Summary

Análisis de microglia y macrófagos derivados de monocitos del sistema nervioso central por citometría de flujo

Published: June 22, 2017
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Summary

Este protocolo proporciona un análisis de las subpoblaciones de macrófagos en el sistema nervioso central del ratón adulto mediante citometría de flujo y es útil para el estudio de múltiples marcadores expresados ​​por estas células.

Abstract

Numerosos estudios han demostrado el papel de las células inmunitarias, en particular los macrófagos, en las patologías del sistema nervioso central (SNC). Existen dos poblaciones principales de macrófagos en el SNC: (i) la microglia, que son los macrófagos residentes del SNC y se derivan de progenitores del saco vitelino durante la embriogénesis, y (ii) los macrófagos derivados de monocitos (MDM), que pueden infiltrarse El SNC durante la enfermedad y se derivan de progenitores de médula ósea. Los roles de cada subpoblación de macrófagos difieren dependiendo de la patología que se estudia. Además, no hay consenso sobre los marcadores histológicos o los criterios distintivos utilizados para estas subpoblaciones de macrófagos. Sin embargo, el análisis de los perfiles de expresión de los marcadores CD11b y CD45 mediante citometría de flujo nos permite distinguir la microglia (CD11b + CD45 med ) del MDM (CD11b + CD45 alto ). En este protocolo, mostramos que la centrifugación de gradiente de densidadY el análisis de citometría de flujo se puede utilizar para caracterizar estas subpoblaciones de macrófagos del SNC, y para estudiar varios marcadores de interés expresados ​​por estas células como hemos publicado recientemente. Por lo tanto, esta técnica puede ampliar nuestra comprensión de la función de los macrófagos en ratones modelos de enfermedades neurológicas y también se puede utilizar para evaluar los efectos de los medicamentos sobre estas células.

Introduction

Los microglios son los macrófagos residentes en el tejido parenquimatoso del sistema nervioso central (SNC). Ellos juegan dos funciones funcionales clave: la defensa inmune y el mantenimiento de la homeostasis del SNC. En contraste con el MDM, que se renuevan continuamente de las células madre hematopoyéticas en la médula ósea, las células microgliales se diferencian de las células progenitoras hematopoyéticas primitivas originadas en el saco vitelino (YS) que colonizaron el cerebro durante el desarrollo embrionario 1 , 2 , 3 . En los roedores, el factor de transcripción Myb desempeña un papel crucial en el desarrollo de todos los monocitos y macrófagos derivados de la médula ósea, pero para la microglia derivada de YS, este factor es dispensable y la diferenciación sigue dependiendo del factor de transcripción PU.1 4 .

En el SNC sano, microglia son células dinámicas que constantemente muestrean su ambiente, scaY detección de patógenos invasores o daño tisular 5 . La detección de tales señales inicia un camino para resolver la lesión. La microglia cambia rápidamente de una morfología ramificada a una ameboidea, seguida de fagocitosis y liberación de diversos mediadores, tales como citoquinas pro- o antiinflamatorias. Así, dependiendo de su microambiente, microglia activado puede adquirir un espectro de diferentes estados de cebado [ 6] .

La microglia afecta profundamente el desarrollo y progresión de muchos trastornos neurológicos. En los modelos de roedores de la enfermedad de Alzheimer (EA) 7 , la esclerosis lateral amiotrófica (ELA) 8 , la esclerosis múltiple (EM) 9 o la enfermedad de Parkinson (PD) 10 , se demuestra que la microglia desempeña un doble papel, induciendo neurotoxicidad perjudicial o actuando De una manera neuroprotectora, que depende deN la enfermedad específica, la etapa de la enfermedad y si la enfermedad estaba influenciada por el compartimento inmunológico sistémico 7 , 8 , 9 , 10 , 11 . La mayoría de las lesiones del SNC observadas en las enfermedades citadas anteriormente contienen una población heterogénea de células mieloides, incluyendo no sólo microglia parenquimatosa, sino también macrófagos perivasculares y meníngeos, así como MDM infiltrante al SNC. Estos tipos de células pueden contribuir de forma diferencial a los mecanismos fisiopatológicos relacionados con la lesión y la reparación 7 , 12 , 13 , 14 , 15 . El desafío actual para los investigadores que estudian estos modelos de enfermedad es establecer si los monocitos periféricos y los macrófagos se infiltran en el SNC y, en caso afirmativo, distAngustia la microglia residente de estas células. De hecho, las células microgliales son muy plásticas; Cuando se activan, las microglias vuelven a expresar los marcadores que suelen expresarse por monocitos periféricos y macrófagos. La cuestión, por lo tanto, se basa en la identificación de marcadores que pueden distinguir la microglia residente de los monocitos infiltrados y macrófagos.

La discriminación de estas poblaciones sobre rodajas de cerebro por aplicaciones inmunohistológicas es limitada debido a la falta de anticuerpos específicos. Sin embargo, el análisis de citometría de flujo es una técnica eficiente para evaluar la expresión de varios marcadores y para distinguir las poblaciones celulares (por ejemplo, linfocitos, macrófagos MDM CD11b + CD45 alto y microglia CD11b + CD45 med ), así como las subpoblaciones celulares 16 , 17 , 18 . Este protocolo describe los procedimientos para aislar elCélulas mononucleares del SNC de ratón en modelos de enfermedad neurológica utilizando una disociación enzimática optimizada de tejido y una centrifugación de gradiente de densidad; Así como un método para diferenciar las poblaciones de microglia y MDM en el SNC mediante citometría de flujo.

