Summary
本协议的总体目标是通过磁性松弛和荧光发射方式的结合, 合成功能性纳米, 用于便携式、cost-effective 和快速检测特定靶向致病菌。
Abstract
出大肠杆菌O157:H7 已与水和食源性疾病联系在一起, 尽管目前使用的食品和 water-screening 方法仍然存在威胁。虽然传统的细菌检测方法, 如聚合酶链反应 (PCR) 和酶联免疫吸附试验 (ELISA) 可以明确检测致病污染物, 他们需要广泛的样本准备和漫长的等待期。此外, 这些做法需要先进的实验室仪器和设置, 必须由训练有素的专业人员执行。在此, 提出了一种简单的诊断技术的协议, 其特点是磁性和荧光参数在纳米平台的独特组合。所提出的多磁荧光纳米 (MFnS) 可以检测到在小于1小时内, 在溶液中存在的1菌落形成单元的大肠杆菌O157:H7 污染。此外, 还证实了 MFnS 在诸如牛奶和湖水等复杂介质中保持高度功能的能力。另外的特异性化验也被用来证明 MFnS 只检测特定目标细菌的能力, 即使在存在类似的细菌种类的情况下。磁性和荧光模式的配对允许检测和定量的病原体污染在广泛的浓度, 表现出其在早期和晚期污染检测的高性能。MFnS 的有效性、可承受性和可移植性使他们成为点筛选各种环境中的细菌污染物的理想候选者, 从水生水库到商业包装食品。
Introduction
在商业生产的食物和水源中, 细菌污染的持续发生, 已使人们对越来越快速和具体的诊断平台产生了需求。1,2一些更常见的细菌污染物是由沙门氏菌、葡萄球菌、李斯特菌、弧菌、志贺氏杆菌和大肠杆菌引起的。3,4这些病原体的细菌污染通常会导致发烧、霍乱、肠胃炎和腹泻等症状。4水资源的污染往往对社区造成严重和不利的影响, 无法获得足够的过滤水, 食品污染导致大量疾病和产品召回努力。5,6
为了减少因细菌污染引起的疾病的发生, 已经作出了许多努力, 以制定方法, 在销售或消费之前, 可以有效地对水和食物进行扫描。3技术, 如 PCR、1、7、8、9、10 ELISA、11、12循环介导的等温放大 (灯),13,14 ,15,16,17,18,19,20,21, 22、23、24最近被用于检测各种病原体。与传统的细菌培养方法相比, 这些技术在特异性和时间方面更有效率。然而, 这些技术仍在与虚假的正面和负面、复杂的程序和成本斗争。1,3,25正是由于这个原因, 多磁荧光纳米 (MFnS) 被提出作为细菌检测的替代方法。
这些纳米独特的配对磁松弛和荧光模式, 允许双检测平台, 既快速又准确。使用大肠杆菌O157:H7 作为样品的污染物, MFnS 在几分钟内检测到 1 CFU 的能力被证实。病原体特异抗体用于增加特异性, 并且磁性和荧光方式的组合允许检测和定量细菌污染物在两个低 high-contamination 范围。16在细菌污染的情况下, 由于特定病原体抗体的靶向能力, 纳米将围绕细菌群。磁性纳米和细菌之间的结合限制了磁性铁芯与周围的水质子之间的相互作用。这会导致 T2 松弛时间的增加, 如磁 relaxometer 所记录的那样。随着溶液中细菌浓度的升高, 纳米随细菌数量的增加而分散, 导致 T2 值降低。反之, 由于纳米直接与病原体的数量增加, 荧光辐射与细菌浓度的比例会增加。离心的样品, 和分离的细菌颗粒, 将只保存纳米颗粒直接附着在细菌, 消除任何自由漂浮的纳米, 并直接关联的荧光辐射与数量溶液中存在细菌。此机制的示意图表示形式在图 1中表示。
这个 MFnS 平台已经设计了点的筛选, 导致低成本和便携的特点。MFnS 在室温下是稳定的, 只有在非常低的浓度下才能准确检测细菌污染物。此外, 在合成后, 使用 MFnS 是简单的, 不需要在实地使用训练有素的专业人员。最后, 这个诊断平台允许高度可定制的目标, 提供一种手段, 这一平台可以用来检测各种病原体, 在许多不同的设置。
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Protocol
1.Synthesis 多参量磁荧光纳米 (MFnS) 的功能化.
