Summary
Bu çalışma, geç evre-16 Drosophila melanogaster embriyolarının motor nöron projeksiyonlarını görselleştirmek için standart bir immünohistokimya yöntemini ayrıntılarıyla anlatıyor . FasII antikoru ile lekelenmiş sabit embriyoların filleted hazırlığı, motor akson yol bulma ve sinirsel gelişim sırasında hedef tanıma için gerekli genlerin karakterize edilmesi için güçlü bir araç sağlar.
Abstract
Fonksiyonel nöromüsküler devrelerin oluşturulması motor aksonlar ve hedef kaslar arasındaki hassas bağlantılara dayanır. Motor nöronları, çevredeki hücre dışı ortamdan çıkan çok sayıda akson rehberliğine yanıt olarak spesifik yol boyunca gezinmek için büyüme konilerini uzatır. Büyüme konisi hedef tanıma da nöromüsküler özgüllükte kritik bir rol oynamaktadır. Bu çalışma, geç evre-16 Drosophila melanogaster embriyolarının motor nöron projeksiyonlarını görselleştirmek için standart bir immünohistokimya protokolü sunmaktadır . Bu protokol, istenen mutant embriyoları sıralamak için bir genotiplendirme prosedürü de dahil olmak üzere birkaç temel adım içerir; Fasciclin II (FasII) antikoru ile embriyoların etiketlenmesi için bir imüno boyama prosedürü; Ve sabit embriyolardan dolgulu preparatların üretilmesi için bir diseksiyon prosedürü. Çevredeki motor akson projeksiyonları ve kas desenleri, fileto embriyoların yassı preparatlarında daha iyi görselleştirilirOle-mount embriyolar. Bu nedenle, FasII antikoru ile boyanmış sabit embriyoların filleted hazırlığı, motor akson yol bulma ve hedef tanıma için gerekli genleri karakterize etmek için güçlü bir araç sağlar ve hem fonksiyon kaybı hem de işlev kazanım genetik ekranlarına da uygulanabilir .
Introduction
Embriyonik gelişme esnasında motor aksonlar ve hedef kaslar arasındaki hassas ve seçici bağlantılar, Drosophila larvalarında normal hareket için gereklidir . Karın hemisiyasyon A2-A7'nin her birinde 30 kas lifinin embriyonik desenlenmesi, evre 16 1 ile oluşturulmuştur. Ventral sinir kablosunda üretilen 36 motor nöron, spesifik hedef kasları innerve etmek için aksonları periferiye uzatır. Motor akson yol bulma ve hedef tanıma, bir antikor (fare monoklonal antikor 1D4) 3 , 4 ile immünohistokimya ile görselleştirilebilir. Vahşi embriyolardaki motor akson projeksiyon modellerinin çoklu görüntüleri web 5'de mevcuttur. 1D4 antikoru, tüm motor aksonları ve üç uzunlamasına akson fasikülünü embriyonik merkezi sinir sisteminin (CNS) orta çizgisinin her iki yanına etiketliyor , 6 ( Şekil 1C ve Şekil 2A ). Bu nedenle, FasII antikoru ile immünohistokimya, motor akson rehberlik ve hedef tanıma altında yatan moleküler mekanizmaları göstermek için nöromüsküler bağlantı için gerekli genlerin belirlenmesi için güçlü bir araç sağlar.
Motor aksonlar, A2-A7 abdominal hemizasyondan her birinde, iki ana sinir dalına, segmental sinir (SN) ve intersegmental sinir (ISN) 2 , 4'e ve küçük sinir dalına, transvers siniri (TN ) 7 . SN, seçici olarak, SNa ve SNc olarak adlandırılan iki sinir dalına neden olurken, ISN, ISN, ISNb ve ISNd 2 , 4 olarak adlandırılan üç sinir dalına bölünür. Bunların arasında ISN, ISNb ve SNa motor aksonGeç evre-16 embriyoları FasII antikoru ile boyandığında ve fileto edildiğinde ( Şekil 1C ve Şekil 2A ), projeksiyon desenleri en net şekilde görselleştirilir. ISN motor nöronları aksonlarını 1, 2, 3, 4, 9, 10, 11, 18, 19 ve 20 2 , 4 ( Şekil 2A ) dorsal kaslarını innerve etmek için uzatır. ISNb motor nöronları ventrolateral kasları 6, 7, 12, 13, 14, 28 ve 30 2 , 4'te sinirlendirir ( Şekil 2A ve 2B). SNa sinir dalı yanal kasları 5, 8, 21, 22, 23 ve 24 2 , 4'ü sinirlendirmek için projelendirir ( Şekil 2A ). İki motor aksondan oluşan TN, kas 25'i sinirlendirmek için segmental sınır boyunca ipsilateral olarak projeler ve sinir sisteminde lateral bipolar dendritik nöron (LBD) ile sinapslar oluşturur.Çevre 7 ( Şekil 2A ). Bu hedef kas innervasyonları, spesifik seçim noktalarında motor aksonların seçici defasikasyonunu değil, aynı zamanda kasların tanınmasını da gerektirir. Buna ek olarak, ara hedef olarak işlev gören bazı varsayılan mezodermal kılavuz hücreler ISN ve SNa yolaklarında bulunmuştur, ancak ISNb yolu 4 boyunca bulunmamıştır. Bu, ISNb motor akson yol bulma yönteminin, ISN ve SNa motor akson rehberliğine kıyasla ayrı bir şekilde düzenlenebileceğini ve aynı zamanda periferik motor akson kılavuzluğunun, tek bir rehberlik işaretinin farklı veya korunmuş rollerini incelemek için çekici bir deneysel model sunduğunu gösterir Molekül 8 .
