Summary
Dette arbejde beskriver en standard immunohistokemi metode til at visualisere motor neuron projiceringer af sen fase-16 Drosophila melanogaster embryoner . Det fileterede præparat af faste embryoner farvet med FasII-antistof giver et kraftfuldt værktøj til at karakterisere de gener, der kræves til motorisk axon pathfinding og målgenkendelse under neurale udvikling.
Abstract
Oprettelsen af funktionelle neuromuskulære kredsløb afhænger af præcise forbindelser mellem udviklende motoraxoner og målmuskler. Motorneuroner forlænger vækstkeglerne til at navigere langs specifikke veje ved at reagere på et stort antal axon-vejledende signaler, der stammer fra det omgivende ekstracellulære miljø. Vækstkegle-målgennemgang spiller også en kritisk rolle i neuromuskulær specificitet. Dette arbejde præsenterer en standard immunhistokemi protokol til visualisering af motor neuron projiceringer af sen fase-16 Drosophila melanogaster embryoner . Denne protokol indeholder et par vigtige trin, herunder en genotypeprocedure, for at sortere de ønskede mutante embryoner; En immunfarvningsfremgangsmåde til mærkning af embryoner med fasciclin II (FasII) antistof; Og en dissektionsprocedure for at fremstille fileterede præparater fra faste embryoner. Motoraxon fremspring og muskelmønstre i periferien er meget bedre visualiseret i flade præparater af fileterede embryoner end i whOle-mount embryoner. Derfor giver det fileterede præparat af faste embryoner farvet med FasII-antistof et kraftfuldt værktøj til at karakterisere de gener, der kræves til motorisk axon pathfinding og målgenkendelse, og det kan også anvendes til både funktionssvigt og forstærkningsgenetiske skærme .
Introduction
Præcise og selektive forbindelser mellem motorakser og målmuskler under embryonal udvikling er afgørende for normal bevægelse i Drosophila larver. Den embryonale mønster på 30 muskelfibre i hver af de abdominale hemisegmenter A2-A7 er etableret ved trin 16 1 . De 36 motorneuroner, der genereres i den ventrale nervesnor, strækker deres axoner ind i periferien for at innervate specifikke muskler 2 . Motor-axon-pathfinding og målgenkendelse kan visualiseres ved immunhistokemi med et antistof (musmonoklonalt antistof 1D4) 3 , 4 . Flere billeder af motorens axonfremspringsmønstre i vildtypeembryoner er tilgængelige på nettet 5 . 1D4-antistoffet mærker alle motoraxoner og tre langsgående aksonfasikaler på hver side af midterlinjen af det embryonale centralnervesystem (CNS) 4 , 6 ( figur 1C og figur 2A ). Derfor tilvejebringer immunhistokemi med FasII-antistof et kraftfuldt værktøj til at identificere gener, der kræves til neuromuskulær tilslutning til demonstration af de molekylære mekanismer, der ligger til grund for motor-axon-vejledning og målgenkendelse.
I hver af de abdominale hemisegmenter A2-A7 projekterer motoriske axoner og selektivt fasciculerer i to hovednervenafsnit, segmentnerven (SN) og den tværsegmentale nerve (ISN) 2 , 4 og en mindre nerveafdeling, tværsnerven (TN ) 7 . SN defektiverer selektivt for at give anledning til to nervegrene kaldet SNa og SNc, hvorimod ISN'en opdeles i tre nervegrene kaldet ISN, ISNb og ISNd 2 , 4 . Blandt dem er ISN, ISNb og SNa motoraxonProjiceringsmønstre visualiseres mest præcist, når sent stadium-16 embryoner farves med FasII antistof og er fileteret ( Figur 1C og Figur 2A ). ISN-motorneuronerne udvider deres axoner til indervate dorsale muskler 1, 2, 3, 4, 9, 10, 11, 18, 19 og 20 2 , 4 ( figur 2A ). ISNb-motorneuronerne inderverer ventrolaterale muskler 6, 7, 12, 13, 14, 28 og 30 2 , 4 ( figur 2A og 2B). SNa-nerveafdelingen projekterer at innervere laterale muskler 5, 8, 21, 22, 23 og 24 2 , 4 ( figur 2A ). TN'en, som består af to motoraxoner, projekterer ipsilateralt langs segmentgrænsen til den indre muskel 25 og gør synapser med den laterale bipolære dendritiske neuron (LBD) iPeriferien 7 ( figur 2A ). Disse mål muskelinnervationer kræver ikke kun selektiv defaskulering af motoraxoner på bestemte valgpunkter, men også målrettet mod muskelgenkendelse. Derudover findes nogle formodede mesodermale vejledningsceller, der virker som mellemmål, både i ISN- og SNa-stierne, men ikke langs ISNb-stien 4 . Dette kan tyde på, at ISNb motor axon pathfinding kan reguleres på en særskilt måde i forhold til ISN og SNa motor axon vejledning, og det indikerer også, at perifer motor axon vejledning giver en attraktiv eksperimentel model til at studere differentierede eller konserverede roller i en enkelt vejledning cue Molekyle 8 .
