Summary
O objetivo geral do presente protocolo é para sintetizar nanosensors funcional para o portátil, econômica, e rápida detecção de direcionado especificamente bactérias patogênicas através de uma combinação de relaxação magnética e as modalidades de emissão de fluorescência.
Abstract
Enterohemorrhagic Escherichia coli O157: H7 tem sido associada a ambos de origem hídrica e doenças transmitidas por alimentos e continua a ser uma ameaça, apesar dos métodos de seleção de alimentos e de água usada atualmente. Enquanto os métodos de detecção bacteriana convencional, tais como a reação em cadeia da polimerase (PCR) e ensaios imunoenzimático (ELISA) especificamente podem detectar contaminantes patogênicos, eles exigem preparação da amostra extensa e longos períodos de espera. Além disso, estas práticas exigem instrumentos de laboratório sofisticado e configurações e devem ser executadas por profissionais treinados. Neste documento, propõe-se um protocolo para uma técnica de diagnóstica mais simples que apresenta uma combinação única de parâmetros magnéticos e fluorescentes em uma plataforma baseada em nanopartículas. O nanosensors de magneto-fluorescente Multiparamétrico proposto (MFnS) pode detectar a contaminação de Escherichia coli O157: H7 com tão pouco quanto 1 unidade formadoras presente em solução dentro de menos de 1 h. Além disso, a capacidade de MFnS permanecem altamente funcional em meios complexos tais como leite e água do lago foi verificada. Ensaios de especificidade adicionais também foram utilizados para demonstrar a capacidade de MFnS para detectar somente as bactérias do alvo específico, mesmo na presença de espécies bacterianas semelhantes. O emparelhamento de modalidades magnéticas e fluorescentes permite a detecção e quantificação de contaminação do patógeno em uma ampla gama de concentrações, exibindo seu alto desempenho em ambos deteção de contaminação e tarde-estágio inicial. A eficácia, acessibilidade e portabilidade dos MFnS torná-los um candidato ideal para o rastreio de point-of-care para bactérias contaminantes em uma ampla gama de configurações, de reservatórios aquáticos para alimentos embalados comercialmente.
Introduction
A ocorrência persistente de contaminação bacteriana em ambos produzidos comercialmente alimentos e fontes de água criou uma necessidade de plataformas de diagnósticos cada vez mais rápidas e específicas. 1 , 2 alguns dos contaminantes bacterianos mais comuns responsáveis pela contaminação de alimentos e água são dos gêneros Salmonella, Staphylococcus, Listeria, Vibrio, Shigella, Bacillus e Escherichia. 3 , 4 a contaminação bacteriana por esses patógenos frequentemente resulta em sintomas como diarreia, cólera, gastroenterite e febre. 4 contaminação das fontes de água, muitas vezes tem efeitos adversos e drásticos em comunidades sem acesso a água filtrada suficientemente, e contaminação de alimentos tem levado a um grande número de doenças e esforços de recuperação do produto. 5 , 6
A fim de reduzir a ocorrência de doenças causadas por contaminação bacteriana, tem havido uma série de esforços para desenvolver métodos pelos quais água e alimentos podem ser eficientemente verificados antes da venda ou consumo. 3 técnicas como a PCR,1,7,8,9,10 ELISA,11,(mediada por loop de amplificação isotérmica de12 LÂMPADA),13,14 entre outros,15,16,17,18,19,20,21, 22,23,24 recentemente tem sido usado para detecção de vários patógenos. Comparado ao tradicional bacteriana, métodos de cultivo, estas técnicas são muito mais eficientes em relação à especificidade e tempo. No entanto, estas técnicas ainda lutam com falsos positivos e negativos, procedimentos complexos e custo. 1 , 3 , 25 ... é por essa razão que Multiparamétrico magneto-fluorescente nanosensors (MFnS) propõem-se como um método alternativo para a deteção bacteriana.