Bu çalışma, Drosophila'daki embriyonik motor nöronların aksonal projeksiyon modellerini görselleştirmek için standart bir yöntem sunmaktadır . Açıklanan protokoller, 1D4 ile lekelenmiş sabit embriyolarınNtibody ile doldurulmuş ve filleted preparatlar için 3,3'-diaminobenzidine (DAB) işlenmiştir. Sabit embriyoların düz preparatlarının kritik bir avantajı, çevresindeki aksonal projeksiyonların ve kas modellerinin daha iyi görselleştirilmesidir. Ayrıca, bu çalışma aynı zamanda istenen mutant embriyoları LacZ boyama yöntemini kullanarak sıralamak için sabit embriyoların genotiplendirilmesini de gösterir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Hazırlık
- 0.5 g sığır serum albümini (BSA) ve 0.5 mL t-Oktilfenoksipolietoksietanol (Malzeme Tablosuna bakınız) 500 mL 1X PBS ilave ederek t-Octylphenoxypolyethoxyethanol (PBT) çözeltisi ile 500 mL fosfat tamponlu salin (PBS) Ve en az 30 dakika boyunca karıştırma. 4 ° C'de saklayın. Nispeten taze olduğunda kullanın ve çözeltiyi temiz bir şişeye koyun.
- 2.5 mL% 16 stok paraformaldehid solüsyonu ve 1 mL 10x PBS'den 6.5 mL deiyonize suya 10 mL% 4 paraformaldehit yapın. 4 ° C'de saklayın ve bir hafta içinde kullanın.
DİKKAT: Son derece toksik olduğu için paraformaldehit çözeltisiyle cilt temasından kaçının. - 1 mL DMSO'ya 0.1 g X-Gal substrat eriterek X-gal substratını (dimetil sülfoksit (DMSO) içindeki% 10 a / a vivo X-Gal) olun. -20 ° C'de 100 uL'lik alikotlar halinde saklayın.
- X-Gal boyama çözeltisi, 10 mM fosfat tamponu (pH 7.2), 150 mM NaCl, 1 mM MgCl2, 3 mMK4 [FeII (CN) 6 ], 3 mM K3 [FeIII (CN) 6 ] ve% 0.3 t-Oktilfenoksipolietoksietanol. Karanlıkta 4 ° C'de saklayın.
- % 30 stok hidrojen peroksit 1: 10'u deiyonize su ile seyrelterek% 3 hidrojen peroksit çözeltisi yapın.
- 1 tablet (10 mg) DAB'yi 35 mL taze PBT solüsyonunda tamamen eriterek 3,3'-diaminobenzidin (DAB) solüsyonu yapın. 0.2 μm şırınga filtresi ile filtre edin ve 910 μL alikotlar halinde -20 ° C'de saklayın.
DİKKAT: DAB'yi yok etmek için tüm DAB atıklarını çamaşır suyuna atın. - Elma suyuyla yumurta plakaları yapın. 2 L'lik bir şişeye 35 g agar ve 1 L deiyonize su ilave edin. 1 L'lik bir şişeye 33 gr sükroz, 2 gr tegosept ve 375 mL elma suyu ekleyin. Otoklav ile 30 dakika boyunca eritin. Her iki çözeltinin de 60 ° C'ye kadar soğumasına izin verin. Birleştirin ve karıştırarak bu çözeltileri iyice karıştırın. 60 mm'lik kültür çanağı başına 11 mL'lik birleşik çözelti dökün.
- Ekmek mayasının harmanlanarak maya yapıştırın.Iyonu giderilmiş suya (1: 0.8 oranına) sokun ve 4 ° C'de saklayın.
