Summary
Dette arbeidet beskriver en standard immunhistokjemi metode for å visualisere motor neuron projeksjoner av sent stadium-16 Drosophila melanogaster embryoer. Det fileterte preparatet av faste embryoer farget med FasII antistoff gir et kraftig verktøy for å karakterisere de gener som kreves for motorisk aksonopplæring og målgjenkjenning under nevrale utvikling.
Abstract
Etableringen av funksjonelle nevromuskulære kretser er avhengig av nøyaktige forbindelser mellom utviklende motoraxoner og målmuskler. Motorneuroner forlenker vekstkegler for å navigere langs bestemte veier ved å svare på et stort antall aksonveiledningsanvisninger som stammer fra det omgivende ekstracellulære miljøet. Vektkegle-målgjenkjenning spiller også en kritisk rolle i nevromuskulær spesifisitet. Dette arbeidet presenterer en standard immunhistokjemi protokoll for å visualisere motor neuron projeksjoner av sent stadium-16 Drosophila melanogaster embryoer. Denne protokollen inneholder noen få viktige trinn, inkludert en genotyping-prosedyre, for å sortere de ønskede mutantembryonene; En immunfremmende prosedyre for å merke embryoer med fasciclin II (FasII) antistoff; Og en disseksjonsprosedyre for å generere fileterte preparater fra faste embryoer. Motoraxonprojeksjoner og muskelmønstre i periferien er mye bedre visualisert i flate preparater av fileterte embryoer enn i whOle-mount embryoer. Derfor fyller det fileterte preparatet av faste embryoer som er farget med FasII-antistoff et kraftig verktøy for å karakterisere de gener som kreves for motorisk aksonoppfylling og målgjenkjenning, og det kan også brukes på både funksjonstabell og genetisk skjermforsterkning .
Introduction
Nøyaktige og selektive forbindelser mellom motorakser og målmuskler under embryonisk utvikling er avgjørende for normal fremdrift i Drosophila larver. Den embryonale mønsteret på 30 muskelfibre i hver av bukhemisegmentene A2-A7 er etablert ved trinn 16 1 . De 36 motorneuronene som genereres i den ventrale nerve ledningen, strekker deres axoner i periferien til å innervate bestemte målmuskler 2 . Motoraksonbanevinding og målgjenkjenning kan visualiseres ved immunhistokjemi med et antistoff (musmonoklonalt antistoff 1D4) 3 , 4 . Flere bilder av motoraxonprojeksjonsmønstrene i wildtype-embryoer er tilgjengelige på nettet 5 . 1D4-antistoffet merker alle motoraxoner og tre langsgående aksonfasikaler på hver side av midterlinjen av det sentrale nervesystemet (CNS) 4 , 6 ( figur 1C og figur 2A ). Derfor gir immunhistokjemi med FasII antistoff et kraftig verktøy for å identifisere gener som kreves for nevromuskulær tilkobling for å demonstrere molekylære mekanismer som ligger bak motorisk aksonveiledning og målgjenkjenning.
I hver av de abdominale hemisegmentene A2-A7, motoriske aksonsprosjektet og selektivt fasciculerer i to hovednerven, er segmentnerven (SN) og den intersegmentelle nerven (ISN) 2 , 4 og en mindre nervegren, den transversale nerveen (TN ) 7 . SN-selektivt defasciculates for å gi opphav til to nervegrener kalt SNa og SNc, mens ISN deler seg i tre nervegrener kalt ISN, ISNb og ISNd 2 , 4 . Blant dem, ISN, ISNb og SNa motor axonProjeksjonsmønstre blir mest nøyaktig visualisert når sent stadium 16 embryoer farves med FasII antistoff og er filetert ( figur 1C og figur 2A ). ISN-motorneuronene forlenker deres aksoner til indre dorsale muskler 1, 2, 3, 4, 9, 10, 11, 18, 19 og 20 2 , 4 ( figur 2A ). ISNb-motorneuronene innerverer ventrolaterale muskler 6, 7, 12, 13, 14, 28 og 30 2 , 4 ( figur 2A og 2B). SNa-nervegrenen prosjekterer å innervate laterale muskler 5, 8, 21, 22, 23 og 24 2 , 4 ( figur 2A ). TN, som består av to motoraxoner, prosjekterer ipsilateralt langs segmentgrensen til innervate muskel 25 og gjør synapser med den laterale bipolære dendritiske nevronen (LBD) iPeriferien 7 ( figur 2A ). Disse målmuskulaturinnervasjonene krever ikke bare selektiv defaskulering av motoraxoner på bestemte valgpunkter, men også målrettet mot muskelgjenkjenning. I tillegg er det funnet noen formodede mesodermale guidepostceller som fungerer som mellommål i både ISN og SNa-veiene, men ikke langs ISNb-vei 4 . Dette kan tyde på at ISNb-motorisk aksonopplæring kan reguleres på en tydelig måte i forhold til ISN- og SNa-motor-aksonveiledning, og det indikerer også at perifer motorisk axon-veiledning gir en attraktiv eksperimentell modell for å studere differensialet eller konserverte roller i en enkelt veilednings-cue Molekyl 8 .