Estes nanosensors com exclusividade par juntos relaxação magnética e modalidades fluorescentes, permitindo uma plataforma dual-deteção rápida e exata. Usando Escherichia coli O157: H7 como um contaminante de amostra, é demonstrada a capacidade de MFnS para detectar tão pouco quanto 1 CFU em poucos minutos. Específicas do patógeno anticorpos são usados para aumentar a especificidade, e a combinação de modalidades magnéticas e fluorescentes permite a detecção e quantificação de contaminantes bacterianos em ambas as gamas de alta e baixa --contaminação. 16 no caso de contaminação bacteriana, o nanosensors vai enxame à volta as bactérias devido as habilidades alvos dos anticorpos específicos do patógeno. A ligação entre a nanosensors magnética e bactérias limita a interação entre o núcleo de ferro magnético e os prótons de água circundante. Isto causa um aumento nos tempos de relaxamento T2, como registrado por uma relaxometer magnética. Como a concentração de bactérias na solução aumenta, os nanosensors se dispersar com o aumento do número de bactérias, resultando em valores mais baixos de T2. Por outro lado, a emissão de fluorescência aumentará em proporção com a concentração de bactérias, devido ao aumento do número de nanosensors diretamente ligado ao patógeno. Centrifugação das amostras e o isolamento da pelota bacteriana, só irão conservar as nanopartículas diretamente conectadas com as bactérias, removendo qualquer nanosensors flutuante e correlacionando diretamente a emissão de fluorescência com o número de bactérias presentes na solução. Uma representação esquemática deste mecanismo é representada na Figura 1.
Esta plataforma de MFnS foi projetada com rastreio de point-of-care em mente, resultando em características de baixo custo e portátil. MFnS são estáveis à temperatura ambiente e só são necessários em concentrações muito baixas para detecção precisa de bactérias contaminantes. Além disso, após a síntese, o uso da MFnS é simples e não requer o uso de profissionais treinados no campo. Por último, esta plataforma de diagnóstica permite direcionamento altamente personalizável, proporcionando um meio pelo qual este uma plataforma pode ser usada para detectar agentes patogénicos de todos os tipos, em muitas configurações diferentes.
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Protocol
1. síntese e Functionalization de multi paramétrico Magneto-fluorescente Nanosensors (MFnS).
- Síntese de óxido de ferro superparamagnético nanopartículas (IONPs)
- para se preparar para a síntese IONP, preparar as seguintes 3 soluções: solução 1: FeCl 3 (0,70 g) e FeCl 2 H 2 O (2 mL), 2 solução: NH 4 OH (2,0 mL, 13,4 M) em H 2 O (15 mL) e a solução 3: ácido poliacrílico (0,855 g) em H 2 O (5 mL).
- Adicionar 90 µ l de ácido clorídrico de 2 M (HCl) à solução 1 e então misture com 2 solução enquanto num Vortex em 875 rpm. Em seguida, adicione solução 3. Continuar num Vortex de 60 min.
- Centrifugar por 20 min no 1.620 g. x de centrifugação o sobrenadante por 20 min em 2.880 g. x
- Purificar o sobrenadante final através de diálise. Adicionar o sobrenadante para um saco de diálise (MWCO 6 − 8 K) e coloque-o em um béquer contendo tamponado fosfato salino (PBS) (pH = 7,4) e barra de rotação. Deixe de molho por 12h, substituindo com buffer fresco a cada 2-3 h.
- Conjugação de anticorpos de alvos de superfície de IONPs
- preparar as seguintes quatro soluções: solução a: 5 mg de 1-etil - 3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida cloridrato (CED), em 250 µ l MES [2-(N- tampão de ácido etanesulfónico de Morpholinos)] (0,1 M, pH = 6,8), solução b: 3 mg de N-Hidroxisuccinimida (NHS) em 250 µ l de tampão MES (0,1 M, pH = 6,8), solução c: 5 µ g de IgG1, o mAb de Escherichia coli, em 225 µ l de tampão fosfato salino (PBS) (pH 7,4) e a solução d: 4 mL de IONP (5,0 mmol) em 1 mL de PBS (pH 7,4).
- Então imediatamente adicionar 2-(N-Morpholinos) ácido etanesulfónico (MES) do buffer para a solução A, adicionar solução-A solução d em pequenos incrementos, no prazo de 15 s, invertendo a solução após cada adição para a mistura.
- Imediatamente começam a adicionar solução B a solução D em pequenos incrementos ao longo de um período de três minutos. Mix, invertendo-se a solução após cada adição.