2. Embriyo Koleksiyonu (1. Gün)
- Genç kadın ve erkek sinekleri (5 günden daha genç) toplayın ve 1-2 gün boyunca, merkezde az miktarda maya macunu içeren bir yumurta plakalı (60 mm x 15 mm) plastik bir beher kafes içinde muhafaza edin.
- Geç evre-16 embriyolarının optimum koleksiyonu için, yaklaşık 5 PM'de sinekler (> 50) olan bir şişe kafesi kurun ve 3 saat boyunca 25 ° C'de yumurta bırakmalarına izin verin.
- Sinekleri taze bir yiyecek şişesine aktarın.
- Kapaklı yumurta plakasını kapatın ve gece boyunca 25 ° C'de nemli bir inkübatör (~% 70 nem) içinde inkübe edin.
3. Bağışıklama için Embriyoların Hazırlanması (2. Gün)
- 10:20 civarında yumurta plakasına 1.8 mL PBT solüsyonu ilave edin ve eğinirken embriyoları plakadan gevşetmek için pamuk çubuklarını kullanın.
Not: Bir kottan geçirerek maya hamurunu hafifçe ezerekÜzerinde çok miktarda embriyo bulunması durumunda çözülür. Embriyoların toplanmasına 40 dakika önce başlayın (11: 00 civarında). - 1 mL pipet ucu kullanarak yumurta plakasından embriyoları 1.5 mL'lik bir mikrotube'ye aktarın.
- Embriyoların yerleşmesine ve PBT özümünü olabildiğince aspire etmesine izin verin. Embriyoları iki kez 1 mL PBT çözeltisi ile durulayın. PBT çözümünü olabildiğince aspire.
- Tüp 1 mL% 50 ağartma maddesi ( yani, deiyonize suda seyreltilmiş) ile doldurun ve oda sıcaklığında (RT) 3 dakika süreyle bir nutatorda inkübe ederek embriyoları dechorionate edin.
Not: Bu adım, delinmiş embriyoları öldürmez. - Dechorionated embriyoların çökmesine izin verin, mümkün olduğu kadar% 50 çamaşır suyu aspire edin ve embriyoları 3 mL PBT solüsyonuyla 3 kez yıkayın.
- 0,5 mL heptan ilave edin ve sonra saat 11:00 civarında RT'de 0.5 mL% 4 paraformaldehid solüsyonu tüpün üzerine ilave edin.
- Kuluçkaya yatırRT'de 15 dakika süreyle bir besleyici üzerinde embriyolar.
- % 4 paraformaldehit solüsyonunu (alt tabaka) çıkarın.
- 0.5 mL% 100 metanol ekleyin ve embriyoları, tüpü 30 saniye şiddetle sallayarak devitellellize edin.
- Heptanı çıkarın ( örn . Üst katman).
- 0.5 mL% 100 metanol ilave edin ve tüpü 10 saniye şiddetle çalkalayın.
- Tüpe dokunarak embriyoların yerleşmesini bekleyin ve metanolü olabildiğince aspire edin. Embriyoları 10 mL'den daha az süreyle sallayarak 1 mL% 100 metanolle durulayın.
Not: Metanole artan maruz kalma, β-Gal aktivitesini yok eder. - Metanolü çıkarın ve 1 mL'lik PBT çözeltisi ile 3 kez devitellize edilmiş embriyoları durulayın.
4. LacZ Boyama Kullanarak Embriyoların Genotiplendirilmesi (2. Gün)
- Tüp 1 mL PBT çözeltisi ekleyin ve 15 dakika boyunca 37 ° C ısı bloğu veya su banyosu tüp inkübe edin.
- Kuluçka sırasında, X-Gal boyama solüsyonu (1 mL / dakika)Olmak) 65 ° C'de bir su banyosunda bulanık olana kadar. 37 ° C su banyosunda inkübe edin.
- PBT solüsyonunu aspire edin ve 1 mL X-Gal boyama solüsyonu ve 20 uL X-Gal substratını tüp üzerine ilave edin.
- Mavi bir çökelti belirinceye kadar, tüp 37 ° C'de nutrasyonla inkübe edin.
Not: Genel olarak 2. ve 3. mavi dengeleyiciler için kuluçka süresi 2-4 saat arasındadır. - X-Gal boyama çözeltisini çıkarın ve 1 mL RT PBT solüsyonuyla embriyoları 3 kez durulayın.
- Bir iğne probu veya forseps kullanarak, istenilen genotip embriyolarını ( örneğin, lekelenmemiş beyaz embriyolar) hafif bir kesit mikroskopu (1.6X-2.5X hedefler) ile elle sıralayın.
