Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

ויזואליזציה של דפוס היטל אקסונל של נוירונים מוטוריים עובריים ב Published: June 16, 2017 doi: 10.3791/55830
Automatic Translation
1
1Department of Molecular Biology, Chonbuk National University

Summary

עבודה זו מפרטת שיטת אימונוהיסטוכימיה סטנדרטית כדי לדמיין תחזיות נוירונים מוטוריים של שלב מאוחר 16 תסיסנית עוברי melanogaster . הכנת הפילה של עוברי קבוע מוכתמים נוגדן FasII מספק כלי רב עוצמה לאפיין את הגנים הנדרשים עבור pathoninding האקסון המנוע ואת ההכרה היעד במהלך התפתחות עצבית.

Abstract

הקמת מעגלים neuromuscular תפקודית מסתמך על קשרים מדויקים בין פיתוח אקסונים המנוע השרירים היעד. נוירונים מוטוריים מרחיבים את קונוסים הצמיחה לנווט לאורך נתיבים ספציפיים על ידי תגובה למספר רב של רמזים הדרכה האקסון הנובעים מהסביבה החוץ תאיים שמסביב. זיהוי קונוס יעד הכרה גם משחק תפקיד קריטי neuromuscular הספציפיות. עבודה זו מציגה פרוטוקול אימונוהיסטוכימיה סטנדרטי לדמיין תחזיות נוירון המנוע של מאוחר בשלב 16 תסיסנית עוברי melanogaster . פרוטוקול זה כולל כמה שלבים עיקריים, כולל הליך genotyping, כדי למיין את העוברים מוטציה הרצוי; הליך immunostaining, כדי לתייג עוברי עם פאסיקלין II (FasII) נוגדן; ו הליך לנתיחה, כדי לייצר ההכנות filleted מעוברים קבועים. תחזיות האקסון מוטוריים דפוסי שרירים בפריפריה הם דמיינו הרבה יותר טוב בהכנות שטוחות של עוברים filleted מאשר whOLE-mount עוברי. לכן, הכנת הפילה של עוברי קבוע מוכתם נוגדן FasII מספק כלי רב עוצמה כדי לאפיין את הגנים הנדרשים עבור pathoninding האקסון pathfinding וזיהוי היעד, וזה יכול להיות מיושם גם אובדן של פונקציה ואת הרווח של תפקוד גנטי מסכי .

Introduction

חיבורים מדויקים וסלקטיביים בין אקסונים המנוע ושרירי היעד במהלך התפתחות עובריים חיוניים לתנועה רגילה בזחלים תסיסנית . דפוס עוברי של 30 סיבי שריר בכל אחת hemisements הבטן A2-A7 הוקמה על ידי שלב 16 1 . 36 נוירונים המוטוריים הנוצרים חוט העצבים הגחון להרחיב את האקסונים שלהם לתוך הפריפריה כדי innervate מטרה ספציפית השרירים 2 . מנוע pathoninding האקסון וזיהוי היעד יכול להיות דמיינו על ידי אימונוהיסטוכימיה עם נוגדן (נוגדנים עכבר חד שבטיים 1D4) 3 , 4 . תמונות מרובות של דפוסי המנוע האקסון היטל בעוברים wildtype זמינים באינטרנט 5 . תווית 1D4 תוויות כל אקסונים המנוע שלושה קווים האקסון האורך על כל צד של קו האמצע של מערכת העצבים המרכזית העצבית (CNS) 4 , 6 ( איור 1C ו איור 2 א ). לכן, אימונוהיסטוכימיה עם נוגדנים FasII מספק כלי רב עוצמה לזיהוי גנים הדרושים עבור קישוריות neuromuscular להפגין את המנגנונים המולקולריים בבסיס הדרכה האקסון המנוע ואת ההכרה היעד.

בכל אחד מההתעמלות הבטן A2-A7, פרוייקט האקסונים המוטוריים, ונסלק באופן סלקטיבי לשני ענפים עצביים עיקריים, העצב הסגמנטלי (SN) והעצב הבין-גופי (ISN) , 2 , 4 וענף עצבים קטן, העצב הרוחבי (TN ) 7 . ה- SN מבטל באופן סלקטיבי ליצור שני ענפים עצביים הנקראים SNa ו- SNC, בעוד שה- ISN מתחלק לשלושה ענפים עצביים הנקראים ISN, ISNb ו- ISNd 2 , 4 . ביניהם, ISN, ISNb, ו SNA המנוע האקסוןדפוסי הקרנה הם דמיינו במדויק כאשר בשלב מאוחר 16 עוברי מוכתמים נוגדן FasII והם filleted ( איור 1C ו איור 2 א ). נוירונים המנוע ISN להרחיב את האקסונים שלהם innervate שרירי הגב 1, 2, 3, 4, 9, 10, 11, 18, 19, ו 20 2 , 4 ( איור 2 א ). הנוירונים המנוע ISNb innervate השרירים ventrolateral 6, 7, 12, 13, 14, 28, ו 30 2 , 4 ( איור 2 א ו -2 ב). הענף SNa עצב פרויקטים innervate השרירים לרוחב 5, 8, 21, 22, 23, ו 24 2 , 4 ( איור 2 א ). TN, אשר מורכב משני אקסונים המנוע, פרויקטים ipsilaterally לאורך הגבול המגזרי כדי innervate שריר 25 ועושה סינפסות עם נוירון דנדריטי דו קוטבית לרוחב (LBD) בפריפריה 7 ( איור 2 א ). אלה entervations שרירים היעד דורשים לא רק defasciculation סלקטיבי של אקסונים המנוע בנקודות בחירה ספציפיות, אלא גם לכוון הכרה שריר. בנוסף, חלק מהמסלולים של ה- ISN ו- SNa, אך לא לאורך מסלול ISNb. זה עשוי להצביע על כך ISNb המנוע axon pathfinding יכול להיות מוסדר באופן שונה לעומת ISN ו SNA המנוע האקסון הדרכה, והוא גם מציין כי ההנחיה האקסון המנוע ההיקפי מספק מודל ניסיוני אטרקטיבי ללמוד את ההפרש או שימור תפקידים של רמז הדרכה אחת מולקולה 8 .