Dette arbejde præsenterer en standard metode til at visualisere de axonale fremskrivningsmønstre af embryonale motoriske neuroner i Drosophila . De beskrevne protokoller omfatter, hvordan man dissekerer faste embryoner farvet med 1D4 aNtibody og forarbejdet i 3,3'-diaminobenzidin (DAB) til fileterede præparater. En kritisk fordel ved de flade præparater af faste embryoner er den bedre visualisering af de aksonale fremspring og muskelmønstre i periferien. Desuden viser dette arbejde også, hvordan man genotype faste embryoner for at sortere de ønskede mutantembryoner ved hjælp af LacZ-farvningsmetoden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Fremstilling
- Der fremstilles 500 ml phosphatpufret saltopløsning (PBS) med t-octylphenoxypolyethoxyethanol (PBT) opløsning ved at tilsætte 0,5 ml bovint serumalbumin (BSA) og 0,5 ml t-octylphenoxypolyethoxyethanol (se Materialetabellen) til 500 ml 1X PBS Og omrøring i mindst 30 minutter. Opbevares ved 4 ° C. Anvendes, når det er relativt frisk, og opbevares opløsningen i en ren flaske.
- Der fremstilles 10 ml 4% paraformaldehyd ved tilsætning af 2,5 ml 16% stock paraformaldehydopløsning og 1 ml 10x PBS til 6,5 ml deioniseret vand. Opbevares ved 4 ° C og anvendes inden for en uge.
FORSIGTIG: Undgå hudkontakt med paraformaldehydopløsningen, fordi det er meget giftigt. - Lav X-Gal substrat (10% w / v X-Gal i dimethylsulfoxid (DMSO)) ved at opløse 0,1 g X-Gal substrat pr. 1 ml DMSO. Opbevares ved -20 ° C i 100 μl alikvoter.
- Lav X-Gal-farvningsopløsning under anvendelse af 10 mM phosphatpuffer (pH 7,2), 150 mM NaCl, 1 mM MgCl2, 3 mMK4 [FeII (CN) 6 ], 3 mM K3 [FeIII (CN) 6 ] og 0,3% t-Octylphenoxypolyethoxyethanol. Opbevares ved 4 ° C i mørke.
- Lav 3% hydrogenperoxidopløsning ved at fortynde 30% lager hydrogenperoxid 1:10 med deioniseret vand.
- Lav 3,3'-diaminobenzidin-opløsning (DAB) ved fuldstændigt at opløse 1 tablet (10 mg) DAB i 35 ml frisk PBT-opløsning. Filter gennem et 0,2 μm sprøjtefilter og opbevar ved -20 ° C i 910 μl alikvoter.
FORSIGTIG: Kassér alt DAB-affald i blegemiddel for at ødelægge DAB. - Lav ægplader med æblejuice. Tilsæt 35 g agar og 1 liter deioniseret vand til en 2 liter kolbe. Tilsæt 33 g saccharose, 2 g tegosept og 375 ml æblesaft til en 1 liter kolbe. Smelt dem ved autoklavering i 30 minutter. Lad begge løsninger afkøle til omkring 60 ° C. Kombiner og bland disse opløsninger godt ved omrøring. Hæld ~ 11 ml kombineret opløsning pr. 60 mm dyrkningsskål.
- Lav gærpasta ved at blande bageren jaSt i deioniseret vand (1: 0,8 forhold) og opbevar ved 4 ° C.