- Adicionar solução C solução em incrementos de 5 µ l, invertendo a solução após cada adição para a mistura.
- Permitir a reação continuar para 3h em temperatura ambiente e em seguida, continuar a incubação a 4 ° C durante a noite.
- Purificar as IONPs Ab-conjugado resultantes através de coluna magnética usando PBS (pH = 7,4, final [Fe] = 3,5 mmol) para remover quaisquer anticorpos unconjugated.
- Lavar a coluna magnética com PBS (1 mL). Unir a coluna para a placa magnética e adicionar a solução IONP.
- Lavar a coluna magnética com PBS (1 mL). Remova a coluna magnética da placa magnética. Adicionar PBS para a coluna e recolher a solução. Loja a 4 ° C
- encapsulamento de 1,1 fluorescente ' - Dioctadecyl - 3,3,3 ', 3 '-corante Tetramethylindocarbocyanine perclorato (DiI) para o revestimento (PAA) o ácido poliacrílico os conjugado anticorpo IONPs usando um método de difusão de solventes.
- De 4 mL dos IONPs, Adicionar gota a gota 2.0 μL de tintura de DiI (2 mmol) em 100 µ l de DMSO com mistura contínua a 1100 rpm.
- Dialize a solução resultante (MWCO 6-8 KDa, 12 h) contra PBS, criando uma solução final de MFnS com uma concentração final de ferro [Fe] = 2 mmol.
- Caracterização de MFnS
- para análise espectrofotométrica, usar um leitor de placas para detectar encapsulado DiI tintura com emissão de fluorescência em 595 nM. Difusão dinâmica da luz
- de
- coloca uma amostra da solução de MFnS em um zetasizer para determinar o tamanho médio e carga de superfície da MFnS.
Nota: Aqui, o tamanho médio e carga de superfície de MFnS funcionais foram encontrados para ser 77.09 nm e-22.3 mV, respectivamente.
2. Bactérias Culturing e preparação de solução estoque
- bacteriana cultivo
- hidratar uma pelota liofilizada (Escherichia coli O157: H7) em 1 mL de caldo nutriente e em seguida, adicionar um adicional 5 mL de caldo de carne.
- Aplicam-se 100 µ l desta solução para uma placa de ágar e raia utilizando uma ansa de inoculação estéril, seguida de incubação a 37 ° C por 24 h.
- Após 24 h, selecione uma colônia isolada da placa de ágar e adicioná-lo a um 15 mL de caldo de cultura. Incubar a 37 ° C, durante 4-6 h, enquanto monitora o valor de densidade óptica (absorvância a 600 nm).
- Uma vez um valor de densidade óptica de 0.1 obtido, pare de cultivo e realizar diluições em série.
- Diluições em série
- Adicionar 900 µ l de caldo nutriente para oito tubos estéreis microcentrifuga.
- Adicione 100 µ l da suspensão bacteriana ao primeiro tubo (diluição 10 -1).
- Levar 100 µ l do primeiro tubo e adicioná-lo para o segundo, para obter uma diluição de 10 -2. Continue este padrão para os tubos restantes, terminando com uma diluição final de 10 -8.
- Transferir 100 µ l de cada tubo para separar as placas de ágar e incubar por 24 h a 37 ° C.
- No dia seguinte, contar as unidades (CFUs) formadoras em cada prato. Selecione a placa com CFUs ~ 100. Usar as correspondentes diluições para novas experiências (100 µ l = CFUs ~ 100).
Nota: Aqui era a diluição de 10 -6 que resultou em 100 ~ CFUs.
3. Rápida deteção de E. coli O157: H7 usando MFnS
- Spike várias soluções de PBS (1. X, pH 7,4, 300 µ l) com a quantidade crescente do estoque de 10 -6 bacteriana, resultando em CFU varia de 1-100. Adicionar uma quantidade consistente de MFnS (100 µ l) para essas soluções.
- Criar uma solução de linha de base que contém somente PBS (1. X, pH 7,4, 300 µ l) e MFnS (100 µ l).
- Incubar soluções por 30 min a 37 ° C e então deixe-os arrefecer à temperatura ambiente.