עבודה זו מציגה שיטה סטנדרטית כדי לדמיין את דפוסי היטל אקסונל של נוירונים מוטוריים עובריים תסיסנית . הפרוטוקולים המתוארים כוללים כיצד לנתח עוברי קבוע מוכתם 1D4 אNtibody ומעובד ב -3.3 'diaminobenzidine (DAB) להכנת ההכנות. יתרון קריטי אחד של ההכנות השטוח של עוברי קבוע הוא הדמיה טובה יותר של תחזיות axonal ודפוסי שרירים בפריפריה. יתר על כן, עבודה זו גם מראה כיצד גנוטיפ עוברי קבוע כדי למיין את העוברים מוטציה הרצוי באמצעות שיטת מכתים LacZ.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. הכנה

  1. הכן 500 מ"ל של פוספט שנאגרו מלוחים (PBS) עם תמיסת t-Octylphenoxipolyethoxyethoxyethoxol (PBT) על ידי הוספת 0.5 גרם של אלבומין בסרום בסרום (BSA) ו 0.5 מ"ל של t-Octylphenoxypolyethoxyethanol (ראה טבלה של חומרים) ל 500 מ"ל של 1X PBS ו ערבוב לפחות 30 דקות. חנות ב 4 ° C. השתמש כאשר טרי יחסית לאחסן את הפתרון בבקבוק נקי.
  2. הפוך 10 מ"ל של paraformaldehyde 10% על ידי הוספת 2.5 מ"ל של פתרון המניה paraformaldehyde 16% ו 1 מ"ל של 10x PBS ל 6.5 מ"ל של מים deionized. חנות ב 4 ° C ולהשתמש בתוך שבוע.
    זהירות: הימנע מגע עור עם פתרון paraformaldehyde כי זה רעיל מאוד.
  3. הפוך X-Gal המצע (10% w / v X-Gal ב sulfoxide דימתיל (DMSO)) על ידי המסת 0.1 גרם של המצע X-Gal לכל 1 מ"ל של DMSO. חנות ב -20 מעלות צלזיוס ב 100 aliquots μL.
  4. הפוך X-Gal מכתים פתרון באמצעות 10 חיץ פוספט מ"מ (pH 7.2), 150 מ"מ NaCl, 1 מ"מ MgCl 2 , 3 מ 'ח"כ 4 [FeII (CN) 6 ], 3 מ"מ K 3 [FeIII (CN) 6 ], ו- 0.3% t-Octylphenoxypolyethoxyethoxol. חנות ב 4 ° C בחושך.
  5. הפוך 3% מי חמצן פתרון על ידי דילול 30% מימן מי חמצן 01:10 עם מים deionized.
  6. הפוך את הפתרון של D3 3-diaminobenzidine (DAB) על ידי התמוססות מלאה של טבליה אחת (10 מ"ג) של DAB ב -35 מ"ל של תמיסת PBT טרייה. מסנן דרך מסנן 0.2-מיקרומטר מזרק ולאחסן ב -20 מעלות צלזיוס ב 910 aliquots μL.
    זהירות: השלך את כל פסולת ה- DAB באקונומיקה כדי להרוס את ה- DAB.
  7. להכין צלחות ביצה עם מיץ תפוחים. הוסף 35 גרם של אגר ו 1 ליטר של מים deionized בקבוק 2 L. הוסף 33 גרם סוכרוז, 2 גרם של tegosept, ו 375 מ"ל של מיץ תפוחים בקבוק 1 - L. ממיסים אותם על ידי מעוקר במשך 30 דקות. אפשר לשני הפתרונות להתקרר לכ -60 מעלות צלזיוס. שלב ומערבבים את הפתרונות הללו היטב על ידי ערבוב. יוצקים ~ 11 מ"ל של פתרון משולב לכל צלחת 60 מ"מ תרבות.
  8. הכנת שמרים על ידי ערבוב בייקר yeaSt לתוך מים deionized (יחס 1: 0.8) ולאחסן ב 4 ° C.