2. Embryo-samling (dag 1)
- Saml unge kvindelige og mandlige fluer (yngre end 5 dage) og i 1-2 dage opretholde dem i et plastbægerkage med en ægplade (60 mm x 15 mm), der indeholder en lille mængde gærpasta i midten.
- For den optimale samling af sen fase 16 embryoner skal du oprette et flaskebur med fluer (> 50) omkring 17:00 og lade dem lægge æg ved 25 ° C i 3 timer.
- Overfør fluerne til en frisk madflaske.
- Luk æggepladen med låget og inkubér det på hovedet ved 25 ° C i en befugtet inkubator (~ 70% fugtighed) natten over.
3. Forberedelse af embryoner til immunforsvar (dag 2)
- Tilsæt 1,8 ml PBT-opløsning til æggepladen omkring kl. 10:20 og brug en bomuldspinne til at løsne embryonerne fra pladen, mens vippe den.
Bemærk: Ved forsigtigt mashing gærpasta ved hjælp af en bomuldPå vatpind opløses det, hvis der findes et stort antal embryoner på den. Begynd at samle embryoerne ~ 40 min. Før fiksering (omkring kl. 11:00). - Overfør embryonerne fra æggepladen til en 1,5 ml mikrotube ved hjælp af en 1 ml pipettespids.
- Tillad embryonerne at lægge sig ned og aspirere PBT-opløsningen så meget som muligt. Skyl embryoerne to gange med 1 ml PBT-opløsning. Aspirer PBT-opløsningen så meget som muligt.
- Fyld røret med 1 ml 50% blegemiddel ( dvs. fortyndet i deioniseret vand) og dechorionér embryonerne ved at inkubere dem på en nutator i 3 minutter ved stuetemperatur (RT).
Bemærk: Dette trin dræber ikke de dekarionerede embryoner. - Lad de dekarionerede embryoner lægge sig ned, aspirere 50% blegemiddel så meget som muligt, og skyll embryonerne 3 gange med 1 ml PBT-opløsning.
- Tilsæt 0,5 ml heptan, og efterfølgende tilsættes 0,5 ml 4% paraformaldehydopløsning til røret ved stuetemperatur omkring kl. 11:00.
- Inkubér denEmbryoner på en nutator i 15 minutter ved stuetemperatur.
- Fjern 4% paraformaldehydopløsningen (bundlaget).
- Tilsæt 0,5 ml 100% methanol og devitelliniser embryoerne ved at ryste røret kraftigt i 30 s.
- Fjern heptan ( dvs. det øverste lag).
- Tilsæt 0,5 ml 100% methanol og ryst røret kraftigt i 10 s.
- Lad embryonerne slå sig ned ved at banke på røret og aspirere metanolen så meget som muligt. Skyl embryoerne med 1 ml 100% methanol, omrystning i mindre end 10 s.
Bemærk: Udvidet eksponering for methanol ødelægger β-Gal aktivitet. - Fjern metanol og skyl de devitelliniserede embryoner 3 gange med 1 ml PBT-opløsning.
4. Genotyping af embryoerne ved brug af LacZ-farvning (dag 2)
- Tilsæt 1 ml PBT-opløsning til røret og inkubér røret i en 37 ° C varmeblok eller vandbad i 15 minutter.
- Ved inkubation anbringes X-Gal-farvningsopløsning (1 ml pr. TuVære) ved 65 ° C i et vandbad, indtil det bliver overskyet. Inkuber det i et 37 ° C vandbad.
- Aspirer PBT-opløsningen og tilsæt 1 ml X-Gal-farvningsopløsning og 20 μl X-Gal-substrat til røret.
- Inkuber røret ved 37 ° C med næring, indtil et blåt bundfald er tydeligt.
Bemærk: Inkubationstiden for de 2 nd og 3 r blå balancere i almindelighed varierer fra 2-4 timer. - Fjern X-Gal-farvningsopløsningen og skyll embryoerne 3 gange med 1 ml RT PBT-opløsning.
- Ved hjælp af en nålesonde eller pincett skal man sortere embryonerne af den ønskede genotype ( dvs. ikke-farvede hvide embryoner) med et lysdissektionsmikroskop (1.6X-2.5X-målsætninger).