Dette arbeidet presenterer en standard metode for å visualisere de aksonale projeksjonsmønstrene av embryonale motorneuroner i Drosophila . De beskrevne protokollene inkluderer hvordan man dissekerer faste fostre farget med 1D4 aNtibody og behandlet i 3,3'-diaminobenzidin (DAB) for fileterte preparater. En kritisk fordel ved de flate preparatene av faste embryoer er den bedre visualiseringen av de aksonale fremspringene og muskelmønstrene i periferien. Videre viser dette arbeidet også hvordan man genotype faste embryoer for å sortere de ønskede mutantembryonene ved hjelp av LacZ-farvemetoden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Fremstilling
- Tilbered 500 ml fosfatbuffert saltvann (PBS) med t-oktylfenoksypolyetoksyetanol (PBT) oppløsning ved å tilsette 0,5 g okseserumalbumin (BSA) og 0,5 ml t-oktylfenoksypolyetoksyetanol (se tabell over materialer) til 500 ml 1X PBS Og omrøring i minst 30 minutter. Oppbevares ved 4 ° C. Bruk når det er relativt friskt og oppbevar løsningen i en ren flaske.
- Lag 10 ml 4% paraformaldehyd ved å tilsette 2,5 ml 16% stock paraformaldehydoppløsning og 1 ml 10x PBS til 6,5 ml deionisert vann. Oppbevares ved 4 ° C og brukes innen en uke.
FORSIKTIG: Unngå hudkontakt med paraformaldehydoppløsning fordi det er svært giftig. - Lag X-Gal-substrat (10% v / v X-Gal i dimetylsulfoksid (DMSO)) ved å oppløse 0,1 g X-Gal-substrat per 1 ml DMSO. Oppbevares ved -20 ° C i 100 μl alikvoter.
- Lag X-Gal-fargeløsning ved bruk av 10 mM fosfatbuffer (pH 7,2), 150 mM NaCl, 1 mM MgCl2, 3 mMK4 [FeII (CN) 6 ], 3 mM K3 [FeIII (CN) 6 ] og 0,3% t-oktylfenoksypolyetoksyetanol. Oppbevares ved 4 ° C i mørket.
- Lag 3% hydrogenperoksidoppløsning ved å fortynne 30% lager hydrogenperoksid 1:10 med avionisert vann.
- Lag 3,3'-diaminobenzidin (DAB) løsning ved fullstendig oppløsning av 1 tablett (10 mg) DAB i 35 ml frisk PBT-løsning. Filter gjennom et 0,2 μm sprøytefilter og lagre ved -20 ° C i 910 μl alikvoter.
FORSIKTIG: Kast alt DAB-avfall i blekemiddel for å ødelegge DAB. - Lag eggplater med eplejuice. Tilsett 35 g agar og 1 liter avionisert vann til en 2 liter kolbe. Tilsett 33 g sukrose, 2 g tegosept og 375 ml eplejuice til en 1 liter kolbe. Smelt dem ved autoklavering i 30 minutter. La begge løsninger avkjøles til rundt 60 ° C. Kombiner og bland disse løsningene godt ved omrøring. Hell ~ 11 ml kombinert oppløsning per 60 mm dyrkingsfat.