2. אוסף העובר (יום 1)

  1. איסוף זבובים צעירים זכר ונקבה (מתחת 5 ימים), ולמשך 1-2 ימים, לשמור אותם בכלוב כוס פלסטיק עם צלחת ביצה (60 מ"מ x 15 מ"מ) המכיל כמות קטנה של להדביק שמרים במרכז.
  2. עבור האוסף המיטבי של העוברים בשלב 16 מאוחר, להקים כלוב בקבוק עם זבובים (> 50) בסביבות 5 בערב ולתת להם להטיל ביצים על 25 מעלות צלזיוס למשך 3 שעות.
  3. מעבירים את הזבובים לבקבוק מזון טרי.
  4. סגור את צלחת ביצה עם המכסה דגירה אותו במהופך על 25 מעלות צלזיוס חממה humidified (~ 70% לחות) בן לילה.

3. הכנת עוברים עבור Immunostaining (יום 2)

  1. הוסף 1.8 מ"ל של פתרון PBT על צלחת ביצה בסביבות 10:20 בבוקר ולהשתמש צמר גפן כדי לשחרר את העוברים מהצלחת תוך הטיה זה.
    הערה: על ידי בעדינות מוחץ את הדבק שמרים באמצעות cottעל ספוגית, להמיס אותו למקרה מספר רב של עוברים נמצאים על זה. להתחיל לאסוף את העוברים ~ 40 דקות לפני קיבעון (בסביבות 11:00 בבוקר).
  2. מעבירים את העוברים מהצלחת ביצה ל microtube 1.5 מ"ל באמצעות טיפ פיפטה 1 מ"ל.
  3. אפשר העוברים להתיישב ולשאוב את הפתרון PBT ככל האפשר. שוטפים את העוברים פעמיים עם 1 מ"ל של פתרון PBT. לשאוב את הפתרון PBT ככל האפשר.
  4. ממלאים את הצינור עם 1 מ"ל של אקונומיקה 50% ( כלומר, מדולל במים deionized) ו dechorionate העוברים על ידי דוגרים אותם על nutator במשך 3 דקות בטמפרטורת החדר (RT).
    הערה: שלב זה אינו הורג את העוברים dechorionated.
  5. אפשר עוברים dechorionated להתיישב, לשאוב את אקונומיקה 50% ככל האפשר, ולשטוף את העוברים 3 פעמים עם 1 מ"ל של פתרון PBT.
  6. הוסף 0.5 מ"ל של heptane ולאחר מכן להוסיף 0.5 מ"ל של פתרון paraformaldehyde 4% לצינור בשעה RT בסביבות 11:00 בבוקר.
  7. דגירהעוברי על nutator במשך 15 דקות ב RT.
  8. הסר את הפתרון paraformaldehyde 4% (השכבה התחתונה).
  9. הוסף 0.5 מ"ל של מתנול 100% ו devitellinize את העוברים על ידי רועד את הצינור במרץ עבור 30 s.
  10. הסר את heptane ( כלומר, השכבה העליונה).
  11. הוסף 0.5 מ"ל של מתנול 100% ולנער את הצינור במרץ עבור 10 s.
  12. אפשר העוברים להתיישב על ידי הקשה על הצינור לשאוב את המתנול ככל האפשר. שוטפים את העוברים עם 1 מ"ל של מתנול 100%, רועד במשך פחות מ 10 s.
    הערה: חשיפה ממושכת למתנול הורסת פעילות β-Gal.
  13. הסר את המתנול ולשטוף את העוברים devitellinized 3 פעמים עם 1 מ"ל של פתרון PBT.

4. Genotyping עוברים באמצעות מכתים LacZ (יום 2)

  1. הוסף 1 מ"ל של פתרון PBT לצינור דגירה הצינור בבלוק חום 37 מעלות צלזיוס או אמבט מים במשך 15 דקות.
  2. במהלך הדגירה, במקום X-Gal מכתים פתרון (1 מ"ל לכל tuלהיות) על 65 מעלות צלזיוס באמבט מים עד שהוא מקבל מעונן. דגירה אותו אמבט מים 37 מעלות צלזיוס.
  3. לשאוב את הפתרון PBT ולהוסיף 1 מ"ל של פתרון X-Gal מכתים ו 20 μL של המצע X-Gal לצינור.
  4. דגירה הצינור על 37 מעלות צלזיוס עם האגוז עד משקע כחול ניכרת.
    הערה: זמן הדגירה של 2 nd ו 3 Balders כחול כחול באופן כללי נע בין 2-4 שעות.
  5. הסר את הפתרון X-Gal מכתים ולשטוף את העוברים 3 פעמים עם 1 מ"ל של פתרון PBT RT.
  6. באמצעות בדיקה מחט או מלקחיים, יד למיין את העוברים של הגנוטיפ הרצוי ( כלומר, עוברי לבן מוכתם) עם מיקרוסקופ אור לנתח (מטרות 1.6X-2.5X).
    הערה: מאז כמה Balancers כחול, כגון CyO, actin-LacZ ו TM3, actin-LacZ , לשאת מבנה מהונדס להביע חיידקים β-Gal (LacZ) תחת שליטתו של האמרגן אקטין , עוברים מוכתמים כחול בכל מקום להכילעותק אחד או שניים של כרומוזומים של איזון כחול. לכן, לא מוכתמים לבן עוברי הם הומוזיגיים עבור אלל הרצח הרצוי.