Not: CyO, aktin-LacZ ve TM3, aktin-LacZ gibi bazı mavi dengeleyiciler, aktin promotörünün kontrolü altında bakteriyel β-Gal (LacZ) eksprese eden transgenik bir yapı taşıdıklarından, embriyolar maviye boyalı olarakBir veya iki kopya mavi dengeleyici kromozom. Bu nedenle, lekelenmemiş beyaz embriyolar arzu edilen öldürücü alel için homozigot olurlar.
5. Embriyoların Anti-Fasciclin II Antikorları ile İmmunotainedasyonu (2. Gün - Gün)
- 1 mL'lik bir pipet ucu kullanarak, istenen genotip embriyolarını ( yani, lekelenmemiş beyaz embriyolar) 0.5 mL'lik bir mikro tüpe toplayın ve aktarın.
Not: Bu adımda, embriyolar, kabuk makinesinin bölümleme şekilleri ve kafa ve kuyruk 9'un yapıları da dahil olmak üzere morfolojik kriterlere göre kabaca aşamalandırılabilir. Kafa involüsyonu sırasında, yumurtalar atıldıktan 10 ila 16 saat sonra embriyo, en ön segment 9'da belirgin bir azalmaya uğrar. - Embriyoları bir kez 0.4 mL PBT solüsyonu ile yıkayın ve 0.3 mL engelleyici solüsyon (PBT solüsyonunda% 5 normal keçi serumu ve% 5 DMSO) ilave edin.
- RT'de 15 dakika boyunca nutasyon ile embriyoları bloke edin.
- Embriyoları yıkama başına en az 20 dakika süreyle 0.4 mL PBT solüsyonuyla 4 kez yıkayın.
- Keçi anti-fare-HRP antikoru (2 ug / mL) içeren engelleyici solüsyonun (PBT solüsyonunda% 5 normal keçi serumu) 0.3 mL ekleyin ve oda sıcaklığında gece boyunca kuluçka ile tübü inkübe edin.
- Embriyoları, yıkama başına en az 20 dakika süreyle 0.4 mL PBT solüsyonuyla 6 kez yıkayın.
- Tüp 0.3 mL DAB çözeltisi ekleyin.
DİKKAT: Eldiven takın ve tüm DAB atıkları / tüpleri / uçları çamaşır suyuna koyun. - 2 μL% 3 hidrojen peroksit ekleyin ve istenen miktarda çökelti oluşana kadar RT'de nutasyonla tüpü karanlıkta inkübe edin.
Not: Genellikle 1D4 immünhistokimyasının kuluçka süresi 0.5-1 saat arasında değişir. - Embriyoları 0.4 mL PBT solüsyonuyla 4 kez yıkayın.
DİKKAT: DAB özümünü ve ilk iki yıkamayı bir pipet ve di ile çıkarınOnları çamaşır suyu ile çöpe atın. - Tüpe 0.2 mL% 70 gliserol / PBS solüsyonu ilave edin ve oda sıcaklığında veya 4 ° C'de saklayın.
Not: Tüpü ışıktan uzak tutun. Embriyoları% 90 gliserol / PBS solüsyonu 10 koyarak daha net preparatlar elde edilebilir. Bununla birlikte,% 70 gliserol / PBS solüsyonu 10'da temizlenenlerden% 90 gliserol / PBS solüsyonu ile temizlenen embriyoları incelemek daha zordur.
6. Embriyoların Evrelendirilmesi, Kesilmesi, Monte Edilmesi ve Görüntülenmesi (4. Gün)
- Evreleme için,% 70 gliserol / PBS ile dengelenmiş embriyoları bir cam slayta aktarın.
- Abdominal segment 7 (A7), A8 ve A9 ISN sinirleri birbirine değmek veya / ve orta virüslerden üç banda bölünmüş yakın evre-16 embriyolarını toplayın.
Not: 1D4 antikoru ile lekelenmiş embriyolar, ISN ve ISNb motor aksonlarının izdüşüm modellerine dayanarak düzenlenebilir. CNS'den çıktıktan sonra A7, A8 ve A9 ISN neGeç evre-16 embriyolarının rfleri birbirine değmek için birleşir ve daha sonra dorsal kaslara kadar genişlemek için ayrılırlar ( Şekil İA'daki ok ucu). Bununla birlikte, orta-evre-16 embriyolarında, A7 ISN sinirleri A8 / A9 sinirleri ile paralel uzanır ( Şekil 1B'deki köşeli parantez). Buna ek olarak, her iki hemizyondaki A6 ISNb sinirlerinin (ventrolateral kaslara dik olan) projeksiyon eksenleri, MSS longitudinal akson fasiküllerinin posterior ucu ile hizalıdır (oklar ve Şekil 1C'deki bir çizgi). Bu morfolojik kriterler, farklı genotipler arasında biraz değişir. Alternatif olarak, embriyolar bağırsak morfolojisi 9 , 11 temel alınarak yapılabilir. 17 no'lu evreye kadar orta bağırsağın kalp benzeri bir şekli var, oysa orta bağırsak 17 no'lu evreye göre üç gruba ayrılmıştır. - Embriyoları parçalayın.