Bemærk: Eftersom nogle blåbalancere, såsom CyO, actin-LacZ og TM3, actin-LacZ , bærer en transgen konstruktiv ekspression af bakteriel p-Gal (LacZ) under kontrol af actinpromotoren, indeholder embryoer farvet blå på allestedsnærværende mådeEn eller to kopier af blå balancer kromosomer. Derfor er ikke-farvede hvide embryoner homozygote for den ønskede letale allel.
5. Immunostaining af embryoer med anti-fasciclin II-antistoffer (dag 2-3)
- Indsamle og overfør embryonerne af den ønskede genotype ( dvs. ikke-farvede hvide embryoner) til en 0,5 ml mikrotube ved anvendelse af en 1 ml pipettespids.
Bemærk: I dette trin kan embryonerne i grov grad foregå i overensstemmelse med morfologiske kriterier, herunder segmentets mønstermønstre og hovedets og halernes 9 strukturer. Under hovedinvolutionen, mellem 10 og 16 timer efter æggene er lagt, gennemgår embryoen en markant reduktion af det mest fremre segment 9 . - Vask embryonerne en gang med 0,4 ml PBT-opløsning og tilsæt 0,3 ml blokerende opløsning (5% normalt gedsserum og 5% DMSO i PBT-opløsning).
- Bloker embryoerne med næring ved stuetemperatur i 15 minutter.
- Vask embryonerne 4 gange med 0,4 ml PBT-opløsning i mindst 20 minutter pr. Vask.
- Tilsæt 0,3 ml blokeringsopløsning (5% normalt gedesserum i PBT-opløsning) indeholdende gede-anti-mus-HRP-antistof (2 μg / ml) og inkubér røret med næring ved stuetemperatur natten over.
- Vask embryonerne 6 gange med 0,4 ml PBT-opløsning i mindst 20 minutter pr. Vask.
- Tilsæt 0,3 ml DAB-opløsning til røret.
FORSIGTIG: Brug handsker og læg alle DAB-affald / rør / tips i blegemiddel. - Tilsæt 2 μl 3% hydrogenperoxid og inkubér røret i mørke med næring ved stuetemperatur, indtil den ønskede mængde bundfald produceres.
Bemærk: Inkubationstiden for 1D4 immunhistokemi er generelt i området fra 0,5-1 time. - Vask embryonerne 4 gange med 0,4 ml PBT-opløsning.
FORSIGTIG: Fjern DAB-opløsningen, og de to første vasker med en pipette og diSkære dem i blegemiddel. - Tilsæt 0,2 ml montage 70% glycerol / PBS opløsning til røret og opbevar ved RT eller 4 ° C.
Bemærk: Hold røret væk fra lys. Klare præparater kan opnås ved at placere embryonerne i en 90% glycerol / PBS-opløsning 10 . Det er imidlertid vanskeligere at dissekere embryoner ryddet i 90% glycerol / PBS-opløsning end dem, der ryddes i 70% glycerol / PBS-opløsning 10 .
6. Staging, Dissecting, Mounting og Imaging Embryos (Dag 4)
- Ved opdeling overføres embryonerne ækvilibreret med 70% glycerol / PBS på en glasskinne.
- Indsamle sen fase 16 embryoner, der har abdominal segment 7 (A7), A8 og A9 ISN nerver, der konvergerer til at røre hinanden eller / og har midgut, der er inddelt i tre bånd.
Bemærk: Embryoer farvet med 1D4 antistof kan arrangeres baseret på projektionsmønstre af ISN og ISNb motoraxoner. Efter at have forlod CNS, A7, A8 og A9 ISN neRves af sen fase-16-embryoner konvergerer for at berøre hinanden og diverger derefter for at strække sig langt ud til dorsale muskler (pilespids i figur 1A ). I mellemstadiet-16-embryoner strækker A7 ISN-nerver imidlertid parallelt med A8 / A9-nerverne (firkantbøjle i figur 1B ). Desuden er projektionsakserne af A6 ISNb-nerverne (vinkelret på de ventrolaterale muskler) i begge hemisegmenter groft tilpasset den bageste ende af CNS langsgående axon-fascikaler (pilene og en linje i figur 1C ). Disse morfologiske kriterier varierer noget mellem forskellige genotyper. Alternativt kan embryoner arrangeres baseret på tarmmorfologi 9 , 11 . Før fase 17 har midguten en hjertelignende form, mens midgut er opdelt i tre bånd i trin 17 12 . - Dissekter embryoner.