5. Immunostaining של עוברים עם אנטי פסיקלין II נוגדנים (יום 2-3)

  1. איסוף ולהעביר את העוברים של הגנוטיפ הרצוי ( כלומר, עוברי לבן מוכתם) כדי microtube 0.5 מ"ל באמצעות טיפ פיפטה 1 מ"ל.
    הערה: בשלב זה, העוברים יכולים להיות מבוים בערך על פי קריטריונים מורפולוגיים, כולל דפוסי פילוח של לציפורן ואת המבנים של הראש והזנב 9 . במהלך פיתול הראש, בין 10 ל 16 שעות לאחר הביצים מוטלות, העובר עובר ירידה בולטת של קטע הקדמי ביותר 9 .
  2. שטפו את העוברים פעם עם 0.4 מ"ל של פתרון PBT ולהוסיף 0.3 מ"ל של תמיסת חסימה (5% בסרום עזים נורמלי 5% DMSO בפתרון PBT).
  3. לחסום את העוברים עם אגוז ב RT במשך 15 דקות.
  4. שטפו את העוברים 4 פעמים עם 0.4 מ"ל של פתרון PBT לפחות 20 דקות לכל לשטוף.
  5. הוסף 0.3 מ"ל של פתרון חסימה (5% בסרום עזים נורמלי ב PBT פתרון) המכיל עז נגד נוגדנים העכבר HRP (2 מיקרוגרם / מ"ל) ו דגירה של הצינור עם אגוז ב RT לילה.
  6. שטפו את העוברים 6 פעמים עם 0.4 מ"ל של פתרון PBT לפחות 20 דקות לכל לשטוף.
  7. הוסף 0.3 מ"ל של תמיסת DAB לצינור.
    זהירות: ללבוש כפפות ולמקם את כל DAB פסולת / צינורות / טיפים אקונומיקה.
  8. הוסף 2 μL של מי חמצן 3% ו דגירה הצינור בחושך עם אגוז ב RT עד הכמות הרצויה של משקע מיוצר.
    הערה: זמן הדגירה של 1D4 אימונוהיסטוכימיה נע בין 0.5-1 h.
  9. שטפו את העוברים 4 פעמים עם 0.4 מ"ל של פתרון PBT.
    זהירות: הסר את הפתרון DAB ואת שני שוטף הראשון עם פיפטה ו diלגרד אותם אקונומיקה.
  10. הוסף 0.2 מ"ל של הרכבה 70% גליצרול / פתרון PBS לצינור חנות ב- RT או 4 ° C.
    הערה: הרחק את הצינור מהאור. תכשירים ברורים ניתן להשיג על ידי הנחת העוברים ב 90% גליצרול / פתרון PBS 10 . עם זאת, קשה יותר לנתח את העוברים מנקה ב תמיסת גליצרול 90% / PBS מאשר אלה מנקה ב גליצרול 70% / פתרון PBS 10 .

6. בימוי, ניתוח, הרכבה והדמיה של העוברים (יום 4)