- 1 m kullanmaL şırınga ile, her embriyo gliserol damlasının dışına alın ve embriyonun ventral yüzü yukarı gelecek şekilde yerleştirin. Vücut uzunluğunun 1/4 ve motor aksonlardan arındırılmış en arka bölgede ön kısmı kesin.
- Bir iğne probu kullanarak, uç kesilmiş embriyonu gliserol damlasından dışarıya doğru çekin, sırt üste gelecek şekilde yönlendirin ve tarlaya yatay olarak yerleştirin.
Not: Embriyo gliserol damlasının dışına taşındığında, embriyo ile ilişkili bir miktar gliserol yapışkan yapar. - Tek bir çok ince tungsten iğne 13 kullanarak dorsal orta hat boyunca embriyo kesin. Embriyonun arka ucunda küçük bir kesim yapın ve sonra anteriora doğru dorsal orta çizgiyi kesmeye devam edin; Ters yönde kesmek de iyidir.
- Bir iğne probu kullanarak, orta hat kesilmiş embriyonu gliserol damlasına getirin, sırt üste gelecek şekilde yerleştirin ve vücut duvarlarını ventrolateral (çapraz) yönde açarak gutu vücut duvarından ayırın (2.5X nesnel).
Not: Dorsal orta çizginin tamamen kesildiğinden emin olun, böylece sağ ve sol vücut duvarları arasında tamamen ayrılır. - Orta hat kesilmiş embriyonu gliserol damlasından dikkatlice ayırın ve daha sonra ince bir iğne probu (2.5X objektif) kullanarak vücut duvarının iki kapağını cam slayt üzerine yatırın.
- Çok ince bir tungsten iğne kullanarak, iç organları parçalanmış embriyodan yana doğru iterek çıkarın (5X objektif).
Not: Başka bir benzer diseksiyon prosedürünün daha ayrıntılı bir açıklaması web sitesinde bulunabilir 5 .
- Montaj için, temizlemek için iki kez% 70 gliserol / PBS solüsyonu ilave edin ve ince bir iğne probu kullanarak,% 70 gliserol / PBS solüsyonunun 8 uL'sinin üzerine serpilen yeni bir cam slayt haline getirin. Merkez (2.5X objektif).
- Bir lamel koyun (18 mm x 18 mm). Lamel kenarlarını düzenli tırnak cilasıyla sızdırmaz hale getirin (ya daAçık veya renkli iyi).
- Üreticinin talimatlarına göre, diferansiyel interferans kontrastlı (DIC) ışık mikroskopu altında yüksek çözünürlükte (20X, 40X ve 63X yağ ile daldırma hedefleri) görüntü yakalama.
Not: Özellikle ISNb motor aksonları için daha iyi görselleştirme ve fenotipik karakterizasyon, 63X yağ daldırmalı bir objektif kullanılarak üretilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Sinir gelişiminde motor aksonlar ve hedef kaslar arasındaki kesin bağlantılar, seçici akson akson iticiliğine ve belirli seçim noktalarında hedef tanımaya bağlıdır. Drosophila'da , motor aksonlar arasındaki seçici itme , Sema-1a, Sema-2a ve Sema-2b 8 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 dahil olmak üzere sınıf 1 ve 2 semaforinlerin (Semas) kombine eylemi tarafından kısmen düzenlenir . Bu nedenle, Sema-1a fonksiyonunun kaybı sıklıkla ISNb aksonlarının belirli seçim noktalarında defasikasyona uğramamasına ve dolayısıyla anormal derecede kalın bir morfolojiye ( Şekil 2C'deki ok işareti) neden olur. Vahşi embriyolarda, en az 7 motor nöron uzanır ve aksonlarını fasikülize ederek benSNb sinir dalı ( Şekil 2A ). ISNb sinir dalı, kaslar 6 ve 7 arasında bulunan bir seçim noktasına ulaştığında, iki akson, ana ISNb demetinden seçici bir şekilde defasikleştirir ve daha sonra kasları 6 ve 7'yi sinirlendirir ( Şekil 2B ). Kaslar 6, 13 ve 30 arasında bulunan bir sonraki seçim noktasında, başka bir üç motor akson, kasları 13, 14 ve 30 innerve etmek için seçici bir şekilde defasiküle eder ( Şekil 2B ). Geriye kalan iki akson kas 12'nin kenarının yakınında bulunan son seçim noktasına ulaşmak için dorsal olarak uzanır ve böylece kas 12 ters yönde yönlendirir ( Şekil 2B ). Bu sonuçlar, açıklığa kavuşturulmuş hazırlama protokolünün motor akson rehberliği için gerekli genleri incelemek için yararlı bir araç olduğunu açıkça göstermektedir.