- Gjør gjærpasta ved å blande baker jaSt i deionisert vann (1: 0,8 forhold) og lagre ved 4 ° C.
2. Embryo-samling (dag 1)
- Samle unge kvinnelige og mannlige fluer (yngre enn 5 dager), og i 1-2 dager, opprettholde dem i et plastbikerkar med en eggplate (60 mm x 15 mm) som inneholder en liten mengde gjærpasta i midten.
- For den optimale samlingen av senfase 16 embryoer, sett opp et flaskebur med fluer (> 50) klokken 17.00 og la dem legge egg ved 25 ° C i 3 timer.
- Overfør fluene til en fersk matflaske.
- Lukk eggplaten med lokket og inkuber det opp ned ved 25 ° C i en fuktig inkubator (~ 70% fuktighet) over natten.
3. Forberedelse av embryoer for immunforgiftning (dag 2)
- Tilsett 1,8 ml PBT-løsning til eggplaten rundt klokken 10:20 og bruk en bomullspinne for å løsne embryoene fra platen mens du tipper den.
Merk: Ved å forsiktig gjære gjærpastaen med en bomullPå pinnen oppløses det hvis et stort antall embryoer finnes på den. Begynn å samle embryoer ~ 40 min før fiksering (rundt kl. 11:00). - Overfør embryoene fra eggplaten til en 1,5 ml mikrotube ved hjelp av en 1 ml pipettespiss.
- La embryoene legge seg ned og aspirere PBT-løsningen så mye som mulig. Skyll embryoene to ganger med 1 ml PBT-løsning. Aspirer PBT-løsningen så mye som mulig.
- Fyll røret med 1 ml 50% blekemiddel ( dvs. fortynnet i avionisert vann) og dekstrer embryoene ved å inkubere dem på en nøtter i 3 minutter ved romtemperatur (RT).
Merk: Dette trinnet dreper ikke de deksjonerte embryoer. - Tillat deksorterte embryoer å slå seg ned, aspirere 50% blekemiddel så mye som mulig, og skyll embryoene 3 ganger med 1 ml PBT-løsning.
- Tilsett 0,5 ml heptan og tilsett deretter 0,5 ml 4% paraformaldehydoppløsning til røret ved klokka omkring kl. 11:00.
- InkubereEmbryoer på en nøtter i 15 minutter ved RT.
- Fjern 4% paraformaldehydoppløsningen (bunnlaget).
- Tilsett 0,5 ml 100% metanol og devitellinize embryoene ved å riste røret kraftig i 30 s.
- Fjern heptan ( dvs. topplaget).
- Tilsett 0,5 ml 100% metanol og rist røret kraftig i 10 s.
- La embryoene slå seg ned ved å tappe på røret og aspirere metanolen så mye som mulig. Skyll embryoene med 1 ml 100% metanol, rist i mindre enn 10 s.
Merk: Utvidet eksponering for metanol ødelegger β-Gal-aktivitet. - Fjern metanolen og skyll de devitelliniserte embryoene 3 ganger med 1 ml PBT-løsning.
4. Genotyping av embryoene ved bruk av LacZ-farging (dag 2)
- Tilsett 1 ml PBT-løsning på røret og inkuber røret i en 37 ° C varmeblokk eller vannbad i 15 minutter.
- Under inkubering, plasser X-Gal-fargeløsning (1 ml per tuVær) ved 65 ° C i et vannbad til det blir skyet. Inkuber det i et 37 ° C vannbad.
- Aspirer PBT-løsningen og tilsett 1 ml X-Gal-fargeløsning og 20 μl X-Gal-substrat til røret.
- Inkuber røret ved 37 ° C med næring til et blått bunnfall er tydelig.
Merk: Inkubasjonstiden for de 2 nd og 3 r blå balancere generelt varierer fra 2-4 timer. - Fjern X-Gal-fargeløsningen og skyll embryoene 3 ganger med 1 mL RT PBT-løsning.
- Ved hjelp av en nålesonde eller pincett, sortere embryoene av ønsket genotype ( dvs. ikke-fargede hvite embryoer) med et lysdisseksjonsmikroskop (1.6X-2.5X mål).