- Transferência de soluções individuais para o relaxometer magnético (Tesla 0,47) e gravar alterações nos tempos de relaxamento (T2) em relação as CFUs em cada solução.
- Para gravar as alterações em valores de T2, Comece medindo o valor de T2 da solução de linha de base que contém somente PBS e MFnS.
Relaxometer
- lugar a solução em magnética. Abra o respectivo software, selecione o " relaxamento T2 " definição e pressione " medida. "
- seguindo a coleção de linha de base T2, medir os valores de T2 das soluções adicionais que foram cravados com vários concentrações de bactérias.
Nota: A mudança em T2 é equivalente à linha de base de T2 subtraída a T2 cravado.
- Para gravar as alterações em valores de T2, Comece medindo o valor de T2 da solução de linha de base que contém somente PBS e MFnS.
Relaxometer
- Remover amostras da relaxometer magnética e centrifugar os tubos a 2880 x g durante 10 min.
- Decante o sobrenadante e ressuspender pelotas bacterianas em 100 µ l de PBS (1. X, pH 7,4).
- Adicionar 80 µ l de cada ressuspensão de uma placa de 96 poços e intensidades de fluorescência recorde em 595 nM.
Nota: Teste pode ser repetido usando solventes diferentes, incluindo a água do lago, leite e outros, conforme descrito na seção de resultados
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Representative Results
O mecanismo de ação MFnS é representado na Figura 1. O agrupamento de MFnS em torno da superfície de bactérias contaminantes interfere com as interações entre os magnetic cores dos MFnS e os núcleos de hidrogênio circundante. Como resultado deste relaxamento de clustering, magnético valores aumentam. À medida que aumenta a concentração de bactérias contaminantes, reduz a clusterização e a alteração nos valores de T2 diminui. Portanto, a adição de uma modalidade fluorescente é crucial. À medida que aumenta a concentração bacteriana, aumenta a força do sinal fluorescente produzido por MFnS, permitindo a detecção sensível de contaminantes bacterianos em ambas as gamas de baixa e alta concentração.
Seguindo o protocolo,16 MFnS foram sintetizados e testados primeiro em soluções de PBS (1. X, pH 7,4). A modalidade inicial utilizada para detecção, relaxação magnética, foi usada para gravar alterações em valores de T2. De acordo com o protocolo, as amostras foram centrifugadas então, pelotas foram resuspended e fluorescência foram recolhidos. O correspondente ΔT2 e valores de emissão de fluorescência são apresentados na Figura 2. Como mostrado, o valor de ΔT2 foi maior em concentrações menores de contaminação bacteriana e chegou a saturação em aproximadamente 20 CFUs. Emissão de fluorescência, por outro lado, tornou-se mais preciso na > 20 CFUs, mostrando a importância de combinar essas duas modalidades. Seguindo estes ensaios primários, testes semelhantes foram realizados em meios complexos, incluindo o leite e a água do lago. Isto foi feito para garantir que os nanosensors são ainda eficazes nos meios de comunicação mais complexos. Os dados coletados destes ensaios são apresentados na Figura 3 e são muito semelhantes para os ensaios realizados em PBS. Isto confirma que estes nanosensors permanecem eficazes nos meios de comunicação complexos.
Após a confirmação de que MFnS poderia detectar a presença de contaminantes bacterianos em simples e complexos meios de comunicação, um número de testes realizaram-se então para determinar o nível de especificidade, mantido pelo nanosensors. Para este fim, MFnS foram incubados em soluções que contêm bactérias do alvo, as bactérias do alvo morto de calor, bactérias não-alvo (não-patogênicas de e. coli e S. typhimurium) e uma mistura. Como este foi apenas um ensaio de especificidade, a coleta de dados de relaxação magnética sozinhos era suficiente, e os dados correspondentes são apresentados na Figura 4. Como pode ser visto, o MFnS vinculado apenas a viver de Escherichia coli O157: H7 e não para outras bactérias as calor-matou ou não-alvo. Este nível de especificidade é atribuída aos anticorpos conjugados direcionamentos e ainda confirma que MFnS será eficaz na detecção de contaminantes específicos do patógeno, mesmo quando na presença de espécies de bactérias não-patogênicas.