Şekil 2: Vahşi tipli ve Sema-la mutant embriyolarında motor akson projeksiyon modelleri. ( A - C ) FasII antikoru ile lekelenen geç evre-16 embriyoların dolgulu hazırlanması. Ön sol ve ventral aşağı. Her bir panelde temsil edilen aksonal projeksiyon modellerini gösteren şematik diyagramlar. Ölçek çubukları = 15 μm. ( A ) Vahşi embriyolarda A3 ve A4 olmak üzere iki sıralı abdominal hemizasyondan oluşan parlak bir alan fotoğrafı. MSS'de üç bilateral simetrik longitudinal akson demetleri bulunur. ISNb, SNa, ISN ve TN motor aksonlarının normal innervasyon modelleri kutular ve çevredeki bir okla gösterilir. Arial kasları innerve eden lateral bipolar dendrit nöron (LBD), endikedirBir ok ucu ile Şematik diyagramda, ISNb (kahverengi), SNa (mavi), ISN (yeşil) ve TN (sarı) motor nöronlarının sinir dalları ve innervasyon kalıpları ve hedef kasları sunulmaktadır. CNS'de bu motor nöronların hücre vücut pozisyonları da kendi renklerinde gösterilir. ( B ) Vahşi embriyolarda, ISNb aksonları numaralandırılmış olan ventrolateral kaslara projeksiyon yapar ve onları spesifik seçim noktalarında (DIC görüntüsündeki oklar) sinirlendirir. ( C ) Sema-1a fonksiyon kaybı mutantlarında, ISNb aksonları sıklıkla 6 ve 13 kasları arasında (DIC görüntüsündeki ok başı) birbirlerini defasik edemiyor. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Motor akson rehberliğinde kusurların ayrıntıları, DAB lekeli embriyoların örtülü hazırlanmasıyla, flüoresan etiketli olanların konfokal mikroskobunda lazer taramasından daha hızlı ve daha doğru bir şekilde skorlanır. Dolayısıyla, sabit ve 1D4 ile boyanmış embriyoların dolgulu hazırlanması en iyi kılavuzluk ipucu moleküllerinin fonksiyonel karakterizasyonu için uygundur. Netrinler, Yarıklar, semaforinler (Semas) ve efrinler ile bunların ortak kökenli reseptörleri de dahil olmak üzere dört temel rehberlik ipucu sınıfı, solucanlar, sinekler ve omurgalılar arasında evrimsel olarak rol oynamaktadır 20 . Yarıklar için reseptör görevi gören dolambaçlı (Robo) aile moleküllerinde, Drosophila Robo, ilk önce CNS 6 , 21'deki itici rehberlik işlevine aracılık ettiği tespit edildi. Semalar, plexin içeren reseptör komplekslerine 22 bağlanan büyük bir rehberlik molekülüdür. Semas'ın akson rehberlik fonksiyonuIlk çekirdeği CNS 14'de keşfedildi. Daha sonra, sınıf 1 transmembran semaforisi Sema-1a, Drosophila'da geniş olarak karakterize edildi . Sema-1a, sadece plexin A için bir ligand olarak değil aynı zamanda bilinmeyen bir ligand için bir reseptör olarak işlev görür, embriyonik sinirsel gelişim sırasında spesifik seçim noktalarında akson akson iticisinde önemli bir rol oynar ( 15 , 16 , 17 , 18 Şekil 2C ).
Geçerli protokolde oluşabilecek birkaç genel sorun giderme adımları vardır. İlk olarak, 3.9-3.13 adımlarında, metanol devitellinizasyon prosedüründe çok küçük veya çok küçük embriyolar kullanılırsa, embriyolar düşük verimlilikle devitellinizasyona tabi tutulabilir. Bu durumda, adım 3.5'te devitellinizasyon için sabit embriyoların 40-80 μL'lik bir yatak hacmi kullanılması önerilir. İkinci olarak, stePs 3.9-3.13, bir sabitleyici olarak kullanılan metanol, β-Gal aktivitesini yok ettiğinden, metoda daha uzun süre maruz kalması durumunda zayıf X-Gal lekelenmesi veya tamamlanmamış heptan çıkarma olabilir. Bu durumda, adım 3.9-3.13'te metanol kullanan devitellinizasyon prosedürünün mümkün olan en kısa sürede gerçekleştirilmesi en iyisidir. Buna ek olarak, metanolde çözündürülmüş kalıntı heptan boyaya müdahale edebilir; Bu nedenle, adım 3.11-3.13'te olabildiğince fazla metanol çıkarmak en iyisidir.