Merk: Siden noen blå balancere, slik som CyO, actin-LacZ og TM3, actin-LacZ , bærer en transgen konstruktivt uttrykkende bakteriell p-Gal (LacZ) under kontroll av aktinpromotoren, inneholder embryoer farget blå på allestedsnærværende måteEn eller to kopier av blå balanser kromosomer. Derfor er ikke-fargede hvite embryoer homozygote for den ønskede dødelige allelen.
5. Immunostaining av embryoer med anti-fasciklin II-antistoffer (dag 2-3)
- Samle og overfør embryoene til ønsket genotype ( dvs. ikke-fargede hvite embryoer) til en 0,5 ml mikrotube ved hjelp av en 1 ml pipettespiss.
Merk: I dette trinnet kan embryoene være grovt iscenesatt i henhold til morfologiske kriterier, herunder segmenteringsmønster av kutikula og strukturer av hode og hale 9 . Under hodeinvolusjon, mellom 10 og 16 timer etter at eggene er lagt, gjennomgår embryoen en markert reduksjon av det fremre segmentet 9 . - Vask embryoene en gang med 0,4 ml PBT-løsning og tilsett 0,3 ml blokkeringsløsning (5% normalt geirserum og 5% DMSO i PBT-løsning).
- Blokker embryoer med næring ved RT i 15 minutter.
- Vask embryoene 4 ganger med 0,4 ml PBT-løsning i minst 20 minutter per vask.
- Tilsett 0,3 ml blokkeringsoppløsning (5% normalt geitserum i PBT-oppløsning) som inneholder geit-anti-mus-HRP-antistoff (2 μg / ml) og inkuber røret med næring ved romtemperatur over natten.
- Vask embryoene 6 ganger med 0,4 ml PBT-løsning i minst 20 minutter per vask.
- Tilsett 0,3 ml DAB-oppløsning til røret.
FORSIKTIG: Bruk hansker og plasser alle DAB-avfall / rør / tips i blekemiddel. - Tilsett 2 μL 3% hydrogenperoksid og inkuber røret i mørket med næring ved RT til den ønskede mengde presipitat er produsert.
Merk: Inkubasjonstiden for 1D4 immunhistokjemi generelt varierer fra 0,5-1 timer. - Vask embryoene 4 ganger med 0,4 ml PBT-løsning.
FORSIKTIG: Fjern DAB-løsningen og de to første vasker med en pipette og diSkjære dem i blekemiddel. - Tilsett 0,2 ml montering 70% glycerol / PBS løsning til røret og lagre ved RT eller 4 ° C.
Merk: Hold røret bort fra lys. Klare preparater kan oppnås ved å plassere embryoene i en 90% glycerol / PBS-løsning 10 . Imidlertid er det vanskeligere å dissekere embryoer ryddet i 90% glyserol / PBS-løsning enn de som ble fjernet i 70% glyserol / PBS-løsning 10 .
6. Staging, Dissecting, Mounting og Imaging Embryos (Dag 4)
- For staging, overfør embryoene som er likevektet med 70% glycerol / PBS på en glassglass.
- Samle sent stadium 16 embryoer som har abdominal segment 7 (A7), A8 og A9 ISN nerver som konvergerer for å berøre hverandre eller / og har midgut som er delt inn i tre bånd.
Merk: Embryoer farget med 1D4 antistoff kan arrangeres basert på projeksjonsmønstre av ISN og ISNb motoraxoner. Etter å ha forlatt CNS, A7, A8 og A9 ISN neRves av sen stadium-16-embryoer konvergerer for å berøre hverandre og divergerer da for å strekke langt ut til dorsale muskler (pilespiss i figur 1A ). I midten av 16 embryoer strekker A7 ISN-nerver imidlertid parallelt med A8 / A9-nerver (firkantbrakett i figur 1B ). I tillegg er projeksjonsaksene til A6 ISNb-nerver (vinkelrett på ventrolaterale muskler) i begge hemisegmentene grovt justert med den bakre enden av CNS langsgående akson-fasciklene (piler og en linje i figur 1C ). Disse morfologiske kriteriene varierer noe mellom forskjellige genotyper. Alternativt kan embryoer arrangeres basert på tarmmorfologi 9 , 11 . Før stadium 17 har midguten en hjerteaktig form, mens midguten er delt inn i tre bånd etter stadium 17 12 . - Disseksér embryoer.