  1. עבור הזמני, להעביר את העוברים equilibrated עם גליצרול 70% / PBS על שקופית זכוכית.
  2. איסוף בשלב מאוחר 16 עוברי כי יש קטע בטן 7 (A7), A8, ו A9 ISN עצבים מתכנסים לגעת אחד את השני או / ו יש midgut כי הוא מחולק לשלוש להקות.
    הערה: עוברי מוכתם 1D4 נוגדן יכול להיות מבוים על בסיס דפוסי היטל של ISN ו ISNb המנוע אקסונים. לאחר היציאה CNS, A7, A8, ו A9 ISN neRves של שלב מאוחר 16 עוברי להתכנס אחד את השני ולאחר מכן לסטות להרחבת הרחק החוצה את שרירי הגב (חץ בתרשים 1A ). באמצע שלב 16 עוברי, לעומת זאת, A7 עצבי ISN להרחיב במקביל עם A8 / A9 עצבים (סוגר מרובע באיור 1B ). בנוסף, הצירים ההקרנה של A6 עצבים ISNb (בניצב את השרירים ventrolateral) בשני hemisements מיושרים בערך עם הקצה האחורי של CNS אורך האקסון fascicles (החצים וקו בתרשים 1C ). קריטריונים מורפולוגיים אלה משתנים במקצת בין גנוטיפים שונים. לחלופין, עוברי יכול להיות מבוים מבוסס על המעי הגס 9 , 11 . לפני שלב 17, midgut יש צורה דמוית לב, ואילו midgut מחולק לשלוש להקות עד שלב 17 12 .
  3. לנתח את העוברים.
    1. באמצעות 1 מ 'L מזרק, להעביר כל העובר מתוך טיפת גליצרול במקום העובר הגחון- face כלפי מעלה. חותכים את החלק הקדמי על 1/4 של אורך הגוף ואת האזור האחורי ביותר ללא של אקסונים המנוע.
    2. באמצעות בדיקה מחט, להזיז את העובר לחתוך סוף מתוך ירידה גליצרול, רול לכוון אותו הגבי בצד למעלה, ומניחים אותו אופקית בשדה.
      הערה: כאשר העובר מועבר מתוך ירידה גליצרול, קצת גליצרול הקשורים העובר עושה את זה דביק.
    3. חותכים את העובר לאורך קו האמצע הגבי באמצעות מחט טונגסטן אחת יפה מאוד 13 . לעשות חתך קטן בקצה האחורי של העובר ולאחר מכן להמשיך לחתוך את קו האמצע הגב לכיוון הקדמי; חיתוך בכיוון ההפוך הוא גם בסדר.
    4. באמצעות בדיקה מחט, להזיז את העובר לחתוך קו האמצע לתוך טיפת גליצרול, למקם אותו בצד הגבי למעלה, לנתק את המעיים מקיר הגוף על ידי נפרש כל קיר הגוף בכיוון ventrolateral (אלכסוני) (2.5X אובייקטיבי).
      הערה: ודא כי קו האמצע הגבי הוא לחתוך באופן מלא, וכתוצאה מכך ההפרדה המוחלטת בין הקירות השמאלי והימני הגוף.
    5. בזהירות להזיז את העובר לחתוך קו האמצע מתוך טיפת גליצרול ולאחר מכן שכב שני דשי של קיר הגוף על שקופית הזכוכית באמצעות בדיקה מחט בסדר (אובייקטיבי 2.5X).
    6. באמצעות מחט טונגסטן דק מאוד, להסיר את האיברים הפנימיים מהעובר גזור על ידי דחיפת אותם רוחבית (אובייקטיבי 5X).
      הערה: תיאור מפורט יותר של הליך דומה לנתיחה ניתן למצוא באתר 5 .
  4. עבור הרכבה, להוסיף 2-3 μL של תמיסת גליצרול 70% / PBS לנקות, עוברי גזור ו, באמצעות בדיקה מחט בסדר, להעביר אותם שקופית זכוכית חדשה אל אילו μL 8 של פתרון גליצרול 70% / PBS כבר התפשט את המרכז (אובייקטיבי 2.5X).
  5. לשים על coverslip (18 מ"מ x 18 מ"מ). חותם את הקצוות של coverslip עם לק קבוע מסמר (אוברור או צבע בסדר).
  6. לכידת תמונות ברזולוציה גבוהה (20X, 40X, ו 63X מטרות טבילה שמן) תחת מיקרוסקופ אור דיפרנציאלי בניגוד (DIC) אור, על פי הוראות היצרן.
    הערה: הדמיה טובה יותר אפיון פנוטיפי, במיוחד עבור אקסונים המנוע ISNb, יכול להיות מיוצר באמצעות 63X שמן טבילה המטרה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

חיבורים מדויקים בין האקסונים המנועיים ושרירי היעד במהלך התפתחות העצבים תלויים בדחייה סלקטיבית של אקסון האקסון ובזיהוי מטרה בנקודות בחירה ספציפיות 4 . ב תסיסנית , דחייה סלקטיבית בין האקסונים המנוע הוא מוסדר בחלקו על ידי פעולה משולבת של סמפורינים מחלקה 1 ו 2 (Semas), כולל Sema-1a, Sema-2a, ו Sema-2b 8 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 . לכן, אובדן של פונקציה Sema-1a גורם לעיתים קרובות לכישלון של אקסונים של ISNb לנטרל נקודות בחירה מסוימות, ולגרום להם להציג מורפולוגיה עבה באופן חריג (ראש חץ באיור 2C ). בעוברים wildtype, לפחות 7 נוירונים המנוע להרחיב ו fasciculate האקסונים שלהם כדי ליצור אניענף עצב SNB ( איור 2 א ). כאשר הענף ISNb עצב מגיע לנקודת בחירה, הנמצא בין השרירים 6 ו 7, שני האקסונים סלקטיבי defasciculate מן צרור ISNb הראשי ולאחר מכן innervate השרירים 6 ו 7 ( איור 2 ב ). בנקודת הבחירה הבאה, הממוקמת בין השרירים 6, 13, 30, עוד שלושה אקסונים המנוע סלקטיבי defasciculate כדי innervate השרירים 13, 14, ו -30 ( איור 2 ב ). שני האקסונים הנותרים להאריך את הגב כדי להגיע לנקודת הבחירה האחרונה ליד קצה של שריר 12, ובכך innervating שריר 12 בכיוון ההפוך ( איור 2 ב ). תוצאות אלו מראות בבירור כי פרוטוקול הכנת הפרוטוקול מספק כלי שימושי לבדיקת הגנים הנדרשים להנחיית האקסון.