Mevcut filleted hazırlama protokolü, motor akson yol bulma ve hedef tanıma ile ilgili yeni genleri tanımlamak için fonksiyon kaybı ve fonksiyon kazanma genetik ekranlarına uygulanabilir. Bununla birlikte, bu protokolün bir dezavantajı, filetlenmiş preparatların üretilmesi için sabit embriyoların ayrıştırılması oldukça zaman alacağından kaynaklanmaktadır. Bu sorunun üstesinden gelmek için, aksonal projeksiyonların fenotipik karakterizasyonu, 1D4 ile boyanmış bir bütün olarak hazırlanmış bir embriyoda izlenebilirRyos, ancak bu yöntem çevredeki aksonal projeksiyonların düşük çözünürlükte görselleştirilmesini sağlar. Bununla birlikte, tüm montaj hazırlama protokolünün akson rehberlik genlerinin taranması için etkili bir yaklaşım olduğu kanıtlanmıştır 4 . Floresan işaretli embriyoların canlı diseksiyonunu kullanan alternatif bir protokol, son zamanlarda sistematik tarama için geliştirilmiştir 11 . Canlı diseksiyon protokolü fenotipik analiz için nispeten hızlı bir hazırlık sağlar 11 . Bununla birlikte, bu protokol, evre 17 11'in başlangıcından daha eski embriyolar için yeterli değildir 11 .
Burada açıklanan dolgulu preparat protokolü, protein antikorlarının farklı antikorlarla incelenmesi için kullanılabilir. Buna ek olarak, bu protokol Drosophila embriyolarına çeşitli gelişim evrelerinde de uygulanabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazar, rekabet eden finansal çıkarlarının olmadığını beyan eder.
Acknowledgments
Alex L. Kolodkin'e teşekkür ediyorum, laboratuvarımdaki bu dolgulu hazırlık protokolünü öğrendim. Teknik yardım için Young Gi Hong'a da teşekkür ediyorum. Bu çalışma NRF-2013R1A1A4A01011329 (SJ) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | t-Octylphenoxypolyethoxyethanol |
| 16% Paraformaldehyde Solution | Ted Pella | 18505 | |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S5886 | |
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P5405 | |
| Sodium Phosphate Dibasic | Sigma-Aldrich | 30435 | |
| Sodium Phosphate Monobasic | Sigma-Aldrich | 71500 | |
| X-Gal Substrate | US Biological | X1000 | X-Gal (5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-b-D-galactoside galactopyranoside) |
| Dimethyl Sulfxide | Sigma-Aldrich | D4540 | |
| Magnesium Chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Potassium hexacyanoferrate(II) trihydrate | Sigma-Aldrich | P9387 | |
| Potassium hexacyanoferrate(III) | Sigma-Aldrich | 244023 | |
| Hydrogen Peroxide | Sigma-Aldrich | 216763 | |
| 3,3'-diaminobenzidine Tetrahydrochloride | Sigma-Aldrich | D5905 | |
| Agar | US Biological | A0930 | |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-3 | |
| Tegosept (Methy 4-Hydroxybenzoate) | Sigma-Aldrich | H5501 | |
| Culture Dish (60 mm) | Corning | 430166 | |
| Tricon Beaker | Simport | B700-100 | This is used to make a plastic beaker cage for embryo collection. |
| Yeast | Societe Industrielle Lesaffre | Saf Instant Yeast Red | |
| Cotton Swab (Wooden Single Tip Cotton PK100) | VWR | 14220-263 | |
| Eppendorf Tube (1.5 ml) | Sarstedt | #72.690 | |
| Bleach | The Clorox Company | Clorox | |
| Heptane | Sigma-Aldrich | 246654 | |
| Methanol | J.T. Baker | UN1230 | |
| Normal Goat Serum | Life Technologies | 16210-064 | |
| Anti-FasciculinII Antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | 1D4 anti-Fasciclin II | |
| Goat Anti-mouse-HRP Antibody | Jackson Immunoresearch | 115-006-068 | AffiniPure F(ab')2 Fragment Goat Anti-Mouse IgG+IgM (H+L) (min X Hu, Bov, Hrs Sr Prot |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G9012 | |
| Slide Glass | Duran Group | 235501403 | |
| Coverslip | Duran Group | 235503104 | 18 x 18 mm |
| 1 ml Syringe | Becton Dickinson Medical(s) | 301321 | |
| Tungsten Needle | Ted Pella | #27-11 | Tungsten Wire, ø0.13mm/6.1m (ø.005"/20 ft.) |
| Nutator (Mini twister) | Korean Science | KO.VS-96TWS | Alternatively, BD Clay Adams Brand Nutator (BD 421125) |
References
- Bate, M. The embryonic development of larval muscles in Drosophila. Development. 110 (3), 791-804 (1990).