- Bruk en 1 mL sprøyte, flytt hvert embryo ut av glycerol-dråpen og legg embryo ventral-forsiden opp. Klipp av den fremre delen på 1/4 av kroppslengden og den mest bakre delen som er fri for motoraxoner.
- Ved hjelp av en nålesonde, flytt det ferdigkuttede embryoet ut av glycerol-dråpen, rull for å orientere det dorsal-side opp, og plasser det horisontalt i feltet.
Merk: Når embryoen blir flyttet ut av glycerol-dråpen, gjør det litt klistret glycerol forbundet med embryoen. - Klipp embryoet langs dorsal midtlinjen ved hjelp av en enkelt meget fin wolframnål 13 . Lag et lite kutt på den bakre delen av embryoet, og fortsett å kutte ned dorsal midtlinjen mot anterioret; Kutting i motsatt retning er også bra.
- Bruk en nålesonde til å flytte midtlinjeskåret embryo inn i glycerol-dråpen, plasser den dorsal-side opp, og løsne tarmene fra kroppsveggen ved å utfolde hver kroppsvegg i en ventrolateral (diagonal) retning (2.5X objektiv).
Merk: Pass på at dorsal midtlinjen er helt kuttet, noe som resulterer i fullstendig skille mellom venstre og høyre kroppsvegger. - Forsiktig flytt det midterste kutte embryoet ut av glyceroldråpet, og legg deretter to klaffer av kroppsvegget ned på glassruten ved hjelp av en fin nålesonde (2,5x objektiv).
- Bruk en meget fin wolframnål, fjern de indre organene fra det dissekerte embryoet ved å skyve dem sideværts (5X objektiv).
Merk: En mer detaljert beskrivelse av en annen lignende disseksjonsprosedyre finnes på nettsiden 5 .
- Ved montering legges 2-3 μL 70% glycerol / PBS-løsning til rene, dissekerte embryoer og overfører dem til en ny glidelåse med 8 μL 70% glycerol / PBS-løsning, med en fin nålprobe. Senteret (2,5 x objektiv).
- Legg på en deksel (18 mm x 18 mm). Tett kantene på dekselet med vanlig neglelakk (entenKlart eller farget er greit).
- Ta bilder i høye oppløsningsmål (20X, 40X og 63X oljedempingsmål) under et differensial interferenskontrast (DIC) lysmikroskop, i henhold til produsentens instruksjoner.
Merk: Bedre visualisering og fenotypisk karakterisering, spesielt for ISNb-motoraxoner, kan produseres ved hjelp av et 63X olje-nedsenkningsmål.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Nøyaktige forbindelser mellom motoraxoner og målmuskler under nevrale utviklingen er avhengig av selektiv aksonaxonavstøtning og målgjenkjenning ved bestemte valgpunkter 4 . I Drosophila er selektiv avstengning mellom motoraxoner regulert delvis av den kombinerte virkningen av klasse 1 og 2 semaforer (Semas), inkludert Sema-1a, Sema-2a og Sema-2b 8 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 . Derfor resulterer tap av Sema-1a- funksjon ofte i sviktet av ISNb-axoner for å defaskulere ved bestemte valgpunkter, slik at de utviser en unormalt tykk morfologi (pilespiss i figur 2C ). I villtype-embryoer strekker minst 7 motorneuroner seg og fasciculerer deres axoner for å danne en ISNb nerve gren ( figur 2A ). Når ISNb-nervegrenen når et valgpunkt, som ligger mellom muskler 6 og 7, defibrilleres to aksoner selektivt fra hoved ISNb-bunten og deretter innervevere musklene 6 og 7 ( figur 2B ). Ved neste valgpunkt, som ligger mellom musklene 6, 13 og 30, defasciculerer ytterligere tre motoraxoner selektivt til innerverte muskler 13, 14 og 30 ( figur 2B ). De resterende to aksonene strekker seg dorsalt for å nå det siste valgpunktet nær kanten av muskel 12, og derved innerverer muskel 12 i motsatt retning ( figur 2B ). Disse resultatene viser tydelig at den fileterte preparatprotokollen er et nyttig verktøy for å studere de gener som kreves for motorisk aksonveiledning.