איור 1
א ) בשלב מאוחר 16 עוברי wildtype, A7, A8, ו A9 ISN עצבים (חיצים) להתכנס כדי לגעת אחד את השני (חץ). הקדמי הוא נותר הגחון הוא למטה. סרגל קנה מידה = 15 מיקרומטר. ( ב ) באמצע שלב 16 עוברי wildtype, העצם A7 ISN משתרע במקביל עם A8 / A9 עצבים (סוגר מרובע). חיצים מצביעים על עצבי A7, A8 ו- A9 ISN. הקדמי הוא נותר הגחון הוא למטה. סרגל קנה מידה = 15 מיקרומטר. ( ג ) הכנה שלבים מאוחרים שלב 16 עוברי wildtype מוכתם נוגדן FasII. היטל הצירים (חיצים) של A6 עצבי ימין ושמאל A6 ISNb מיושרים בקירוב עם הקצה האחורי של CNS אורך האקסון fascicles (קו שחור). מקטעי בטן A1-A7 מסומנים בחלק העליון. הקדמי נשאר. סרגל קנה מידה = 15 מיקרומטר. טַעֲנָהלחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2: דפוסי מנוע האקסון מוטוריים wild-type ו- Sema-1a עוברים מוטציה. ( A - C ) הכנה של שלבים מאוחרים שלב 16 מוכתם נוגדן FasII. הקדמי הוא נותר הגחון הוא למטה. דיאגרמות סכמטיות המציגות את דפוסי ההקרנה האקסונלית המיוצגים בכל פאנל. סולם ברים = 15 מיקרומטר. ( א ) צילום שדה בהיר של שני hemisegments הבטן רציף, A3 ו A4, בעוברים wildtype. שלושה צרורות האקסון אורך סימטרי בילטרלית נמצאים CNS. דפוסי העצבנות הרגילים של אקסונים, ISNA, SNN, ISN ו- TN, מסומנים בקופסאות ובחץ בפריפריה. הדנדריט הדו-קוטבי הדנדריט (LBD), אשר innervates שרירי אלרי, הוא אינדיקטורעל ידי ראש חץ. בתרשים סכמטי, ענבים העצבים ודפוסי העצבנות של ISNb (בחום), SNA (בכחול), ISN (בירוק), ו TN (בצהוב) נוירונים המוטוריים ואת שרירי היעד שלהם מוצגים. עמדות הגוף התא של נוירונים אלה המנוע CNS מוצגים גם בצבעים שלהם. ( ב ) בעוברים wildtype, פרוייקט אקסונים ISNb כדי השרירים ventrolateral, אשר ממוספרים, ו innervate אותם בנקודות בחירה ספציפיות (חיצים בתמונה DIC). ( ג ) ב - 1a - אובדן תפקוד מוטציות, ISNb אקסונים לעתים קרובות נכשלים defasciculate אחד מהשני בין השרירים 6 ו 13 (ראש חץ בתמונה DIC). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

הפרטים של פגמים ההנחיה האקסון המנוע הם הבקיע מהר יותר עם דיוק טוב יותר על ידי הכנת filleted של עוברי DAB מוכתם מאשר על ידי לייזר סריקה מיקרוסקופיה confocal של אלה שכותרתו fluorescently. לכן, הכנת filleted של עוברי קבוע 1D4 מוכתם הוא המתאים ביותר עבור אפיון פונקציונלי של מולקולות הדרכה cue. ארבעה סוגים עיקריים של רמזים להדרכה, כולל נטרינים, חריצים, סמפאורים (Semas), ואפרים, והקולטנים המובהקים שלהם שימרו באופן אבולוציוני תפקידים בתולעים, זבובים וחולייתנים. בין רובוט (רובו) מולקולות משפחתיות המשמשות קולטנים עבור חריצים, תסיסנית רובו זוהה לראשונה לתווך פונקציה הדרכה דוחה של CNS 6 , 21 . Semas הם משפחה גדולה של מולקולות הדרכה כי נקשרים לקומפלקסים קולטן המכילים פלקסין 22 . פונקציית ההדרכה של האקסון של סמסהתגלה לראשונה בחרגול CNS 14 . לאחר מכן, סוג 1 transmembrane Semahorin Sema-1a היה מאופיין נרחב תסיסנית . Sema-1a, אשר מתפקדת לא רק כמו ליגנד עבור Plexin A, אלא גם בתור קולטן ליגנד לא ידוע, ממלא תפקיד חשוב הדחייה האקסון אקסון בנקודות בחירה ספציפיות במהלך התפתחות העצבית עובריים 15 , 16 , 17 , 18 ( איור 2 ג ).