Figura 1 : Mecanismo de detecção de magneto-fluorescentes. Representação esquemática da síntese de MFnS e o mecanismo dual-modal da deteção bacteriana. Após um período de incubação curto (30 min), MFnS são capazes de detectar sensivelmente as bactérias do alvo através de uma combinação de ressonância magnética e de emissão de fluorescência. Cluster de MFnS em torno da superfície de bactérias contaminantes provoca alterações em valores de relaxação magnética, que são detectáveis por um relaxometer magnético. Além disso, os sinais fluorescentes podem ser recolhidos desde os MFnS diretamente ligado a contaminantes bacterianos. Isto fornece uma plataforma de deteção de dual-modal capaz de contaminantes bacterianos de deteção em ambas as gamas de baixa e alta concentração. 16 esta figura foi modificada com a permissão de. 16
Figura 2 : Prova de conceito,. A) dados de relaxamento magnético (ΔT2) foi coletados pela primeira vez de diluições de Escherichia coli O157: H7 (1-100 CFU) em solvente de PBS (1 X, pH = 7,4). Senhor de detecção de bactérias era altamente sensível à baixa contagem de UFC (baixo-relevo: desde o UFC 1-20). No entanto, as leituras de ΔT2 se tornou saturadas em altas concentrações bacterianas (> 20 CFU), indicando que o senhor é mais valiosa para a detecção e quantificação de estágios iniciais de contaminação bacteriana. B) dados de emissão de fluorescência da mesma cravado soluções PBS (baixo-relevo: trama de linearidade). Os resultados mostraram que o método de deteção de fluorescência é mais sensível a maior contagem de UFC, enquanto é falta de sensibilidade para amostras CFU baixas. Juntos, estes dados demonstram a capacidade das modalidades magnéticas e fluorescentes para detectar e quantificar a contaminação bacteriana no início e final-estágios de contaminação bacteriana. 16 valores médios das três medições são retratados ± erro-padrão. Esta figura foi modificada com a permissão de. 16
Figura 3 : Deteção bacteriana em meios complexos. Relaxação magnética ΔT2 dados coletados dos meios de comunicação mais complexos, incluindo A) Lago água e B) leite integral. Semelhante aos dados coletados das soluções anteriores de PBS, observou-se que a detecção de contaminantes bacterianos foi mais sensível na faixa de 1-20 UFC (inserções). Dados de emissão de fluorescência correspondente foi coletados para o C) água do lago e D) amostras de leite (inserções: linearidade parcelas), que mostrou maior sensibilidade com o aumento da contagem de UFC. Mais uma vez, esses dados demonstram a eficácia com que cada modalidade complementa o outro e validar a sua capacidade de permanecer funcional em meios complexos. 16 valores médios das três medições são retratados ± erro-padrão. Esta figura foi modificada com a permissão de. 16
Figura 4 : Especificidade MFnS. A especificidade de MFnS foi testada usando análise de senhor em soluções de caldo nutriente contendo A) um número de cruz-contaminantes bacterianos e uma mistura e B) calor-Inactive Escherichia coli O157: H7. Como mostrado, é claro que o nanosensors não tem pouco ou nenhuma ligação com bactérias não específico e são ainda capaz de detectar as bactérias do alvo na presença de outros contaminantes, garantindo que esta forma de rastreio seria viable para uso em meios complexos que contêm um número de espécies de bactérias não-patogênicas. C) outras especificidade teste foi conduzido por sintetizar MFnS com um anticorpo isotype (círculos vermelhos: Antie. coli O111), que resultou em pouca ou nenhuma ligação em comparação com os MFnS conjugado anticorpo O157: H7 (quadrados pretos). Estes dados demonstram que MFnS apenas reagir com bactérias alvo viável, ainda mais, verificando sua eficácia como uma plataforma de diagnóstica point-of-care. 16 valores médios das três medições são retratados ± erro-padrão. Esta figura foi modificada com a permissão de. 16
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Discussion
Este protocolo foi projetado para produzir MFnS totalmente funcionais como simplesmente possível. No entanto, existem muitos pontos-chave em que a alteração do protocolo pode ser útil, dependendo do objetivo do final do usuário. Por exemplo, o uso de anticorpos diferentes permitiria segmentação dos muitos outros patógenos. Além disso, este protocolo não é limitado ao uso de anticorpos como alvo moléculas. Qualquer molécula que tem afinidade de ligação específica para patógenos alvo, tais como receptores de célula do hospedeiro, também pode ser usada como alvo moléculas. Enquanto a molécula alvo tem uma amina primária ou grupo de álcool, ou pode ser acrescida para ter um, podem ser conjugado para a superfície de nanopartículas de óxido de ferro, de acordo com a química de conjugação de EDC/NHS listada no protocolo. Em segundo lugar, a quantidade de MFnS usado em cada solução de deteção pode ser variada. É importante usar o suficiente para que o valor de T2 para a solução de linha de base (contendo apenas o solvente e o nanosensor sem patógeno alvo) é na faixa de 100-250 MS. se o valor de base é abaixo de 100, então as alterações nos valores de T2 será menos sensíveis , devido a uma superabundância de nanosensor. Para aumentar a valor de T2 de linha de base, reduza a quantidade de nanosensor em solução. Se, no entanto, a linha de base está acima de 250, torna-se extremamente sensível, e falsos positivos podem tornar-se mais prováveis. Por estas razões, sugere-se a apontar para uma solução de base valor T2 entre 100-250 ms.