Figur 2: Motoraxonprojeksjonsmønster i villtype og Sema-1a mutantembryoer. ( A - C ) Fillettert preparat av sen fase 16 embryoer farget med FasII antistoff. Anterior er igjen og ventral er nede. Skjematiske diagrammer som viser de aksonale projeksjonsmønstrene som er representert i hvert panel. Skalestengene = 15 μm. ( A ) Et lystfeltfotografi av to sekvensielle abdominale hemisegmenter, A3 og A4, i villtypeembryoer. Tre bilateralt symmetriske langsgående axonbunter er tilstede i CNS. De normale innerveringsmønstrene av ISNb-, SNa-, ISN- og TN-motorakser er angitt av boksene og en pil i periferien. Den laterale bipolære dendritneuronet (LBD), som innerverer alarymusklene, er indikertReddet av en pilespiss. I skjematisk diagram presenteres nervegrenene og innerveringsmønstrene av ISNb (i brunt), SNa (i blått), ISN (i grønt) og TN (i gule) motorneuroner og deres målmuskler. Cellcellestillingene til disse motorneuronene i CNS er også vist i egne farger. ( B ) I wildtype-embryoer, prosjekterer ISNb-aksonene til de ventrolaterale musklene, som er nummerert, og innerverer dem på bestemte valgpunkter (piler i DIC-bildet). ( C ) I Sema-1a- tap av funn-mutanter, mislykkes ISNb-aksoner ofte i å defaskulere fra hverandre mellom muskler 6 og 13 (pilespiss i DIC-bildet). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detaljer om motorisk aksonstyringsfeil blir scoret raskere og med bedre nøyaktighet ved den fileterte fremstilling av DAB-farget embryoer enn ved laserskanning av konfokal mikroskopi av fluorescensmerkede. Derfor er det fileterte preparatet av faste og 1D4-fargede embryoer best egnet for funksjonell karakterisering av veiledningsøkemolekyler. Fire hovedklasser av veiledningsanvisninger, inkludert netrins, Slits, semaforiner (Semas) og ephrins, og deres kognitive reseptorer har evolusjonært bevart roller over ormer, fluer og vertebrater 20 . Blant rundkjøringsfamiliemolekyler som fungerer som reseptorer for Slits, ble Drosophila Robo først identifisert for å formidle repulsiv veiledningsfunksjon i CNS 6 , 21 . Semas er en stor familie av veiledningsmolekyler som binder til plexin-holdige reseptorkomplekser 22 . Den akson ledende funksjon av SemasBle først oppdaget i gresshoppet CNS 14 . Senere ble klasse 1 transmembran-semaforen Sema-1a karakterisert i stor grad i Drosophila . Sema-1a, som ikke bare fungerer som en ligand for plexin A, men også som en reseptor for en ukjent ligand, spiller en viktig rolle i aksonaksonavstøtning ved bestemte valgpunkter under embryonale nevrale utvikling 15 , 16 , 17 , 18 ( Figur 2C ).
Det er noen vanlige feilsøkingstrinn som kan oppstå med gjeldende protokoll. For det første, i trinn 3.9-3.13, kan embryoene devitelliniseres med lav effektivitet dersom for mange eller for små embryoer anvendes i metanol-devitelliniseringsprosedyren. I dette tilfellet anbefales det å bruke et sengevolum på 40-80 μL faste embryoer for devitellinisering ved trinn 3.5. For det andre, i stePs 3,9-3,13, svak X-Gal-farging kan skje ved lengre eksponering for metanol eller ufullstendig heptanfjerning, da metanol som brukes som fikseringsmiddel ødelegger β-Gal-aktivitet. I dette tilfellet er det best at devitelliniseringsprosedyren ved bruk av metanol i trinn 3.9-3.13 utføres så raskt som mulig. I tillegg kan resterende heptan som er oppløseliggjort i metanol, forstyrre fargingen; Derfor er det best å fjerne så mye metanol som mulig i trinn 3.11-3.13.