- 合成顺氧化铁纳米粒子 (IONPs)
- 准备 IONP 合成, 准备以下3解决方案: 解决方案 1: FeCl 3 (0.70 g) 和 FeCl 2 在 H 2 O (2 毫升), 解决方案 2: NH 4 OH (2.0 毫升, 13.4 米) 在 h 2 O (15 毫升) 和解决方案 3: 聚丙烯酸 (0.855 g) 在 h 2 O (5 毫升)。
- 将90和 #181; 2 米盐酸 (HCl) 添加到溶液 1, 然后立即与溶液2混合, 而涡流在 875 rpm。然后添加解决方案3。继续涡流60分钟.
- 离心20分钟, 在 1620 x g. 离心机上清液20分钟, 在 2880 x g.
- 通过透析净化终末清液。将上清液添加到透析袋 (分子6和 #8722; 8 K), 并将其放在含有磷酸盐缓冲盐水 (PBS) (pH = 7.4) 和自旋棒的烧杯中。让它浸泡12小时, 用新的缓冲器每2-3 小时更换一次.
- IONPs 的目标特定抗体与表面的共轭
- 准备以下四解决方案: 溶液 A: 5 毫克 1-乙基 3-(3-dimethylaminopropyl) 二盐酸盐 (氯甲酸) 250 和 #181; L MES [2-( N -吗) 磺酸] 缓冲液 (0.1 米, pH = 6.8), 溶液 B: 3 毫克 n-羟基琥珀酰亚胺 (NHS) 在250和 #181; MES 缓冲器 (0.1 米, ph 值 = 6.8), 溶液 C: 5 和 #181; IgG1, 大肠杆菌单克隆, 225 和 #181; 磷酸缓冲盐水 (PBS) (ph 7.4), 溶液 D: 4 毫升的 IONP (5.0 摩尔) 在1毫升 PBS (pH 7.4).
- 将 2-(N-吗) 磺酸 (MES) 缓冲区添加到解决方案 a 中, 然后在十五年代内立即将解决方案 a 添加到解决方案 D 中, 并在每次增加混合后反转解决方案.
- 立即开始在三分钟内将解决方案 B 添加到解决方案 D 的小增量中。在每次添加后通过反转解决方案进行混合.
- 将解决方案 C 添加到解决方案中, 增量为5和 #181; L, 在每增加混合后反转解决方案.
- 允许反应在室温下持续3小时, 然后在晚上4和 #176 继续孵化.
- 使用 PBS (pH = 7.4, 最终 [Fe] = 3.5 摩尔) 将产生的 Ab 共轭 IONPs 通过磁性柱净化, 以去除任何游离抗体。
- 用 PBS (1 毫升) 清洗磁性柱。将柱连接到磁板上, 并添加 IONP 溶液.
- 再用 PBS (1 毫升) 清洗磁性柱。从磁性板中取出磁性柱。将 PBS 添加到列中并收集解决方案。存储在4和 #176; C
- 封装荧光11和 #39;-Dioctadecyl-3,3,3 和 #39;, 3 和 #39;-Tetramethylindocarbocyanine 高氯酸盐 (DiI) 染料的聚丙烯酸 (临机) 涂层的抗体共轭 IONPs 使用溶剂扩散法。
- 到4毫升的 IONPs, 添加滴2.0 和 #181; DiI 染料 (2 摩尔) 在100和 #181 中的 l, 以连续混合在 1100 rpm 的亚砜 l.
- 透析结果解决方案 (分子 6-8 KDa, 12 h) 对抗 PBS, 创建最终的 MFnS 解决方案, 最终铁浓度为 [Fe] = 2 摩尔.
- 特性 MFnS
- 进行分光光度分析, 使用平板阅读器检测 595 nM 的封装 DiI 染料和荧光发射。
- 动态光散射
- 将 MFnS 溶液的样品放到 zetasizer 中, 以确定 MFnS 的平均尺寸和表面电荷.
注意: 在这里, 功能 MFnS 的平均大小和表面电荷分别被发现为 77.09 nm 和-22.3 mV.
- 将 MFnS 溶液的样品放到 zetasizer 中, 以确定 MFnS 的平均尺寸和表面电荷.
2。细菌培养和砧木溶液制备
- 细菌培养
- 水合 freeze-dried 颗粒 ( 大肠杆菌 O157:H7) 在1毫升的营养液中, 然后再加入5毫升的肉汤。
- 应用100和 #181; 此解决方案的 L 使用无菌接种循环, 然后在37和 #176 中孵化; C 为 24 h.
- 24 小时后, 从琼脂板中选择一个孤立的菌落, 并将其添加到15毫升的培养液中。在37和 #176 孵育, C 为4-6 小时, 同时监测光学密度值 (吸光度在 600 nm).