Limitações atuais do presente protocolo, quando se considera o seu uso como um diagnóstico point-of-care, são a dependência sobre o atual relaxometer magnético de bancada. Enquanto eficaz e estável, esta plataforma de relaxação magnética pode ser reduzida em tamanho para aumentar sua portabilidade. Isso aumentaria a facilidade com que esta plataforma pode ser usada em diferentes ambientes, tais como em fontes de água ou nos mercados de mantimento, para a eficaz seleção bacteriana no local. Isso também poderia reduzir o custo da máquina, tornando-se mais viável para a deteção de point-of-care patógeno.
Deteção de diagnóstico e patógeno doença nas configurações de recursos baixos, no que se refere esta plataforma tem potencial para ser mais eficaz do que a atual patógeno diagnóstico técnicas utilizadas hoje, incluindo PCR e ELISA. Enquanto estas técnicas tradicionais têm provado para ser eficaz em grande parte, eles são altamente complexo, caro e lento. Como tal, há uma necessidade de uma plataforma de diagnóstica precisa que poderia ser desenvolvida para uso em configurações de recursos baixos para detecção de point-of-care de patógenos e diagnóstico da doença. Esta plataforma é relativamente simples de usar, custo-eficaz e rápida. Além de custos de arranque inicial das máquinas necessárias (leitor de relaxometer e placa), os reais MFnS são relativamente baratos e muito estável. Além disso, a coleção de valores de T2 é simples e não requer um técnico profissional de laboratório.
No futuro, será prosseguida colaboração com engenheiros químicos e biológicos para a concepção de um dispositivo mais portátil, portátil que pode ser usado para a deteção fluorescente e magnética de contaminação bacteriana usando MFnS. O desenvolvimento de um dispositivo menor ajudaria a reduzir os custos associados a esta plataforma de deteção ainda mais e aumentar a sua eficácia no campo. Além disso, esta plataforma tem potencial para ser usado para analisar a eficácia do desenvolvimento de agentes biocidas. Como mostrado em nossos dados, nossos MFnS só foram capazes de vincular com bactérias vivem-alvo e não produzido pouco ou nenhum sinal quando incubadas com calor-matou as bactérias. Com esta base, nossa plataforma poderia ser usada para testar a eficácia dos candidatos de biocida, e pretendemos explorar isso ainda mais no futuro.
Passos críticos neste protocolo incluem a síntese inicial de MFnS e recolha de dados de T2. É importante purificar corretamente os MFnS para garantir que anticorpos flutuantes não interfiram com coleta de dados de T2. Além disso, a quantidade de MFnS colocados em cada amostra deve ser consistente, como alterações na concentração MFnS irão alterar os valores de T2, arriscando falsos positivos/negativos.