Den nåværende fileterte preparatprotokollen kan brukes til tap av funksjon og genetisk skjerm for å oppnå funksjonalitet for å identifisere nye gener som er involvert i motorisk aksonopplæring og målgjenkjenning. En ulempe med denne protokollen er imidlertid at det er ganske tidkrevende å dissekere faste embryoer for å generere fileterte preparater. For å overvinne dette problemet kan fenotypisk karakterisering av de aksonale fremspringene overvåkes i en helmontering av 1D4-farget embRyos, selv om denne metoden gir lavoppløselig visualisering av de aksonale fremspringene i periferien. Ikke desto mindre har den fullmonterte forberedelsesprotokollen vist seg å være en effektiv tilnærming for screening av aksonstyringsgener 4 . En alternativ protokoll som benytter levende disseksjon av fluorescensmerkede embryoer ble nylig utviklet for systematisk screening 11 . Live disseksjonsprotokollen tillater relativt rask forberedelse av fenotypisk analyse 11 . Denne protokollen er imidlertid ikke tilstrekkelig for embryoer eldre enn begynnelsen av fase 17 11 .
Den fileterte preparatprotokoll beskrevet her kan brukes til å undersøke proteinuttrykksmønstre med forskjellige antistoffer. I tillegg kan denne protokollen også brukes på Drosophila- embryoer på ulike stadier av utvikling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatteren erklærer at han ikke har konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Jeg takker Alex L. Kolodkin, da jeg lærte denne fileterte forberedelsesprotokollen i sitt laboratorium. Jeg takker også Young Gi Hong for teknisk assistanse. Denne studien ble støttet av NRF-2013R1A1A4A01011329 (SJ).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | t-Octylphenoxypolyethoxyethanol |
| 16% Paraformaldehyde Solution | Ted Pella | 18505 | |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S5886 | |
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P5405 | |
| Sodium Phosphate Dibasic | Sigma-Aldrich | 30435 | |
| Sodium Phosphate Monobasic | Sigma-Aldrich | 71500 | |
| X-Gal Substrate | US Biological | X1000 | X-Gal (5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-b-D-galactoside galactopyranoside) |
| Dimethyl Sulfxide | Sigma-Aldrich | D4540 | |
| Magnesium Chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Potassium hexacyanoferrate(II) trihydrate | Sigma-Aldrich | P9387 | |
| Potassium hexacyanoferrate(III) | Sigma-Aldrich | 244023 | |
| Hydrogen Peroxide | Sigma-Aldrich | 216763 | |
| 3,3'-diaminobenzidine Tetrahydrochloride | Sigma-Aldrich | D5905 | |
| Agar | US Biological | A0930 | |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-3 | |
| Tegosept (Methy 4-Hydroxybenzoate) | Sigma-Aldrich | H5501 | |
| Culture Dish (60 mm) | Corning | 430166 | |
| Tricon Beaker | Simport | B700-100 | This is used to make a plastic beaker cage for embryo collection. |
| Yeast | Societe Industrielle Lesaffre | Saf Instant Yeast Red | |
| Cotton Swab (Wooden Single Tip Cotton PK100) | VWR | 14220-263 | |
| Eppendorf Tube (1.5 ml) | Sarstedt | #72.690 | |
| Bleach | The Clorox Company | Clorox | |
| Heptane | Sigma-Aldrich | 246654 | |
| Methanol | J.T. Baker | UN1230 | |
| Normal Goat Serum | Life Technologies | 16210-064 | |
| Anti-FasciculinII Antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | 1D4 anti-Fasciclin II | |
| Goat Anti-mouse-HRP Antibody | Jackson Immunoresearch | 115-006-068 | AffiniPure F(ab')2 Fragment Goat Anti-Mouse IgG+IgM (H+L) (min X Hu, Bov, Hrs Sr Prot |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G9012 | |
| Slide Glass | Duran Group | 235501403 | |
| Coverslip | Duran Group | 235503104 | 18 x 18 mm |
| 1 ml Syringe | Becton Dickinson Medical(s) | 301321 | |
| Tungsten Needle | Ted Pella | #27-11 | Tungsten Wire, ø0.13mm/6.1m (ø.005"/20 ft.) |
| Nutator (Mini twister) | Korean Science | KO.VS-96TWS | Alternatively, BD Clay Adams Brand Nutator (BD 421125) |
References
- Bate, M. The embryonic development of larval muscles in Drosophila. Development. 110 (3), 791-804 (1990).