- 一旦获得0.1 的光学密度值, 停止培养, 并执行串行稀释.
- 串行稀释
- 添加900和 #181; L 营养液为八无菌离心管。
- 添加100和 #181; 细菌悬浮的 L 对第一个管子 (稀释 10 -1 ).
- 取100和 #181; L 从第一个管, 并添加它到第二个, 获得稀释 10 -2 。继续此模式的其余管, 最后稀释 10 -8 .
- 传输100和 #181; 从每个试管中分离琼脂板, 并在37和 #176 孵育24小时; C.
- 第二天, 计算每个板块上的菌落形成单位 (CFUs)。选择 100 CFUs 的板材。使用相应的稀释进行进一步的实验 (100 和 #181; L = ~ 100 CFUs).
注意: 这里是 10 -6 稀释, 导致 100 CFUs.
3。利用 MFnS 快速检测大肠杆菌 O157:H7
- 使用各种 PBS 解决方案 (1X、pH 值7.4、300和 #181; L), 10 -6 细菌的数量增加, 导致 CFU 范围从1-100。在这些解决方案中添加一致的 MFnS (100 和 #181; L).
- 创建一个基线解决方案, 其中仅包含 PBS (1X、pH 7.4、300和 #181; l) 和 MFnS (100 和 #181; l).
- 在37和 #176 孵育溶液30分钟, 然后让它们冷却到室温.
- 将单个解决方案转移到磁 relaxometer (0.47 泰斯拉), 并在每个解决方案中的 CFUs 中记录弛豫时间 (T2) 的变化。
- 若要记录 T2 值的更改, 请首先测量包含 PBS 和 MFnS 的基线解决方案的 T2 值。
- 将解决方案和 #160 放置在磁性 relaxometer 中。打开相应的软件, 选择和 #34; T2 放松和 #34; 设置和按下 #34; 测量. #34;
- 在基线 T2 的集合之后, 测量附加解决方案的 T2 值, 这些解是用各种细菌的浓度.
注: T2 的变化相当于从尖刺 T2 中减去的基线 T2.
- 若要记录 T2 值的更改, 请首先测量包含 PBS 和 MFnS 的基线解决方案的 T2 值。
- 从磁性 relaxometer 中取出样品, 并将试管离心 2880 x g, 10 分钟.
- 醒酒100和 #181 中的上清和重细菌颗粒; PBS (1X, pH 7.4).
- 添加80和 #181; 每个悬浮为96个井板, 记录荧光强度在 595 nM.
注: 测试可以重复使用不同的溶剂, 包括湖泊水, 牛奶和其他如在结果部分所述
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Representative Results
MFnS 操作的机制在图 1中表示。细菌污染物表面周围 MFnS 的聚类干扰了 MFnS 和周围氢核的磁性核心之间的相互作用。由于这种聚类, 磁松弛值增加。随着细菌污染物浓度的增加, 聚类减少, T2 值的变化减小。因此, 增加一个荧光形态是至关重要的。随着细菌浓度的增加, MFnS 所产生的荧光信号的强度增加, 从而使得对低浓度和高浓缩范围内细菌污染物的敏感检测成为可以。
根据该协议, 在 PBS (1X、pH 7.4) 的溶液中合成并首次测试了16 MFnS。用于检测、磁弛豫的初始模态用于记录 T2 值的变化。根据该协议, 样品离心, 颗粒悬浮, 收集荧光数据。相应的ΔT2 和荧光发射值显示在图 2中。如图所示, ΔT2 值最大, 在较低浓度的细菌污染, 并达到饱和约 20 CFUs。另一方面, 荧光发射变得更加准确和 #62; 20 CFUs, 显示了结合这两种模式的重要性。在这些初步化验之后, 在复杂的介质中进行了类似的试验, 包括湖水和牛奶。这样做是为了确保纳米在更复杂的媒体中仍然有效。从这些分析中收集的数据显示在图 3中, 与 PBS 中进行的检测非常相似。这就验证了这些纳米在复杂介质中仍然有效。
在确认 MFnS 能检测到细菌污染物在简单和复杂的介质中的存在之后, 进行了一系列的测试, 以确定由纳米保持的特异性水平。为此, MFnS 在含有目标细菌、热致死目标细菌、非靶标细菌 (致病大肠杆菌和鼠伤寒杆菌) 和混合物的溶液中孵育。由于这仅仅是一个特异性的分析, 光是收集磁弛豫数据就足够了, 并在图 4中提供了相应的数据。正如可以看到的, MFnS 绑定只住大肠杆菌O157:H7, 而不是其他热死亡或非靶标细菌。这种特异性的水平归因于共轭靶向抗体, 并进一步证实, MFnS 将有效地检测特定的病原体污染物, 即使在存在的致病细菌物种。
图 1: 磁荧光检测机制.MFnS 合成的图式表征和细菌检测的双模态机制。在短潜伏期 (30 分钟) 后, MFnS 能够通过磁共振和荧光发射的组合灵敏地检测目标细菌。聚 MFnS 周围的细菌污染物的表面导致磁松弛值的变化, 这是可检测的磁性 relaxometer。此外, 荧光信号可以从直接绑定到细菌污染物的 MFnS 中收集。这提供了一个双模态检测平台, 能够检测细菌污染物在低和高浓度范围。16此图已通过权限进行了修改。16