- Brug en 1 mL sprøjte, flyt hvert embryo ud af glycerol dråbet og læg embryo ventral-forsiden opad. Afskær den forreste del ved 1/4 af kropslængden og den mest bageste region, der er fri for motoraxoner.
- Ved hjælp af en nålesonde skal du flytte det afskårne embryo ud af glycerolfaldet, rulle for at orientere det dorsal-side op og placere det horisontalt i feltet.
Bemærk: Når embryoet flyttes ud af glyceroldråbet, gør en lille smule glycerol forbundet med embryoet det klæbrigt. - Skær embryoet langs den dorsale midterlinie ved hjælp af en enkelt meget fin wolframnål 13 . Lav et lille stykke på den bageste ende af embryoet og fortsæt derefter med at skære ned dorsal midterlinjen mod anterior; Skæring i modsat retning er også fint.
- Ved hjælp af en nålesonde skal du flytte det midterste kutte embryo ind i glycerol dråbet, placere det dorsal-side op og løsne tarmen fra kropsvæggen ved at udfolde hver kropsvæg i en ventrolateral (diagonal) retning (2.5X objektiv).
Bemærk: Sørg for, at den dorsale midterlinie er helt skåret, hvilket resulterer i fuldstændig adskillelse mellem venstre og højre kropsvægge. - Forsigtigt flyt det midterste kutte embryo ud af glycerol dråbet og læg derefter to klapper af kropsvæggen ned på glasskinnen med en fin nålesonde (2,5x objektiv).
- Brug en meget fin wolframnål, fjern de indre organer fra det dissekerede embryo ved at skubbe dem sideværts (5X objektiv).
Bemærk: En mere detaljeret beskrivelse af en anden lignende dissektionsprocedure findes på hjemmesiden 5 .
- Til montering tilsættes 2-3 μL 70% glycerol / PBS-opløsning til rene, dissekerede embryoner, og ved hjælp af en fin nålesonde overføres dem til et nyt glasglass, hvor 8 μl 70% glycerol / PBS-opløsning er spredt i Centret (2.5X objektiv).
- Anbring en dækslip (18 mm x 18 mm). Tæt kanterne på dækslet med almindeligt neglelak (entenKlar eller farvet er fint).
- Optag billeder ved høj opløsning (20X, 40X og 63X olieinddrivelsesmål) under et DIC-lysmikroskop (Differential Interference Contrast) i overensstemmelse med producentens anvisninger.
Bemærk: Bedre visualisering og fænotypisk karakterisering, især for ISNb-motoraxoner, kan produceres ved hjælp af et 63X olieinddrivningsmål.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Præcise forbindelser mellem motorakser og målmuskler under neurale udvikling afhænger af selektiv axonaxonafstødning og målgennemgang ved bestemte valgpunkter 4 . I Drosophila reguleres selektiv afstødning mellem motoraxoner dels af den kombinerede virkning af klasse 1 og 2 semaforiner (Semas), herunder Sema-1a, Sema-2a og Sema-2b 8 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 . Derfor resulterer tab af Sema-1a- funktion ofte i svigt af ISNb-axoner for at defasciculate på bestemte valgpunkter, hvilket får dem til at udvise en unormalt tyk morfologi (pilespids i figur 2C ). I wildtype-embryoner udvider mindst 7 motorneuroner og fasciculerer deres axoner til dannelse af en ISNb nerve gren ( figur 2A ). Når ISNb-nerveafdelingen når et valgpunkt, som ligger mellem musklerne 6 og 7, defaskulerer to axoner selektivt fra hoved ISNb-bundtet og efterfølgende inderverer musklerne 6 og 7 ( figur 2B ). Ved næste valgpunkt, som er placeret mellem musklerne 6, 13 og 30, defascicerer yderligere tre motoraxoner selektivt til indervate musklerne 13, 14 og 30 ( figur 2B ). De resterende to aksoner strækker sig dorsalt for at nå det sidste valg punkt nær kanten af muskel 12, hvorved muskelen 12 indeserveres i modsat retning ( figur 2B ). Disse resultater viser tydeligt, at den fileterede præparationsprotokol er et nyttigt værktøj til at studere de gener, der kræves til motorisk vejledning.