קיימים מספר שלבים נפוצים לפתרון בעיות שעלולים להתרחש בפרוטוקול הנוכחי. ראשית, בשלבים 3.9-3.13, העוברים יכולים להיות devitellinized עם יעילות נמוכה אם יותר מדי או קטן מדי עוברים משמשים בתהליך mitanol devitellinization. במקרה זה, מומלץ להשתמש בנפח מיטה של ​​40-80 μL של עוברי קבוע עבור devitellinization בשלב 3.5. שנית, ב stePS 3.9-3.13, חלש X-Gal מכתים יכול לקרות במקרה של חשיפה ממושכת יותר מתנול או הסרת heptane חלקית, שכן מתנול משמש מקבע הורסת פעילות β- גל. במקרה זה, עדיף כי הליך devitellinization באמצעות מתנול בשלבים 3.9-3.13 מבוצעת מהר ככל האפשר. בנוסף, heptane שיורית כי הוא solubilized ב מתנול עלול להפריע מכתים; לכן, מומלץ להסיר כמו מתנול ככל האפשר בשלבים 3.11-3.13.

פרוטוקול הכנה הנוכחי filleted יכול להיות מיושם על אובדן של תפקוד ו-רווח של תפקוד גנטי מסכי לזהות גנים חדשניים המעורבים מנוע axon המנוע pathfinding וזיהוי היעד. עם זאת, החיסרון של פרוטוקול זה הוא שזה די זמן כדי לנתח עוברי קבוע לייצר ההכנות filleted. כדי להתגבר על בעיה זו, אפיון פנוטיפי של תחזיות axonal ניתן לפקח על הר שלם הכנה של 1D4 מוכתמים אמבRyos, אם כי שיטה זו מספקת הדמיה ברזולוציה נמוכה של התחזיות אקסונל בפריפריה. עם זאת, כל פרוטוקול הכנה הוכחה הוכחה להיות גישה יעילה להקרנה גנים הדרכה האקסון 4 . פרוטוקול חלופי באמצעות דיסקציה חיה של עוברי שכותרתו fluorescently פותח לאחרונה עבור בדיקות שיטתי 11 . פרוטוקול לנתיחה לחיות מאפשר הכנה מהירה יחסית לניתוח פנוטיפי 11 . עם זאת, פרוטוקול זה אינו מתאים עבור עוברים ישנים יותר מתחילת שלב 17 11 .

פרוטוקול הכנת filleted המתואר כאן ניתן להשתמש כדי לבחון דפוסי ביטוי חלבון עם נוגדנים שונים. בנוסף, פרוטוקול זה יכול להיות מיושם גם על עוברים תסיסנית בשלבים שונים של פיתוח.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחבר מצהיר כי אין לו אינטרסים פיננסיים מתחרים.