Em conclusão, MFnS são um novo passo em frente na luta contra a contaminação bacteriana e continuará a ser desenvolvidas como o direcionamento de patógenos adicionais é alcançado e o design mais portátil máquinas é perseguida. O baixo custo e baixa complexidade associada com o uso de MFnS torna um candidato viável para ser utilizado para detecção no local de contaminação bacteriana. Enquanto a síntese destes nanosensors requer preparação cuidadosa, seu uso real é relativamente simples e lhes dá a possibilidade de redução transmitidas por alimentos e doenças transmitidas pela água. Com maior desenvolvimento, a implementação destes nanosensors pode ser vista na exibição de reservatórios de água e alimentos em embalagens sites, pontos de venda e talvez até mesmo casas comercialmente produzidos.
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Disclosures
A aplicação demonstrada esta nanotecnologia ainda não está aprovada pelo FDA.
Acknowledgments
Este trabalho é apoiado pelo K-INBRE P20GM103418, da Comissão de soja Kansas (KSC/PSU 1663), ACS PRF 56629-UNI7 e PSU polímero química inicialização, só para SS. Agradecemos a cinegrafista da Universidade, Sr. Jacob Anselmi, pelo seu excelente trabalho com o vídeo. Agradecemos também o Sr. Roger Heckert e Sra. Katha Heckert pelo seu generoso apoio para a investigação.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ferrous Chloride Tetrahydrate | Fisher Scientific | I90-500 | |
| Ferric Chloride Hexahydrate | Fisher Scientific | I88-500 | |
| Ammonium Hydroxide | Fisher Scientific | A669S-500 | |
| Hydrochloric Acid | Fisher Scientific | A144S-500 | |
| Polyacryllic Acid | Sigma-Aldrich | 323667-100G | |
| EDC | Thermofisher Scientific | 22980 | |
| NHS | Fisher Scientific | AC157270250 | |
| Anti-E. coli O111 antibody | sera care | 5310-0352 | |
| Anti-E. coli O157:H7 antibody [P3C6] | Abcam | ab75244 | |
| DiI Stain | Fisher Scientific | D282 | |
| Nutrient Broth | Difco | 233000 | |
| Freeze-dried E. coli O157:H7 pellet | ATCC | 700728 | |
| Magnetic Relaxomteter | Bruker | mq20 | |
| Zetasizer | Malvern | NANO-ZS90 | |
| Plate Reader | Tecan | Infinite M200 PRO | |
| Magnetic Column | QuadroMACS | 130-090-976 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5804 Series | |
| Centrifuge (accuSpin Micro 17) | Fisher Scientific | 13-100-676 | |
| Floor Model Shaking Incubator | SHEL LAB | SSI5 | |
| Analytical Balance | Metler Toledo | ME104E | |
| Digital Vortex Mixer | Fisher Scientific | 02-215-370 | |
| Open-Air Rocking Shaker | Fisher Scientific | 02-217-765 |
References
- Law, J. W., Ab Mutalib, N. S., Chan, K. G., Lee, L. H. Rapid methods for the detection of foodborne bacterial pathogens: principles, applications, advantages and limitations. Front Microbiol. 5, 770 (2014).
- Pandey, P. K., Kass, P. H., Soupir, M. L., Biswas, S., Singh, V. P. Contamination of water resources by pathogenic bacteria. AMB Express. 4, 51 (2014).
- Zhao, X., Lin, C. W., Wang, J., Oh, D. H. Advances in rapid detection methods for foodborne pathogens. J Microbiol Biotechnol. 24 (3), 297-312 (2014).
- Heithoff, D. M., et al. Intraspecies variation in the emergence of hyperinfectious bacterial strains in nature. PLoS Pathog. 8 (4), e1002647 (2012).
- Ishii, S., Sadowsky, M. J. Escherichia coli in the Environment: Implications for Water Quality and Human Health. Microbes Environ. 23 (2), 101-108 (2008).
- Chiou, C. S., Hsu, S. Y., Chiu, S. I., Wang, T. K., Chao, C. S. Vibrio parahaemolyticus serovar O3:K6 as cause of unusually high incidence of food-borne disease outbreaks in Taiwan from 1996 to 1999. J Clin Microbiol. 38 (12), 4621-4625 (2000).
- Zhou, G., et al. PCR methods for the rapid detection and identification of four pathogenic Legionella spp. and two Legionella pneumophila subspecies based on the gene amplification of gyrB. Appl Microbiol Biotechnol. 91 (3), 777-787 (2011).