Figur 2: Motoraxonprojiceringsmønstre i vildtype og Sema-1a mutantembryoner. ( A - C ) Filetfremstillet præparat af sen fase 16 embryoner farvet med FasII antistof. Forreste er tilbage og ventral er nede. Skematiske diagrammer, der viser de aksonale projektionsmønstre repræsenteret i hvert panel. Skalestængerne = 15 μm. ( A ) Et lystfeltbillede af to sekventielle abdominale hemisegmenter, A3 og A4, i vildtypeembryoner. Tre bilateralt symmetriske langsgående axonbundler er til stede i CNS. De normale innerveringsmønstre af ISNb-, SNa-, ISN- og TN-motoraxoner er angivet med boksene og en pil i periferien. Den laterale bipolære dendritneuron (LBD), som innerverer alarymusklerne, er indicatEd ved en pilehoved. I skematisk diagram er nervegrenene og innerveringsmønstrene af ISNb (i brunt), SNa (i blåt), ISN (i grønt) og TN (i gule) motorneuroner og deres målmuskler præsenteret. Cellekropsstillingerne af disse motorneuroner i CNS er også vist i deres egne farver. ( B ) I vildtypiske embryoner projekterer ISNb-axonerne til de ventrolaterale muskler, som er nummereret, og inderverer dem på bestemte valgpunkter (pile i DIC-billedet). ( C ) I Sema-1a -funktionsmutanter undgår ISNb-axoner ofte at defasciculate fra hinanden mellem musklerne 6 og 13 (pilespids i DIC-billedet). Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detaljerne om motoriske aksonstyringsfejl scannes hurtigere og med bedre nøjagtighed ved det fileterede præparat af DAB-farvede embryoner end ved laserskanning af konfokal mikroskopi af fluorescensmærkede. Derfor er det fileterede præparat af faste og 1D4-farvede embryoner bedst egnet til den funktionelle karakterisering af vejledende kølemolekyler. Fire hovedklasser af vejledende signaler, herunder netrins, Slits, semaforer (Semas) og ephrins og deres kognitive receptorer har evolutionært bevaret roller på tværs af orme, fluer og hvirveldyr 20 . Blandt familiemolekyler med rundkørsel (Robo), der fungerer som receptorer til slids, blev Drosophila Robo først identificeret til at formidle afstødende vejledningsfunktion i CNS 6 , 21 . Semas er en stor familie af vejledningsmolekyler, der binder til plexin-holdige receptorkomplekser 22 . Axas vejledning funktion af SemasBlev først opdaget i græshoppe CNS 14 . Efterfølgende blev klasse 1 transmembran-semaforen Sema-1a karakteriseret i vid udstrækning i Drosophila . Sema-1a, som ikke kun fungerer som en ligand for plexin A, men også som en receptor for en ukendt ligand, spiller en vigtig rolle i axon-axon afstødning ved specifikke valgpunkter under embryonale neurale udvikling 15 , 16 , 17 , 18 ( Figur 2C ).
Der er et par almindelige fejlfindingstrin, der kan forekomme med den nuværende protokol. For det første kan embryonerne i trin 3.9-3.13 devitelliniseres med lav effektivitet, hvis for mange eller for små embryoner anvendes i methanol-devitelliniseringsproceduren. I dette tilfælde anbefales det at anvende et sengevolumen på 40-80 μl faste embryoner til devitellinisering i trin 3.5. For det andet, i stePs 3,9-3,13, svag X-Gal-farvning kan ske ved længere eksponering for methanol eller ufuldstændig heptanfjernelse, da methanol anvendt som et fikseringsmiddel ødelægger β-Gal-aktivitet. I dette tilfælde er det bedst, at devitelliniseringsproceduren ved hjælp af methanol i trin 3.9-3.13 udføres så hurtigt som muligt. Derudover kan resterende heptan, der er solubiliseret i methanol, forstyrre farvningen; Derfor er det bedst at fjerne så meget methanol som muligt i trin 3.11-3.13.
