria a flusso utilizzando due marcatori (CD11b e CD45) consente la distinzione tra ciascuna sottopopolazione ( Figura 3C ). Quest…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dell'Agenzia Nazionale per la Recherche (ANR-12-MALZ-0003-02-P2X7RAD), l'Associazione Francia Alzheimer e Bpifrance. Il nostro laboratorio è anche supportato da Inserm, CNRS, Université Pierre et Marie Curie e il programma "Investigations d'avenir" ANR-10-IAIHU-06 (IHU-A-ICM). Vorremmo ringraziare l'assistenza della centrale CELIS per la coltura delle cellule.

Materials

5-month-old Mice Janvier C57BL/6J
Liberase TL Research Grade Sigma-Aldrich 5401020001 Digestion enzyme
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas Sigma-Aldrich DN25
Percoll GE Healthcare Life Sciences 17-0891-01  Density gradient medium
Cell Strainer size 70 µm Nylon Corning 731751
Venofix 25G BRAUN 4056370
Piston syringe 10 mL Terumo SS+10ES1
Pasteur pipette 230 mm Dustcher 20420
1,5 mL  tube Eppendorf 0030 123.328
15 mL  tube TPP 91015
50 mL  tube TPP 91050
5 mL polystyrene round bottom tube BD Falcon 352054
D-PBS (1X) without Ca2+/Mg2+ Thermo Fisher Scientific 14190-094
D-PBS (10X) without Ca2+/Mg2+ Thermo Fisher Scientific 14200-067
Fetal bovine serum Thermo Fisher Scientific 10270-106
EDTA Sigma-Aldrich E4884
Bovine Serum Albumin solution 30% Sigma-Aldrich A7284
Paraformaldehyde 32% Solution Electron Microscopy Sciences 15714-S Caution -Toxic
Saponin Sigma-Aldrich S2002
Sodium Azide Sigma-Aldrich 47036
PerCPCy5.5 Rat anti-mouse CD11b (clone M1/70) eBioscience 45-0112
Rat IgG2b K Isotype Control PerCP-Cyanine5.5 eBioscience 45-4031 
BV421 Rat anti-mouse CD45 (clone 30-F11) BD Biosciences 563890
BV421 Rat IgG2b, κ Isotype Control RUO BD Biosciences 562603
Rabbit anti-mouse TMEM119 (clone28-3) Abcam ab209064
AlexaFluor 647 Donkey anti-rabbit IgG Life Technologies A31573
Anti-Mouse CD16/CD32 Purified eBioscience 14-0161 Mouse Fc Block
Fixable Dead Cell Stain Kits Invitrogen L34969
Mouse CCR2 APC-conjugated Antibody R&D FAB5538A
Rat IgG2B APC-conjugated Isotype Control R&D IC013A
Mouse CX3CR1 PE-conjugated Antibody R&D FAB5825P
Goat IgG PE-conjugated Antibody R&D IC108P
Centrifuge Eppendorf 5804R
Cell analyzer BD Biosciences BD FACSVERSE
Data Analysis Software FlowJo LLC FlowJo
Fine scissors F.S.T 14090-11
Standard Pattern Forceps F.S.T 11000-13
Mayo Scissors F.S.T 14010-15
Dumont #5 Forceps F.S.T 11251-20

References

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Cite This Article
Martin, E., El-Behi, M., Fontaine, B., Delarasse, C. Analysis of Microglia and Monocyte-derived Macrophages from the Central Nervous System by Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (124), e55781, doi:10.3791/55781 (2017).

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