- Chen, J., Tang, J., Liu, J., Cai, Z., Bai, X. Development and evaluation of a multiplex PCR for simultaneous detection of five foodborne pathogens. J Appl Microbiol. 112 (4), 823-830 (2012).
- LeBlanc, J. J., et al. Switching gears for an influenza pandemic: validation of a duplex reverse transcriptase PCR assay for simultaneous detection and confirmatory identification of pandemic (H1N1) 2009 influenza virus. J Clin Microbiol. 47 (12), 3805-3813 (2009).
- Mahony, J. B., Chong, S., Luinstra, K., Petrich, A., Smieja, M. Development of a novel bead-based multiplex PCR assay for combined subtyping and oseltamivir resistance genotyping (H275Y) of seasonal and pandemic H1N1 influenza A viruses. J Clin Virol. 49 (4), 277-282 (2010).
- Alvarez, M. M., et al. Specific recognition of influenza A/H1N1/2009 antibodies in human serum: a simple virus-free ELISA method. PLoS One. 5 (4), e10176 (2010).
- Huang, C. J., Dostalek, J., Sessitsch, A., Knoll, W. Long-range surface plasmon-enhanced fluorescence spectroscopy biosensor for ultrasensitive detection of E. coli O157:H7. Anal Chem. 83 (3), 674-677 (2011).
- Zhang, J., et al. Rapid visual detection of highly pathogenic Streptococcus suis serotype 2 isolates by use of loop-mediated isothermal amplification. J Clin Microbiol. 51 (10), 3250-3256 (2013).
- Han, F., Wang, F., Ge, B. Detecting potentially virulent Vibrio vulnificus strains in raw oysters by quantitative loop-mediated isothermal amplification. Appl Environ Microbiol. 77 (8), 2589-2595 (2011).
- Wang, J., et al. Rapid detection of pathogenic bacteria and screening of phage-derived peptides using microcantilevers. Anal Chem. 86 (3), 1671-1678 (2014).
- Banerjee, T., et al. Multiparametric Magneto-fluorescent Nanosensors for the Ultrasensitive Detection of Escherichia coli O157:H7. ACS Infect Dis. 2 (10), 667-673 (2016).
- Shelby, T., et al. Novel magnetic relaxation nanosensors: an unparalleled "spin" on influenza diagnosis. Nanoscale. 8, 19605-19613 (2016).
- Bui, M. P., Ahmed, S., Abbas, A. Single-Digit Pathogen and Attomolar Detection with the Naked Eye Using Liposome-Amplified Plasmonic Immunoassay. Nano Lett. 15 (9), 6239-6246 (2015).
- Farnleitner, A. H., et al. Rapid enzymatic detection of Escherichia coli contamination in polluted river water. Lett Appl Microbiol. 33 (3), 246-250 (2001).
- Huh, Y. S., Lowe, A. J., Strickland, A. D., Batt, C. A., Erickson, D. Surface-enhanced Raman scattering based ligase detection reaction. J Am Chem Soc. 131 (6), 2208-2213 (2009).
- Jayamohan, H., et al. Highly sensitive bacteria quantification using immunomagnetic separation and electrochemical detection of guanine-labeled secondary beads. Sensors (Basel). 15 (5), 12034-12052 (2015).
- Kaittanis, C., Naser, S. A., Perez, J. M. One-step, nanoparticle-mediated bacterial detection with magnetic relaxation. Nano Lett. 7 (2), 380-383 (2007).
- Meeker, D. G., et al. Synergistic Photothermal and Antibiotic Killing of Biofilm-Associated Staphylococcus aureus Using Targeted Antibiotic-Loaded Gold Nanoconstructs. ACS Infect Dis. 2 (4), 241-250 (2016).
- Wang, Y., Ye, Z., Si, C., Ying, Y. Subtractive inhibition assay for the detection of E. coli O157:H7 using surface plasmon resonance. Sensors (Basel). 11 (3), 2728-2739 (2011).
- Zhao, X., et al. A rapid bioassay for single bacterial cell quantitation using bioconjugated nanoparticles. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (42), 15027-15032 (2004).