Den nuværende fileterede præparationsprotokol kan anvendes til tab-of-function og gain-of-function genetiske skærme for at identificere nye gener, der er involveret i motoraxon pathfinding og målgenkendelse. En ulempe ved denne protokol er imidlertid, at det er ret tidskrævende at dissekere faste embryoner til dannelse af fileterede præparater. For at overvinde dette problem kan fænotypisk karakterisering af de aksonale fremspring overvåges i et helmonteret præparat af 1D4-farvet embRyos, selvom denne metode tilvejebringer lavopløsningsvisualisering af de aksonale fremspring i periferien. Ikke desto mindre har den fuldstændige forberedelsesprotokol vist sig at være en effektiv tilgang til screening af axonvejledningsgener 4 . En alternativ protokol ved anvendelse af den levende dissektion af fluorescensmærkede embryoner blev for nylig udviklet til systematisk screening 11 . Den levende dissektionsprotokol muliggør relativt hurtigt forberedelse til fænotypisk analyse 11 . Denne protokol er imidlertid ikke tilstrækkelig til embryoner ældre end begyndelsen af fase 17 11 .
Den heri beskrevne filetfremstillingsprotokol kan anvendes til at undersøge proteinekspressionsmønstre med forskellige antistoffer. Desuden kan denne protokol også anvendes på Drosophila embryoner på forskellige udviklingsstadier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatteren erklærer, at han ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Jeg takker Alex L. Kolodkin, da jeg lærte denne fileterede forberedelsesprotokol i hans laboratorium. Jeg takker også Young Gi Hong for teknisk assistance. Denne undersøgelse blev støttet af NRF-2013R1A1A4A01011329 (SJ).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | t-Octylphenoxypolyethoxyethanol |
| 16% Paraformaldehyde Solution | Ted Pella | 18505 | |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S5886 | |
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P5405 | |
| Sodium Phosphate Dibasic | Sigma-Aldrich | 30435 | |
| Sodium Phosphate Monobasic | Sigma-Aldrich | 71500 | |
| X-Gal Substrate | US Biological | X1000 | X-Gal (5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-b-D-galactoside galactopyranoside) |
| Dimethyl Sulfxide | Sigma-Aldrich | D4540 | |
| Magnesium Chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Potassium hexacyanoferrate(II) trihydrate | Sigma-Aldrich | P9387 | |
| Potassium hexacyanoferrate(III) | Sigma-Aldrich | 244023 | |
| Hydrogen Peroxide | Sigma-Aldrich | 216763 | |
| 3,3'-diaminobenzidine Tetrahydrochloride | Sigma-Aldrich | D5905 | |
| Agar | US Biological | A0930 | |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-3 | |
| Tegosept (Methy 4-Hydroxybenzoate) | Sigma-Aldrich | H5501 | |
| Culture Dish (60 mm) | Corning | 430166 | |
| Tricon Beaker | Simport | B700-100 | This is used to make a plastic beaker cage for embryo collection. |
| Yeast | Societe Industrielle Lesaffre | Saf Instant Yeast Red | |
| Cotton Swab (Wooden Single Tip Cotton PK100) | VWR | 14220-263 | |
| Eppendorf Tube (1.5 ml) | Sarstedt | #72.690 | |
| Bleach | The Clorox Company | Clorox | |
| Heptane | Sigma-Aldrich | 246654 | |
| Methanol | J.T. Baker | UN1230 | |
| Normal Goat Serum | Life Technologies | 16210-064 | |
| Anti-FasciculinII Antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | 1D4 anti-Fasciclin II | |
| Goat Anti-mouse-HRP Antibody | Jackson Immunoresearch | 115-006-068 | AffiniPure F(ab')2 Fragment Goat Anti-Mouse IgG+IgM (H+L) (min X Hu, Bov, Hrs Sr Prot |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G9012 | |
| Slide Glass | Duran Group | 235501403 | |
| Coverslip | Duran Group | 235503104 | 18 x 18 mm |
| 1 ml Syringe | Becton Dickinson Medical(s) | 301321 | |
| Tungsten Needle | Ted Pella | #27-11 | Tungsten Wire, ø0.13mm/6.1m (ø.005"/20 ft.) |
| Nutator (Mini twister) | Korean Science | KO.VS-96TWS | Alternatively, BD Clay Adams Brand Nutator (BD 421125) |
References
- Bate, M. The embryonic development of larval muscles in Drosophila. Development. 110 (3), 791-804 (1990).