- Landgraf, M., Thor, S. Development of Drosophila motoneurons: specification and morphology. Semin. Cell Dev. Biol. 17 (1), 3-11 (2006).
- Grenningloh, G., Rehm, E. J., Goodman, C. S. Genetic analysis of growth cone guidance in Drosophila: fasciclin II functions as a neuronal recognition molecule. Cell. 67 (1), 45-57 (1991).
- Vactor, D. V., Sink, H., Fambrough, D., Tsoo, R., Goodman, C. S. Genes that control neuromuscular specificity in Drosophila. Cell. 73 (6), 1137-1153 (1993).
- Zinn Lab. , California Institute of Technology. Available from: https://www.its.caltech.edu/~zinnlab/motoraxons.html (2017).
- Seeger, M., Tear, G., Ferres-Marco, D., Goodman, C. S. Mutations affecting growth cone guidance in Drosophila: genes necessary for guidance toward or away from the midline. Neuron. 10 (3), 409-426 (1993).
- Thor, S., Thomas, J. B. The Drosophila islet gene governs axon pathfinding and neurotransmitter identity. Neuron. 18 (3), 397-409 (1997).
- Roh, S., Yang, D. S., Jeong, S. Differential ligand regulation of PlexB signaling in motor neuron axon guidance in Drosophila. Int. J. Dev. Neurosci. 55, 34-40 (2016).
- Campos-Ortega, J. A., Hartenstein, V. The embryonic development of Drosophila melanogaster. , Springer-Verlag. New York. (1985).
- Patel, N. H. Imaging neuronal subsets and other cell types in whole mount Drosophila embryos and larvae using antibody probes. Methods in cell biology, vol 44. Drosophila melanogaster: practical uses in cell biology. Goldstein, L. S. B., Fyrberg, E. 44, Academic Press. New York. 445-487 (1994).
- Lee, H. K., Wright, A. P., Zinn, K. Live dissection of Drosophila embryos: streamlined methods for screening mutant collections by antibody staining. J. Vis. Exp. (34), (2009).
- Hartenstein, V. Stages of Embryonic Development. Atlas of Drosophila. development. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. Available from: http://www.sdbonline.org/sites/fly/atlas/52.htm 52 (1993).
- Brady, J. A simple technique for making very fine, durable dissecting needles by sharpening tungsten wire electrolytically. Bull. World Health Organ. 32 (1), 143-144 (1965).
- Kolodkin, A. L. Fasciclin IV: sequence, expression, and function during growth cone guidance in the grasshopper embryo. Neuron. 9 (5), 831-845 (1992).
- Jeong, S., Juhaszova, K., Kolodkin, A. L. The Control of semaphorin-1a-mediated reverse signaling by opposing pebble and RhoGAPp190 functions in Drosophila. Neuron. 76 (4), 721-734 (2012).
- Winberg, M. L. Plexin A is a neuronal semaphorin receptor that controls axon guidance. Cell. 95 (7), 903-916 (1998).
- Yang, D. S., Roh, S., Jeong, S. The axon guidance function of Rap1 small GTPase is independent of PlexA RasGAP activity in Drosophila. Dev. Biol. 418 (2), 258-267 (2016).
- Yu, H. H., Araj, H. H., Ralls, S. A., Kolodkin, A. L. The transmembrane Semaphorin Sema I is required in Drosophila for embryonic motor and CNS axon guidance. Neuron. 20 (2), 207-220 (1998).
- Hartenstein, V. Stages of Embryonic Development. Atlas of Drosophila. development. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. Available from: http://www.sdbonline.org/sites/fly/atlas/52.htm 52 (1993).
- Dickson, B. J.
- Kidd, T. Roundabout controls axon crossing of the CNS midline and defines a novel subfamily of evolutionarily conserved guidance receptors. Cell. 92 (2), 205-215 (1998).
- Pasterkamp, R. J. Getting neural circuits into shape with semaphorins. Nat. Rev. Neurosci. 13 (9), 605-618 (2012).