图 2: 概念的证明. A) 磁弛豫资料 (ΔT2) 是第一次从稀释中收集的大肠杆菌O157:H7 (1-100 CFU) 在 PBS 溶剂 (1X, pH = 7.4)。MR 检测的细菌是高度敏感的低 CFU 计数 (插页: 范围从 1-20 CFU)。然而, ΔT2 读数变得饱和在较高的细菌浓度 (和 #62; 20 CFU), 表明 MR 是更有价值的检测和定量的早期细菌污染。B) 来自同一个尖刺 PBS 溶液的荧光发射数据 (插图: 线性图)。结果表明, 荧光检测法对高 CFU 计数较为敏感, 对低 CFU 样品缺乏敏感性。这些数据共同显示了磁性和荧光模式在细菌污染的早期和晚期检测和量化细菌污染的能力。16平均值为三的测量值被描述为±标准误差。此图已通过权限进行了修改。16
图 3: 复杂介质中的细菌检测.磁弛豫ΔT2 从较复杂的介质 (包括 A) 湖水和 B) 全脂牛奶中收集到的数据。与以前的 PBS 解决方案所收集的数据类似, 据指出, 在 1-20 CFU (镶嵌) 范围内, 细菌污染物的检测更为敏感。相应的荧光发射数据收集的 C) 湖水和 D) 牛奶样本 (镶嵌: 线性图), 这表明更高的灵敏度与增加 CFU 计数。这些数据再次证明了每种模式相辅相成的有效性, 并验证了它们在复杂介质中保持功能的能力。16平均值为三的测量值被描述为±标准误差。此图已通过权限进行了修改。16
图 4: MFnS 特异性.MFnS 的特异性在含有 a 的营养液中的 MR 分析中进行了测试, 其中包含了一些细菌 cross-contaminants 和混合物, 以及 B) 热灭活的大肠杆菌O157:H7。如图所示, 很明显, 纳米对目标细菌没有任何约束力, 并且仍然能够在存在其他污染物的情况下检测目标细菌, 从而确保这种形式的筛选将通过在含有多种致病细菌种类的复杂介质中使用。C) 通过合成 MFnS 和同种抗体 (红圈: 反大肠杆菌O111) 进行进一步的特异性检测, 与 O157:H7 抗体共轭的 MFnS (黑方块) 相比, 其结果几乎没有任何约束力。这些数据表明, MFnS 只与可行的目标细菌反应, 进一步验证其作为一个点诊断平台的有效性。16平均值为三的测量值被描述为±标准误差。此图已通过权限进行了修改。16
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Discussion
本协议的设计目的是尽可能简单地生成完全功能的 MFnS。但是, 根据用户的最终目标, 更改协议可能有用的许多关键点。例如, 使用不同的抗体可以使许多其他病原体成为靶向。此外, 本议定书不限于使用抗体作为靶分子。任何对目标病原体有特定约束力的分子, 如宿主细胞受体, 也可用作靶分子。只要靶向分子有一个主要胺或酒精组, 或可以功能化有一个, 它可能被共轭到表面氧化铁纳米粒子根据该协议中所列的化学物质/NHS 共轭化学品。其次, 在每个检测解决方案中使用的 MFnS 量可能会有所不同。重要的是要使用足够的, 使基线溶液的 T2 值 (只含有溶剂和无目标病原体的纳米) 在100-250 毫秒的范围内. 如果基线值低于 100, 则 T2 值的更改将不太敏感, 因为纳米的过剩。若要提高基线 T2 值, 请减少解决方案中的纳米量。但是, 如果基线高于 250, 它就变得过于敏感, 而假阳性可能会变得更有可能。基于这些原因, 建议在100-250 毫秒之间为基线解决方案 T2 值。
目前的限制, 这一协议, 当考虑其使用作为一个点诊断, 是依赖于目前的台式磁性 relaxometer。虽然有效和稳定, 这个磁弛豫平台可以缩小规模, 以增加其可移植性。这将增加该平台在不同环境 (如在水源或杂货店市场) 中用于有效 on-site 细菌筛选的易用性。这也可以降低这台机器的成本, 使点病原体检测更加可行。
关于疾病诊断和病原体检测资源设置, 这个平台有潜力比目前使用的病原体诊断技术, 包括 PCR 和 ELISA。虽然这些传统技术已经被证明是很有效的, 但它们是高度复杂、昂贵和缓慢的。因此, 有必要建立一个精确的诊断平台, 以便在资源环境中用于点检测病原体和疾病诊断。该平台使用相对简单, 成本效益高, 速度快。除了所需的机器 (relaxometer 和平板阅读器) 的初始启动成本, 实际的 MFnS 是相对便宜和非常稳定。此外, T2 值的收集很简单, 不需要专业的实验室技术员。