- Landgraf, M., Thor, S. Development of Drosophila motoneurons: specification and morphology. Semin. Cell Dev. Biol. 17 (1), 3-11 (2006).
- Grenningloh, G., Rehm, E. J., Goodman, C. S. Genetic analysis of growth cone guidance in Drosophila: fasciclin II functions as a neuronal recognition molecule. Cell. 67 (1), 45-57 (1991).
- Vactor, D. V., Sink, H., Fambrough, D., Tsoo, R., Goodman, C. S. Genes that control neuromuscular specificity in Drosophila. Cell. 73 (6), 1137-1153 (1993).
- Zinn Lab. , California Institute of Technology. Available from: https://www.its.caltech.edu/~zinnlab/motoraxons.html (2017).
- Seeger, M., Tear, G., Ferres-Marco, D., Goodman, C. S. Mutations affecting growth cone guidance in Drosophila: genes necessary for guidance toward or away from the midline. Neuron. 10 (3), 409-426 (1993).
- Thor, S., Thomas, J. B. The Drosophila islet gene governs axon pathfinding and neurotransmitter identity. Neuron. 18 (3), 397-409 (1997).
- Roh, S., Yang, D. S., Jeong, S. Differential ligand regulation of PlexB signaling in motor neuron axon guidance in Drosophila. Int. J. Dev. Neurosci. 55, 34-40 (2016).
- Campos-Ortega, J. A., Hartenstein, V. The embryonic development of Drosophila melanogaster. , Springer-Verlag. New York. (1985).
- Patel, N. H. Imaging neuronal subsets and other cell types in whole mount Drosophila embryos and larvae using antibody probes. Methods in cell biology, vol 44. Drosophila melanogaster: practical uses in cell biology. Goldstein, L. S. B., Fyrberg, E. 44, Academic Press. New York. 445-487 (1994).
- Lee, H. K., Wright, A. P., Zinn, K. Live dissection of Drosophila embryos: streamlined methods for screening mutant collections by antibody staining. J. Vis. Exp. (34), (2009).
- Hartenstein, V. Stages of Embryonic Development. Atlas of Drosophila. development. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. Available from: http://www.sdbonline.org/sites/fly/atlas/52.htm 52 (1993).
- Brady, J. A simple technique for making very fine, durable dissecting needles by sharpening tungsten wire electrolytically. Bull. World Health Organ. 32 (1), 143-144 (1965).
- Kolodkin, A. L. Fasciclin IV: sequence, expression, and function during growth cone guidance in the grasshopper embryo. Neuron. 9 (5), 831-845 (1992).
- Jeong, S., Juhaszova, K., Kolodkin, A. L. The Control of semaphorin-1a-mediated reverse signaling by opposing pebble and RhoGAPp190 functions in Drosophila. Neuron. 76 (4), 721-734 (2012).
- Winberg, M. L. Plexin A is a neuronal semaphorin receptor that controls axon guidance. Cell. 95 (7), 903-916 (1998).
- Yang, D. S., Roh, S., Jeong, S. The axon guidance function of Rap1 small GTPase is independent of PlexA RasGAP activity in Drosophila. Dev. Biol. 418 (2), 258-267 (2016).
- Yu, H. H., Araj, H. H., Ralls, S. A., Kolodkin, A. L. The transmembrane Semaphorin Sema I is required in Drosophila for embryonic motor and CNS axon guidance. Neuron. 20 (2), 207-220 (1998).
- Hartenstein, V. Stages of Embryonic Development. Atlas of Drosophila. development. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. Available from: http://www.sdbonline.org/sites/fly/atlas/52.htm 52 (1993).
- Dickson, B. J.
- Kidd, T. Roundabout controls axon crossing of the CNS midline and defines a novel subfamily of evolutionarily conserved guidance receptors. Cell. 92 (2), 205-215 (1998).
- Pasterkamp, R. J. Getting neural circuits into shape with semaphorins. Nat. Rev. Neurosci. 13 (9), 605-618 (2012).