- Landgraf, M., Thor, S. Development of Drosophila motoneurons: specification and morphology. Semin. Cell Dev. Biol. 17 (1), 3-11 (2006).
- Grenningloh, G., Rehm, E. J., Goodman, C. S. Genetic analysis of growth cone guidance in Drosophila: fasciclin II functions as a neuronal recognition molecule. Cell. 67 (1), 45-57 (1991).
- Vactor, D. V., Sink, H., Fambrough, D., Tsoo, R., Goodman, C. S. Genes that control neuromuscular specificity in Drosophila. Cell. 73 (6), 1137-1153 (1993).
- Zinn Lab. , California Institute of Technology. Available from: https://www.its.caltech.edu/~zinnlab/motoraxons.html (2017).
- Seeger, M., Tear, G., Ferres-Marco, D., Goodman, C. S. Mutations affecting growth cone guidance in Drosophila: genes necessary for guidance toward or away from the midline. Neuron. 10 (3), 409-426 (1993).
- Thor, S., Thomas, J. B. The Drosophila islet gene governs axon pathfinding and neurotransmitter identity. Neuron. 18 (3), 397-409 (1997).
- Roh, S., Yang, D. S., Jeong, S. Differential ligand regulation of PlexB signaling in motor neuron axon guidance in Drosophila. Int. J. Dev. Neurosci. 55, 34-40 (2016).
- Campos-Ortega, J. A., Hartenstein, V. The embryonic development of Drosophila melanogaster. , Springer-Verlag. New York. (1985).
- Patel, N. H. Imaging neuronal subsets and other cell types in whole mount Drosophila embryos and larvae using antibody probes. Methods in cell biology, vol 44. Drosophila melanogaster: practical uses in cell biology. Goldstein, L. S. B., Fyrberg, E. 44, Academic Press. New York. 445-487 (1994).
- Lee, H. K., Wright, A. P., Zinn, K. Live dissection of Drosophila embryos: streamlined methods for screening mutant collections by antibody staining. J. Vis. Exp. (34), (2009).
- Hartenstein, V. Stages of Embryonic Development. Atlas of Drosophila. development. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. Available from: http://www.sdbonline.org/sites/fly/atlas/52.htm 52 (1993).
- Brady, J. A simple technique for making very fine, durable dissecting needles by sharpening tungsten wire electrolytically. Bull. World Health Organ. 32 (1), 143-144 (1965).
- Kolodkin, A. L. Fasciclin IV: sequence, expression, and function during growth cone guidance in the grasshopper embryo. Neuron. 9 (5), 831-845 (1992).
- Jeong, S., Juhaszova, K., Kolodkin, A. L. The Control of semaphorin-1a-mediated reverse signaling by opposing pebble and RhoGAPp190 functions in Drosophila. Neuron. 76 (4), 721-734 (2012).
- Winberg, M. L. Plexin A is a neuronal semaphorin receptor that controls axon guidance. Cell. 95 (7), 903-916 (1998).
- Yang, D. S., Roh, S., Jeong, S. The axon guidance function of Rap1 small GTPase is independent of PlexA RasGAP activity in Drosophila. Dev. Biol. 418 (2), 258-267 (2016).
- Yu, H. H., Araj, H. H., Ralls, S. A., Kolodkin, A. L. The transmembrane Semaphorin Sema I is required in Drosophila for embryonic motor and CNS axon guidance. Neuron. 20 (2), 207-220 (1998).
- Hartenstein, V. Stages of Embryonic Development. Atlas of Drosophila. development. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. Available from: http://www.sdbonline.org/sites/fly/atlas/52.htm 52 (1993).
- Dickson, B. J.
- Kidd, T. Roundabout controls axon crossing of the CNS midline and defines a novel subfamily of evolutionarily conserved guidance receptors. Cell. 92 (2), 205-215 (1998).
- Pasterkamp, R. J. Getting neural circuits into shape with semaphorins. Nat. Rev. Neurosci. 13 (9), 605-618 (2012).