Otra aproximación es eliminar la mielina y purificar las células usando perlas magnéticas conjugadas con anticuerpos específicos 19 , 20 , 21 . La eliminación de mielina utilizando perlas magnéticas anti-mielina es más caro y afecta a la viabilidad y el rendimiento de las células aisladas [ 22] . Esta etapa y la siguiente separación inmunomagnética de la microglia, limitan los estudios adicionales de las poblaciones específicas de células inmunes 21 , 22 .

Estos procedimientos proporcionan una manera fácil de estudiar las subpoblaciones de macrófagos en el desarrollo de la enfermedad, yPara determinar los efectos de los fármacos o modificaciones genéticas en fenotipos de macrófagos y estados de activación.

Protocol

Todos los métodos descritos aquí han sido aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales en el Instituto ICM y por el Comité de Ética Animal de Darwin y están cubiertos por el protocolo 01407.02. 1. Preparación Preparar el cóctel de digestión en un tubo de 1,5 ml combinando lo siguiente para cada ratón: 1 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS); 123 mu l de enzima de digestión (ver tabla de materiales) a 13 wunsch / mL (solución madre), …

Representative Results

Después de la centrifugación de gradiente de densidad y tinción de anticuerpos, las células se adquirieron en un citómetro de flujo y se analizaron usando una estrategia de bloqueo morfológico como sigue. Se definió una primera puerta en la zona de dispersión hacia delante (FSC-A) de trama de puntos frente a la altura dispersada hacia delante (FSC-H) para discriminar células individuales de dobletes ( figura 3A ). Las células individuales …

Discussion

Se ha demostrado que la microglia y el MDM tienen funciones y fenotipos diferentes en el SNC, por lo que la identificación y el análisis de estas subpoblaciones de macrófagos son esenciales para comprender mejor las enfermedades neurológicas 9 , 18 , 25 . El análisis de citometría de flujo utilizando dos marcadores (CD11b y CD45) permite distinguir entre cada subpoblación ( Figura 3C ). Esta…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabajo fue apoyado por subvenciones de la Agencia Nacional para la Investigación (ANR-12-MALZ-0003-02-P2X7RAD), Association France Alzheimer y Bpifrance. Nuestro laboratorio cuenta también con el apoyo del Inserm, el CNRS, la Universidad Pierre et Marie-Curie y el programa "Investissements d'avenir" ANR-10-IAIHU-06 (IHU-A-ICM). Quisiéramos agradecer la ayuda del centro de cultivo celular CELIS.

Materials

5-month-old Mice Janvier C57BL/6J
Liberase TL Research Grade Sigma-Aldrich 5401020001 Digestion enzyme
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas Sigma-Aldrich DN25
Percoll GE Healthcare Life Sciences 17-0891-01  Density gradient medium
Cell Strainer size 70 µm Nylon Corning 731751
Venofix 25G BRAUN 4056370
Piston syringe 10 mL Terumo SS+10ES1
Pasteur pipette 230 mm Dustcher 20420
1,5 mL  tube Eppendorf 0030 123.328
15 mL  tube TPP 91015
50 mL  tube TPP 91050
5 mL polystyrene round bottom tube BD Falcon 352054
D-PBS (1X) without Ca2+/Mg2+ Thermo Fisher Scientific 14190-094
D-PBS (10X) without Ca2+/Mg2+ Thermo Fisher Scientific 14200-067
Fetal bovine serum Thermo Fisher Scientific 10270-106
EDTA Sigma-Aldrich E4884
Bovine Serum Albumin solution 30% Sigma-Aldrich A7284
Paraformaldehyde 32% Solution Electron Microscopy Sciences 15714-S Caution -Toxic
Saponin Sigma-Aldrich S2002
Sodium Azide Sigma-Aldrich 47036
PerCPCy5.5 Rat anti-mouse CD11b (clone M1/70) eBioscience 45-0112
Rat IgG2b K Isotype Control PerCP-Cyanine5.5 eBioscience 45-4031 
BV421 Rat anti-mouse CD45 (clone 30-F11) BD Biosciences 563890
BV421 Rat IgG2b, κ Isotype Control RUO BD Biosciences 562603
Rabbit anti-mouse TMEM119 (clone28-3) Abcam ab209064
AlexaFluor 647 Donkey anti-rabbit IgG Life Technologies A31573
Anti-Mouse CD16/CD32 Purified eBioscience 14-0161 Mouse Fc Block
Fixable Dead Cell Stain Kits Invitrogen L34969
Mouse CCR2 APC-conjugated Antibody R&D FAB5538A
Rat IgG2B APC-conjugated Isotype Control R&D IC013A
Mouse CX3CR1 PE-conjugated Antibody R&D FAB5825P
Goat IgG PE-conjugated Antibody R&D IC108P
Centrifuge Eppendorf 5804R
Cell analyzer BD Biosciences BD FACSVERSE
Data Analysis Software FlowJo LLC FlowJo
Fine scissors F.S.T 14090-11
Standard Pattern Forceps F.S.T 11000-13
Mayo Scissors F.S.T 14010-15
Dumont #5 Forceps F.S.T 11251-20

References

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Cite This Article
Martin, E., El-Behi, M., Fontaine, B., Delarasse, C. Analysis of Microglia and Monocyte-derived Macrophages from the Central Nervous System by Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (124), e55781, doi:10.3791/55781 (2017).

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