今后, 将与化学和生物工程师合作, 设计一种更便携、hand-held 的装置, 可用于磁性和荧光检测细菌污染的使用 MFnS。开发一个较小的设备将有助于进一步降低与这个检测平台相关的成本, 并提高其在现场的有效性。此外, 该平台还有可能被用来分析开发杀菌剂的有效性。如我们的数据所示, 我们的 MFnS 只能够与活靶向细菌结合, 在与热杀死的细菌一起孵化时几乎不产生任何信号。在此基础上, 我们的平台可以用来测试生物杀伤剂候选者的有效性, 我们计划在未来进一步探索。
本协议中的关键步骤包括 MFnS 的初始合成和 T2 数据的收集。正确纯化 MFnS 是重要的, 以确保自由漂浮的抗体不会干扰 T2 的数据收集。此外, 在每个测试样本中放置的 MFnS 的数量必须一致, 因为 MFnS 浓度的变化会改变 T2 值, 冒着假阳性/底片的风险。
最后, MFnS 是一个新的步骤, 在对抗细菌污染, 并将进一步发展, 随着更多的病原体的目标实现和设计更多的便携式机械的追求。低成本和复杂与使用 MFnS, 使他们成为一个可行的候选人, 用于 on-site 检测细菌污染。虽然这些纳米的合成需要仔细的准备, 他们的实际使用是相对简单的, 并给他们的潜力, 以减少食源性和水性疾病。在进一步发展的过程中, 这些纳米的实施可以从在包装场所、销售点、甚至是家庭的水水库和商业生产食品的筛选中看到。
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Disclosures
这一纳米技术的示范应用尚未得到 FDA 的批准。
Acknowledgments
这项工作是支持 INBRE P20GM103418, 堪萨斯大豆委员会 (肯尼迪航天公司/电源 1663), ACS 脉冲 56629-UNI7 和电源聚合物化学启动基金, 所有的 SS。我们感谢大学摄影师, Mr. 雅各 Anselmi, 为他出色的视频工作。我们还感谢 Mr. 罗杰 Heckert 和 Mrs. 卡塔奥义 Heckert 对研究的慷慨支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ferrous Chloride Tetrahydrate | Fisher Scientific | I90-500 | |
| Ferric Chloride Hexahydrate | Fisher Scientific | I88-500 | |
| Ammonium Hydroxide | Fisher Scientific | A669S-500 | |
| Hydrochloric Acid | Fisher Scientific | A144S-500 | |
| Polyacryllic Acid | Sigma-Aldrich | 323667-100G | |
| EDC | Thermofisher Scientific | 22980 | |
| NHS | Fisher Scientific | AC157270250 | |
| Anti-E. coli O111 antibody | sera care | 5310-0352 | |
| Anti-E. coli O157:H7 antibody [P3C6] | Abcam | ab75244 | |
| DiI Stain | Fisher Scientific | D282 | |
| Nutrient Broth | Difco | 233000 | |
| Freeze-dried E. coli O157:H7 pellet | ATCC | 700728 | |
| Magnetic Relaxomteter | Bruker | mq20 | |
| Zetasizer | Malvern | NANO-ZS90 | |
| Plate Reader | Tecan | Infinite M200 PRO | |
| Magnetic Column | QuadroMACS | 130-090-976 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5804 Series | |
| Centrifuge (accuSpin Micro 17) | Fisher Scientific | 13-100-676 | |
| Floor Model Shaking Incubator | SHEL LAB | SSI5 | |
| Analytical Balance | Metler Toledo | ME104E | |
| Digital Vortex Mixer | Fisher Scientific | 02-215-370 | |
| Open-Air Rocking Shaker | Fisher Scientific | 02-217-765 |
References
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