Acknowledgments

אני מודה לאלכס ל. קולודקין, כפי שלמדתי את פרוטוקול הכנת הפרוזה במעבדה שלו. אני גם מודה יאנג הונג הונג על סיוע טכני. מחקר זה נתמך על ידי NRF-2013R1A1A4A01011329 (SJ).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A7906
Triton X-100 Sigma-Aldrich X100 t-Octylphenoxypolyethoxyethanol
16% Paraformaldehyde Solution Ted Pella 18505
Sodium Chloride Sigma-Aldrich S5886
Potassium Chloride Sigma-Aldrich P5405
Sodium Phosphate Dibasic Sigma-Aldrich 30435
Sodium Phosphate Monobasic Sigma-Aldrich 71500
X-Gal Substrate US Biological X1000 X-Gal (5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-b-D-galactoside galactopyranoside)
Dimethyl Sulfxide Sigma-Aldrich D4540
Magnesium Chloride Sigma-Aldrich M8266
Potassium hexacyanoferrate(II) trihydrate Sigma-Aldrich P9387
Potassium hexacyanoferrate(III) Sigma-Aldrich 244023
Hydrogen Peroxide Sigma-Aldrich 216763
3,3'-diaminobenzidine Tetrahydrochloride Sigma-Aldrich D5905
Agar US Biological A0930
Sucrose Fisher Scientific S5-3
Tegosept (Methy 4-Hydroxybenzoate) Sigma-Aldrich H5501
Culture Dish (60 mm) Corning 430166
Tricon Beaker Simport B700-100 This is used to make a plastic beaker cage for embryo collection.
Yeast Societe Industrielle Lesaffre Saf Instant Yeast Red
Cotton Swab (Wooden Single Tip Cotton PK100) VWR 14220-263
Eppendorf Tube (1.5 ml) Sarstedt #72.690
Bleach The Clorox Company Clorox
Heptane Sigma-Aldrich 246654
Methanol J.T. Baker UN1230
Normal Goat Serum Life Technologies 16210-064
Anti-FasciculinII Antibody Developmental Studies Hybridoma Bank 1D4 anti-Fasciclin II
Goat Anti-mouse-HRP Antibody Jackson Immunoresearch 115-006-068 AffiniPure F(ab')2 Fragment Goat Anti-Mouse IgG+IgM (H+L)
(min X Hu, Bov, Hrs Sr Prot
Glycerol Sigma-Aldrich G9012
Slide Glass Duran Group 235501403
Coverslip Duran Group 235503104 18 x 18 mm
1 ml Syringe Becton Dickinson Medical(s) 301321
Tungsten Needle Ted Pella #27-11 Tungsten Wire, ø0.13mm/6.1m (ø.005"/20 ft.)
Nutator (Mini twister) Korean Science KO.VS-96TWS Alternatively, BD Clay Adams Brand Nutator (BD 421125)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bate, M. The embryonic development of larval muscles in Drosophila. Development. 110 (3), 791-804 (1990).
  2. Landgraf, M., Thor, S. Development of Drosophila motoneurons: specification and morphology. Semin. Cell Dev. Biol. 17 (1), 3-11 (2006).
  3. Grenningloh, G., Rehm, E. J., Goodman, C. S. Genetic analysis of growth cone guidance in Drosophila: fasciclin II functions as a neuronal recognition molecule. Cell. 67 (1), 45-57 (1991).
  4. Vactor, D. V., Sink, H., Fambrough, D., Tsoo, R., Goodman, C. S. Genes that control neuromuscular specificity in Drosophila. Cell. 73 (6), 1137-1153 (1993).
  5. Zinn Lab. , California Institute of Technology. Available from: https://www.its.caltech.edu/~zinnlab/motoraxons.html (2017).
  6. Seeger, M., Tear, G., Ferres-Marco, D., Goodman, C. S. Mutations affecting growth cone guidance in Drosophila: genes necessary for guidance toward or away from the midline. Neuron. 10 (3), 409-426 (1993).
  7. Thor, S., Thomas, J. B. The Drosophila islet gene governs axon pathfinding and neurotransmitter identity. Neuron. 18 (3), 397-409 (1997).
  8. Roh, S., Yang, D. S., Jeong, S. Differential ligand regulation of PlexB signaling in motor neuron axon guidance in Drosophila. Int. J. Dev. Neurosci. 55, 34-40 (2016).
  9. Campos-Ortega, J. A., Hartenstein, V. The embryonic development of Drosophila melanogaster. , Springer-Verlag. New York. (1985).
  10. Patel, N. H. Imaging neuronal subsets and other cell types in whole mount Drosophila embryos and larvae using antibody probes. Methods in cell biology, vol 44. Drosophila melanogaster: practical uses in cell biology. Goldstein, L. S. B., Fyrberg, E. 44, Academic Press. New York. 445-487 (1994).
  11. Lee, H. K., Wright, A. P., Zinn, K. Live dissection of Drosophila embryos: streamlined methods for screening mutant collections by antibody staining. J. Vis. Exp. (34), (2009).
  12. Hartenstein, V. Stages of Embryonic Development. Atlas of Drosophila. development. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. Available from: http://www.sdbonline.org/sites/fly/atlas/52.htm 52 (1993).
  13. Brady, J. A simple technique for making very fine, durable dissecting needles by sharpening tungsten wire electrolytically. Bull. World Health Organ. 32 (1), 143-144 (1965).
  14. Kolodkin, A. L. Fasciclin IV: sequence, expression, and function during growth cone guidance in the grasshopper embryo. Neuron. 9 (5), 831-845 (1992).
  15. Jeong, S., Juhaszova, K., Kolodkin, A. L. The Control of semaphorin-1a-mediated reverse signaling by opposing pebble and RhoGAPp190 functions in Drosophila. Neuron. 76 (4), 721-734 (2012).
  16. Winberg, M. L. Plexin A is a neuronal semaphorin receptor that controls axon guidance. Cell. 95 (7), 903-916 (1998).
  17. Yang, D. S., Roh, S., Jeong, S. The axon guidance function of Rap1 small GTPase is independent of PlexA RasGAP activity in Drosophila. Dev. Biol. 418 (2), 258-267 (2016).
  18. Yu, H. H., Araj, H. H., Ralls, S. A., Kolodkin, A. L. The transmembrane Semaphorin Sema I is required in Drosophila for embryonic motor and CNS axon guidance. Neuron. 20 (2), 207-220 (1998).
  19. Hartenstein, V. Stages of Embryonic Development. Atlas of Drosophila. development. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. Available from: http://www.sdbonline.org/sites/fly/atlas/52.htm 52 (1993).
  20. Dickson, B. J. Molecular mechanisms of axon guidance. Science. 298 (5600), 1959-1964 (2002).
  21. Kidd, T. Roundabout controls axon crossing of the CNS midline and defines a novel subfamily of evolutionarily conserved guidance receptors. Cell. 92 (2), 205-215 (1998).
  22. Pasterkamp, R. J. Getting neural circuits into shape with semaphorins. Nat. Rev. Neurosci. 13 (9), 605-618 (2012).

Tags

Neuroscience גיליון 124 נוירון מוטורי הדרכה האקסון תסיסנית Immunostaining פיתוח עובריים Fasciclin II
ויזואליזציה של דפוס היטל אקסונל של נוירונים מוטוריים עובריים ב<em&gt; תסיסנית</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Jeong, S. Visualization of the… More

Jeong, S. Visualization of the Axonal Projection Pattern of Embryonic Motor Neurons in Drosophila. J. Vis. Exp. (124), e55830, doi:10.3791/55830 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter