Summary
Detta arbete beskriver en standard immunohistokemi metod för att visualisera motor neuron prognoser av sena stadium-16 Drosophila melanogaster embryon. Den fileterade beredningen av fasta embryon färgade med FasII-antikroppen tillhandahåller ett kraftfullt verktyg för att karakterisera de gener som krävs för motoraxonvägfinding och måligenkänning under neuralt utveckling.
Abstract
Inrättandet av funktionella neuromuskulära kretsar bygger på exakta kopplingar mellan utvecklande motoraxoner och målmuskler. Motorneuroner förlänger tillväxtkeglerna för att navigera längs specifika vägar genom att svara på ett stort antal axonvägledningsignaler som härrör från den omgivande extracellulära miljön. Målkännetecknet för tillväxtkegeln spelar också en kritisk roll i neuromuskulär specificitet. Detta arbete presenterar ett standard immunohistokemi protokoll för att visualisera motor neuronprojektioner av sena stadium-16 Drosophila melanogaster embryon. Detta protokoll innefattar några nyckelsteg, inklusive en genotypprocedur, för att sortera de önskade mutantembryonerna; Ett immunförfärande förfarande för att märka embryon med fasciclin II (FasII) antikropp; Och ett dissektionsförfarande för att generera fileterade preparat från fasta embryon. Motoraxonprojektioner och muskelmönster i periferin är mycket bättre visualiserade i platta preparat av fileterade embryon än i whOle-mount embryon. Därför ger den fileterade beredningen av fasta embryon färgade med FasII-antikroppen ett kraftfullt verktyg för att karakterisera de gener som krävs för motoraxonvägfindning och måligenkänning och det kan också appliceras både på funktionsfel och funktionskrävande genetiska skärmar .
Introduction
Exakta och selektiva kopplingar mellan motoraxon och målmuskler under embryonal utveckling är nödvändiga för normal framdrivning i Drosophila larver. Den embryonala mönstret av 30 muskelfibrer i var och en av bukhemisegmenten A2-A7 är etablerad genom steg 16 1 . De 36 motorneuronerna som genereras i ventralnervsbandet sträcker sig axonerna i periferin för att innervate specifika målmuskler 2 . Motoraxonvägfinding och måligenkänning kan visualiseras genom immunhistokemi med en antikropp (musmonoklonal antikropp 1D4) 3 , 4 . Flera bilder av motorns axonprojektionsmönster i vildtypsembryon finns på webben 5 . 1D4-antikroppen märker alla motoraxoner och tre longitudinella axonfasikaler på vardera sidan av mittlinjen i det embryonala centrala nervsystemet (CNS) 4 , 6 ( Figur 1C och Figur 2A ). Därför tillhandahåller immunhistokemi med FasII-antikropp ett kraftfullt verktyg för att identifiera gener som krävs för neuromuskulär anslutning för att demonstrera de molekylära mekanismer som ligger till grund för motoraxonvägledning och måligenkänning.
I var och en av bukhemisegmenten A2-A7 projekterar motoraxonsprojektet och selektivt fasciculeras i två huvudsakliga nervgrenar, segmentsnerven (SN) och den intersegmentella nerven (ISN) 2 , 4 och en mindre nervgren, den transversella nerven (TN ) 7 . SN definierar selektivt för att ge upphov till två nervgrenar som kallas SNa och SNc, medan ISN delas in i tre nervgrenar som heter ISN, ISNb och ISNd 2 , 4 . Bland dem är ISN, ISNb och SNA motoraxonProjiceringsmönstren visualiseras mest exakt när sent stadium 16 embryon färgas med FasII-antikropp och är fileterade ( Figur 1C och Figur 2A ). ISN-motorneuronerna förlänger sina axoner till innerliga dorsala musklerna 1, 2, 3, 4, 9, 10, 11, 18, 19 och 20 2 , 4 ( Figur 2A ). ISNb-motorneuronerna innervatar ventrolaterala muskler 6, 7, 12, 13, 14, 28 och 30 2 , 4 ( Figur 2A och 2B). SNa-nervgrenen projekterar att innerva laterala muskler 5, 8, 21, 22, 23 och 24 2 , 4 ( Figur 2A ). TN, som består av två motoraxoner, projicerar ipsilateralt längs segmentgränsen mot inre muskeln 25 och gör synapser med den laterala bipolära dendritiska neuronen (LBD) iPeriferin 7 ( figur 2A ). Dessa målmuskelinnervationer kräver inte bara selektiv defaskikulering av motoraxoner vid specifika valpunkter, utan också inriktning på muskeligenkänning. Dessutom finns vissa förmodade mesodermala styrpostceller som fungerar som mellanmål i både ISN och SNa-vägarna, men inte längs ISNb-vägen 4 . Detta kan antyda att ISNb-motoraxonvägsfinansiering kan regleras på ett distinkt sätt jämfört med ISN- och SNa-motoraxonvägledning och det indikerar också att perifermotoraxonvägledning ger en attraktiv experimentell modell för att studera skillnaden eller bevarade roller i en enda styrningsledning Molekyl 8
Detta arbete presenterar en standardmetod för att visualisera de axonala projiceringsmönstren hos embryonala neuroner i Drosophila . De beskrivna protokollen innefattar hur man dissekerar fasta embryon färgade med 1D4aNtibody och bearbetas i 3,3'-diaminobenzidin (DAB) för fileterade preparat. En kritisk fördel med de platta förberedelserna av fasta embryon är den bättre visualiseringen av axonala utsprång och muskelmönster i periferin. Vidare visar detta arbete hur man genotypar fasta embryon för att sortera de önskade mutantembryonerna med hjälp av LacZ-färgmetoden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Framställning
- Framställ 500 ml fosfatbuffrad saltlösning (PBS) med t-oktylfenoxipolyetoxietanol (PBT) -lösning genom tillsats av 0,5 g bovint serumalbumin (BSA) och 0,5 ml t-oktylfenoxipolyetoxietanol (se tabell över material) till 500 ml 1X PBS Och omröring i minst 30 min. Förvara vid 4 ° C. Använd när det är relativt friskt och förvara lösningen i en ren flaska.
- Gör 10 ml 4% paraformaldehyd genom att tillsätta 2,5 ml 16% -ig paraformaldehydlösning och 1 ml 10x PBS till 6,5 ml avjoniserat vatten. Förvara vid 4 ° C och använd inom en vecka.
FÖRSIKTIGT: Undvik hudkontakt med paraformaldehydlösningen eftersom det är mycket giftigt. - Gör X-Gal-substrat (10% vikt / volym X-Gal i dimetylsulfoxid (DMSO)) genom att lösa 0,1 g X-Gal-substrat per 1 ml DMSO. Förvaras vid -20 ° C i 100 μl alikvoter.
- Gör X-Gal-färgningslösning med användning av 10 mM fosfatbuffert (pH 7,2), 150 mM NaCl, 1 mM MgCl2, 3 mMK4 [FeII (CN) 6 ], 3 mM K3 [FeIII (CN) 6 ] och 0,3% t-oktylfenoxipolyetoxietanol. Förvara vid 4 ° C i mörkret.
- Gör 3% väteperoxidlösning genom att späda 30% lager väteperoxid 1:10 med avjoniserat vatten.
- Gör 3,3'-diaminobenzidin (DAB) -lösningen genom att fullständigt lösa 1 tablett (10 mg) DAB i 35 ml frisk PBT-lösning. Filtrera genom ett 0,2 μm sprutfilter och lagra vid -20 ° C i 910 μl alikvoter.
VARNING: Kassera allt DAB-avfall i blekmedel för att förstöra DAB. - Gör äggplattor med äppeljuice. Tillsätt 35 g agar och 1 liter avjoniserat vatten till en 2 liter kolv. Tillsätt 33 g sackaros, 2 g tegosept och 375 ml äppeljuice till en 1 liter kolv. Smält dem genom autoklavering i 30 minuter. Låt båda lösningarna svalna till ca 60 ° C. Kombinera och blanda dessa lösningar bra genom omröring. Häll ~ 11 ml kombinerad lösning per 60 mm odlingsskål.
- Gör jästpasta genom att blanda bakare jaSt i avjoniserat vatten (1: 0,8 förhållande) och lagra vid 4 ° C.
2. Embryosamling (dag 1)
- Samla unga kvinnliga och manliga flugor (yngre än 5 dagar), och under 1-2 dagar, behåll dem i en plastbägarebur med en äggplatta (60 mm x 15 mm) som innehåller en liten mängd jästpasta i mitten.
- För den optimala uppsamlingen av sena scenen 16 embryon, sätt upp en flaskbur med flugor (> 50) klockan 5 och låt dem lägga ägg vid 25 ° C i 3 timmar.
- Överför flugorna till en färsk matflaska.
- Stäng äggplattan med locket och inkubera den upp och ner vid 25 ° C i en fuktig inkubator (~ 70% fuktighet) över natten.
3. Framställning av embryon för immunförstärkning (dag 2)
- Tillsätt 1,8 ml PBT-lösning till äggplattan runt 10:20 och använd en bomullspinne för att lossa embryonerna från plattan medan du lutar den.
Anm .: Genom att mjuka mjukningen av jästpasta med hjälp av en bomullPå swab, lösa det om ett stort antal embryon finns på den. Börja samla embryonerna ~ 40 min före fixering (runt 11:00). - Överför embryonerna från äggplattan till en 1,5 ml mikrotub med hjälp av en pipettspets med 1 ml.
- Låt embryonerna ligga ner och aspirera PBT-lösningen så mycket som möjligt. Skölj embryon två gånger med 1 ml PBT-lösning. Aspirera PBT-lösningen så mycket som möjligt.
- Fyll röret med 1 ml 50% blekmedel ( dvs utspätt i avjoniserat vatten) och dechorionera embryonerna genom att inkubera dem på en nutator i 3 minuter vid rumstemperatur (RT).
Obs! Det här steget dödar inte dechorerade embryonerna. - Låt dechorerad embryon sätta sig ner, aspirera 50% blekmedel så mycket som möjligt och skölj embryon 3 gånger med 1 ml PBT-lösning.
- Tillsätt 0,5 ml heptan och tillsätt sedan 0,5 ml 4% paraformaldehydlösning till röret vid RT vid omkring 11:00 AM.
- InkuberaEmbryon på en nutator i 15 min vid RT.
- Ta bort 4% paraformaldehydlösningen (bottenskiktet).
- Tillsätt 0,5 ml 100% metanol och devitellinize embryonerna genom att skaka röret kraftigt under 30 s.
- Ta bort heptan ( dvs toppskiktet).
- Tillsätt 0,5 ml 100% metanol och skaka röret kraftigt under 10 s.
- Låt embryonerna slå sig ned genom att knacka på röret och aspirera metanolen så mycket som möjligt. Skölj embryon med 1 ml 100% metanol, skaka i mindre än 10 s.
Obs! Utvidgad exponering för metanol förstör β-Gal-aktivitet. - Ta bort metanol och skölj de devitelliniserade embryon 3 gånger med 1 ml PBT-lösning.
4. Genotypning av embryonerna med användning av LacZ-färgning (dag 2)
- Tillsätt 1 ml PBT-lösning i röret och inkubera röret i ett 37 ° C värmeblock eller vattenbad under 15 minuter.
- Under inkubation sätt X-Gal-färgningslösning (1 ml per tuVara) vid 65 ° C i ett vattenbad tills det blir grumligt. Inkubera det i ett 37 ° C vattenbad.
- Aspirera PBT-lösningen och tillsätt 1 ml X-Gal-färglösning och 20 μl X-Gal-substrat till röret.
- Inkubera röret vid 37 ° C med näring tills en blå fällning är uppenbar.
Obs! Inkubationstiden för 2 : e och 3: e blåbalanseringstiden sträcker sig i allmänhet från 2-4 timmar. - Ta bort X-Gal-färglösningen och skölj embryon 3 gånger med 1 ml RT PBT-lösning.
- Med hjälp av en nålprov eller pincett sorterar man embryon av den önskade genotypen ( dvs. icke-färgade vita embryon) med ett ljusspridningsmikroskop (1.6X-2.5X-mål).
Obs! Eftersom några blåa balancers, såsom CyO, actin-LacZ och TM3, actin-LacZ , bär en transgen konstruktivt uttryckande bakteriell p-Gal (LacZ) under kontrollen av aktinpromotorn innehåller embryonfärgade blå på allestädes närvarande sättEn eller två kopior av blåbalanskromosomer. Därför är icke-färgade vita embryon homozygota för den önskade dödliga allelen.
5. Immunostaining av embryon med anti-fasciclin II-antikroppar (dag 2-3)
- Samla och överför embryon av den önskade genotypen ( dvs. icke-färgade vita embryon) till en 0,5 ml mikrotub med en 1 ml pipettips.
Obs! I detta steg kan embryonerna grovt iscenesatt enligt morfologiska kriterier, inklusive segmentets segmenteringsmönster och huvudets och svansens 9 strukturer. Under huvudinvolutionen, mellan 10 och 16 timmar efter att äggen har lagts, genomgår embryot en uttalad minskning av det främre segmentet 9 . - Tvätta embryon en gång med 0,4 ml PBT-lösning och tillsätt 0,3 ml blockerande lösning (5% normalt get serum och 5% DMSO i PBT lösning).
- Blockera embryonerna med näring vid RT i 15 minuter.
- Tvätta embryonerna 4 gånger med 0,4 ml PBT-lösning i minst 20 minuter per tvätt.
- Tillsätt 0,3 ml blockerande lösning (5% normalt get serum i PBT lösning) innehållande get anti-mouse-HRP antikropp (2 μg / ml) och inkubera röret med näring vid RT över natten.
- Tvätta embryonerna 6 gånger med 0,4 ml PBT-lösning i minst 20 minuter per tvätt.
- Tillsätt 0,3 ml DAB-lösning till röret.
VARNING: Använd handskar och placera alla DAB-avfall / rör / tips i blekmedel. - Tillsätt 2 μl 3% väteperoxid och inkubera röret i mörkret med näring vid RT tills den önskade mängden fällning produceras.
Anm .: Inkubationstiden för 1D4 immunhistokemi ligger i allmänhet från 0,5-1 h. - Tvätta embryonerna 4 gånger med 0,4 ml PBT-lösning.
VARNING: Ta bort DAB-lösningen och de två första tvättarna med en pipett och diSkura dem i blekmedel. - Tillsätt 0,2 ml monterings 70% glycerol / PBS-lösning i röret och förvara vid RT eller 4 ° C.
Obs: Håll röret borta från ljuset. Tydligare preparat kan erhållas genom att placera embryon i en 90% glycerol / PBS-lösning 10 . Det är emellertid svårare att dissekera embryon rensade i 90% glycerol / PBS-lösning än de som rensas i 70% glycerol / PBS-lösning 10 .
6. Staging, Dissecting, Mounting och Imaging Embryos (Dag 4)
- För staging överför embryon jämviktad med 70% glycerol / PBS på en glasskiva.
- Samla sena scenen 16 embryon som har buk segment 7 (A7), A8 och A9 ISN nerver som konvergerar för att röra varandra eller / och har midgut som är indelad i tre band.
Obs! Embryon färgade med 1D4 antikropp kan arrangeras baserat på projiceringsmönstren för ISN och ISNb motoraxon. Efter avslutat CNS, A7, A8 och A9 ISN neRves av sena scenen 16 embryon konvergerar för att röra varandra och därefter diverga för att sträcka sig långt ut till dorsala musklerna (pilhuvudet i Figur 1A ). I mellanstadiet-16-embryon sträcker sig emellertid A7 ISN-nerver parallellt med A8 / A9-nerverna (kvadratkonsol i figur 1B ). Dessutom är projiceringsaxlarna för A6 ISNb-nerverna (vinkelräta mot de ventrolaterala musklerna) i båda hemisegmenten i linje med den bakre änden av CNS-längsgående axonfasikuler (pilar och en linje i figur 1C ). Dessa morfologiska kriterier varierar något mellan olika genotyper. Alternativt kan embryon arrangeras baserat på tarmmorfologi 9 , 11 . Före stadium 17 har midgut en hjärtliknande form, medan midgutet är indelat i tre band vid steg 17 12 . - Dissektera embryonerna.
- Använda en 1 mL-spruta, flytta varje embryo ur glycerol-droppen och placera embryot ventral-framsidan uppåt. Klipp av den främre delen på 1/4 av kroppslängden och den mest bakre regionen som är fri från motoraxoner.
- Använd en nålpropp, flytta det slutna embryot ur glycerol-droppen, rulla för att rikta det uppåt och placera det horisontellt i fältet.
Obs! När embryot flyttas ut från glycerol-droppen, gör en liten bit glycerol i samband med embryot det klibbigt. - Klipp embryot längs dorsalt mittlinje med en enda mycket fin tungstennål 13 . Gör ett litet snitt vid embryoens bakre ände och fortsätt sedan att skära ner den dorsala mittlinjen mot framsidan; Skärning i motsatt riktning är också bra.
- Med hjälp av en nålprofil ska du flytta mittlinjeförskjutet embryo i glycerolfallet, placera det dorsalt upp och ta bort tarmen från kroppsväggen genom att vikla ut varje kroppsvägg i en ventrolateral (diagonal) riktning (2.5X mål).
Obs! Se till att dorsal mittlinjen är helt skuren, vilket resulterar i fullständig separation mellan vänster och höger kroppsvägg. - Förskjut försiktigt det mittlinjeklippta embryot ur glycerolfallet och lägg sedan två flikar av kroppsväggen ned på glasskivan med en fin nålprofil (2,5x objektiv).
- Använd en mycket fin volframnål, ta bort de inre organen från det dissekerade embryot genom att trycka dem i sidled (5X-objektiv).
Obs! En mer detaljerad beskrivning av ett annat liknande dissektionsförfarande finns på webbplatsen 5 .
- För montering tillsätt 2-3 μL 70% glycerol / PBS-lösning till rena, dissekerade embryon och överföra dem till en ny glasdosa med 8 μL 70% glycerol / PBS-lösning med en fin nålprov. Centrumet (2.5X objektiv).
- Sätt på en täckglas (18 mm x 18 mm). Försegla kanterna på täckglaset med vanlig nagellack (antingenKlar eller färgad är bra).
- Fånga bilder vid högupplösning (20X, 40X och 63X oljedämpningsmål) under ett DIC-ljusmikroskop enligt DIC-tillverkarens instruktioner.
Obs! Bättre visualisering och fenotypisk karakterisering, speciellt för ISNb-motoraxoner, kan framställas med hjälp av ett 63X oljedämpningsmål.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Exakta kopplingar mellan motoraxon och målmuskler under neural utveckling beror på selektiv axonaxonavstängning och måligenkänning vid specifika valpunkter 4 . I Drosophila regleras selektiv avstängning mellan motoraxoner delvis av den kombinerade verkan av klass 1 och 2 semaforiner (Semas), inklusive Sema-1a, Sema-2a och Sema-2b 8 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 . Därför leder förlusten av Sema-1a- funktionen ofta till misslyckandet av ISNb-axoner för att defasciculera vid specifika valpunkter, vilket får dem att uppvisa en onormalt tjock morfologi (pilhuvud i figur 2C ). I vildtypembryon sträcker sig åtminstone 7 motorneuroner och fasciculerar sina axoner för att bilda ett ISNb-nervgrenen ( Figur 2A ). När ISNb-nervgrenen når en valpunkt, som ligger mellan musklerna 6 och 7, defaskulerar två axoner selektivt från huvud ISNb-buntet och därefter inverterar musklerna 6 och 7 ( Figur 2B ). Vid nästa valpunkt, som ligger mellan musklerna 6, 13 och 30, defasciculerar ytterligare tre motoraxoner selektivt till innerverande muskler 13, 14 och 30 ( Figur 2B ). De återstående två axonerna sträcker sig dorsalt för att nå sista valpunkten nära kanten av muskeln 12, varigenom muskeln 12 inverteras i motsatt riktning ( Figur 2B ). Dessa resultat visar tydligt att det filetterade preparatprotokollet tillhandahåller ett användbart verktyg för att studera de gener som krävs för motoraxonstyrning.
Figur 2: Motoraxonprojektionsmönster i vildtyps- och Sema-1a- mutantembryon. ( A - C ) Filletterad beredning av sensteg-16 embryon färgade med FasII antikropp. Anterior är kvar och ventral är nere. Schematiska diagram som visar axonprojektionsmönstren representerade i varje panel. Skalstängerna = 15 μm. ( A ) Ett ljusfältfotografi av två sekventiella bukhemisegment, A3 och A4, i vildtypembryon. Tre bilateralt symmetriska axelbuntar i längdriktningen finns i CNS. De normala innerveringsmönstren för ISNb-, SNa-, ISN- och TN-motoraxoner indikeras av rutorna och en pil i periferin. Den laterala bipolära dendritneuronen (LBD), som innervatar alarymusklerna, är indicatEd av en pilhuvud. I schematiskt diagram presenteras nervgrenarna och innerveringsmönstren för ISNb (i brunt), SNa (i blått), ISN (i grönt) och TN (i gula) motorneuroner och deras muskler. Cellcellsställningarna hos dessa motorneuroner i CNS visas också i sina egna färger. ( B ) I vildtypsembryon, projicerar ISNb-axonerna till de ventrolaterala musklerna, vilka är numrerade och innervar dem vid specifika valpunkter (pilar i DIC-bilden). ( C ) I Sema-1a -funktionsmutanter misslyckas ISNb-axoner ofta inte att defasciculera från varandra mellan musklerna 6 och 13 (pilhuvud i DIC-bilden). Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detaljerna för motorisk axonstyrningsdefekter poängsätts snabbare och med bättre noggrannhet av den fileterade beredningen av DAB-färgade embryon än genom laserskanning av konfokal mikroskopi av fluorescensmärkta sådana. Därför passar den fileterade beredningen av fasta och 1D4-färgade embryon bäst för den funktionella karaktäriseringen av vägledningsmolekyler. Fyra huvudklasser av vägledningssignaler, inklusive netrins, Slits, semaforiner (Semas) och ephrins, och deras kognitiva receptorer har evolutionärt bevarat roller över maskar, flugor och ryggradsdjur 20 . Bland familje-molekyler med rondeller (Robo) som fungerar som receptorer för slits identifierades Drosophila Robo för att mediera repulsiv ledningsfunktion i CNS 6 , 21 . Semas är en stor familj av vägledande molekyler som binder till plexinhaltiga receptorkomplex 22 . Axas ledningsfunktion för SemasUpptäcktes först i gräshoppa CNS 14 . Därefter karakteriserades klass 1-transmembran-semaforen Sema-1a i stor utsträckning i Drosophila . Sema-1a, som inte bara fungerar som en ligand för plexin A, men också som en receptor för en okänd ligand, spelar en viktig roll vid axonaxonavstängning vid specifika valpunkter under embryonal neural utveckling 15 , 16 , 17 , 18 ( Figur 2C ).
Det finns några vanliga felsökningssteg som kan uppstå med det aktuella protokollet. Först i steg 3,9-3,13 kan embryonerna devitelliniseras med låg effektivitet om alltför många eller för små embryon används i metanol-devitelliniseringsproceduren. I detta fall rekommenderas att använda en bäddvolym på 40-80 μl fasta embryon för devitellinisering vid steg 3.5. För det andra, i stPs 3,9-3,13, svag X-Gal-färgning kan hända vid längre exponering för metanol eller ofullständig heptanavlägsnande, eftersom metanol som används som fixativ förstör β-Gal-aktivitet. I detta fall är det bäst att devitelliniseringsproceduren med metanol i steg 3.9-3.13 utförs så snabbt som möjligt. Dessutom kan resterande heptan som solubiliseras i metanol störa färgningen; Därför är det bäst att ta bort så mycket metanol som möjligt i steg 3.11-3.13.
Det nuvarande fileterade preparatprotokollet kan appliceras på förlust av funktion och förstärkande genetiska skärmar för att identifiera nya gener som är involverade i motoraxon-pathfinding och måligenkänning. En nackdel med detta protokoll är emellertid att det är ganska tidskrävande att dissekera fasta embryon för att generera fileterade preparat. För att övervinna detta problem kan fenotypisk karakterisering av de axonala utsprången övervakas i en helmonterad beredning av 1D4-färgad embRyos, även om den här metoden ger lågupplöslig visualisering av axonprojektionerna i periferin. Ändå har det fullständiga beredningsprotokollet visat sig vara en effektiv metod för screening av axon-ledningsgener 4 . Ett alternativt protokoll med användning av den levande dissektionen av fluorescensmärkta embryon utvecklades nyligen för systematisk screening 11 . Live-dissektionsprotokollet möjliggör relativt snabb förberedelse för fenotypisk analys 11 . Detta protokoll är emellertid inte tillräckligt för embryon som är äldre än början av steg 17 11 .
Det här beskrivna filetförberedande protokollet kan användas för att undersöka proteinuttrycksmönster med olika antikroppar. Dessutom kan detta protokoll också tillämpas på Drosophila embryon vid olika utvecklingsstadier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författaren förklarar att han inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Jag tackar Alex L. Kolodkin, som jag lärde mig detta fileterade preparatprotokoll i sitt laboratorium. Jag tackar också Young Gi Hong för tekniskt bistånd. Denna studie stöddes av NRF-2013R1A1A4A01011329 (SJ).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | t-Octylphenoxypolyethoxyethanol |
| 16% Paraformaldehyde Solution | Ted Pella | 18505 | |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S5886 | |
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P5405 | |
| Sodium Phosphate Dibasic | Sigma-Aldrich | 30435 | |
| Sodium Phosphate Monobasic | Sigma-Aldrich | 71500 | |
| X-Gal Substrate | US Biological | X1000 | X-Gal (5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-b-D-galactoside galactopyranoside) |
| Dimethyl Sulfxide | Sigma-Aldrich | D4540 | |
| Magnesium Chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Potassium hexacyanoferrate(II) trihydrate | Sigma-Aldrich | P9387 | |
| Potassium hexacyanoferrate(III) | Sigma-Aldrich | 244023 | |
| Hydrogen Peroxide | Sigma-Aldrich | 216763 | |
| 3,3'-diaminobenzidine Tetrahydrochloride | Sigma-Aldrich | D5905 | |
| Agar | US Biological | A0930 | |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-3 | |
| Tegosept (Methy 4-Hydroxybenzoate) | Sigma-Aldrich | H5501 | |
| Culture Dish (60 mm) | Corning | 430166 | |
| Tricon Beaker | Simport | B700-100 | This is used to make a plastic beaker cage for embryo collection. |
| Yeast | Societe Industrielle Lesaffre | Saf Instant Yeast Red | |
| Cotton Swab (Wooden Single Tip Cotton PK100) | VWR | 14220-263 | |
| Eppendorf Tube (1.5 ml) | Sarstedt | #72.690 | |
| Bleach | The Clorox Company | Clorox | |
| Heptane | Sigma-Aldrich | 246654 | |
| Methanol | J.T. Baker | UN1230 | |
| Normal Goat Serum | Life Technologies | 16210-064 | |
| Anti-FasciculinII Antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | 1D4 anti-Fasciclin II | |
| Goat Anti-mouse-HRP Antibody | Jackson Immunoresearch | 115-006-068 | AffiniPure F(ab')2 Fragment Goat Anti-Mouse IgG+IgM (H+L) (min X Hu, Bov, Hrs Sr Prot |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G9012 | |
| Slide Glass | Duran Group | 235501403 | |
| Coverslip | Duran Group | 235503104 | 18 x 18 mm |
| 1 ml Syringe | Becton Dickinson Medical(s) | 301321 | |
| Tungsten Needle | Ted Pella | #27-11 | Tungsten Wire, ø0.13mm/6.1m (ø.005"/20 ft.) |
| Nutator (Mini twister) | Korean Science | KO.VS-96TWS | Alternatively, BD Clay Adams Brand Nutator (BD 421125) |
References
- Bate, M. The embryonic development of larval muscles in Drosophila. Development. 110 (3), 791-804 (1990).
- Landgraf, M., Thor, S. Development of Drosophila motoneurons: specification and morphology. Semin. Cell Dev. Biol. 17 (1), 3-11 (2006).
- Grenningloh, G., Rehm, E. J., Goodman, C. S. Genetic analysis of growth cone guidance in Drosophila: fasciclin II functions as a neuronal recognition molecule. Cell. 67 (1), 45-57 (1991).
- Vactor, D. V., Sink, H., Fambrough, D., Tsoo, R., Goodman, C. S. Genes that control neuromuscular specificity in Drosophila. Cell. 73 (6), 1137-1153 (1993).
- Zinn Lab. , California Institute of Technology. Available from: https://www.its.caltech.edu/~zinnlab/motoraxons.html (2017).
- Seeger, M., Tear, G., Ferres-Marco, D., Goodman, C. S. Mutations affecting growth cone guidance in Drosophila: genes necessary for guidance toward or away from the midline. Neuron. 10 (3), 409-426 (1993).
- Thor, S., Thomas, J. B. The Drosophila islet gene governs axon pathfinding and neurotransmitter identity. Neuron. 18 (3), 397-409 (1997).
- Roh, S., Yang, D. S., Jeong, S. Differential ligand regulation of PlexB signaling in motor neuron axon guidance in Drosophila. Int. J. Dev. Neurosci. 55, 34-40 (2016).
- Campos-Ortega, J. A., Hartenstein, V. The embryonic development of Drosophila melanogaster. , Springer-Verlag. New York. (1985).
- Patel, N. H. Imaging neuronal subsets and other cell types in whole mount Drosophila embryos and larvae using antibody probes. Methods in cell biology, vol 44. Drosophila melanogaster: practical uses in cell biology. Goldstein, L. S. B., Fyrberg, E. 44, Academic Press. New York. 445-487 (1994).
- Lee, H. K., Wright, A. P., Zinn, K. Live dissection of Drosophila embryos: streamlined methods for screening mutant collections by antibody staining. J. Vis. Exp. (34), (2009).
- Hartenstein, V. Stages of Embryonic Development. Atlas of Drosophila. development. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. Available from: http://www.sdbonline.org/sites/fly/atlas/52.htm 52 (1993).
- Brady, J. A simple technique for making very fine, durable dissecting needles by sharpening tungsten wire electrolytically. Bull. World Health Organ. 32 (1), 143-144 (1965).
- Kolodkin, A. L. Fasciclin IV: sequence, expression, and function during growth cone guidance in the grasshopper embryo. Neuron. 9 (5), 831-845 (1992).
- Jeong, S., Juhaszova, K., Kolodkin, A. L. The Control of semaphorin-1a-mediated reverse signaling by opposing pebble and RhoGAPp190 functions in Drosophila. Neuron. 76 (4), 721-734 (2012).
- Winberg, M. L. Plexin A is a neuronal semaphorin receptor that controls axon guidance. Cell. 95 (7), 903-916 (1998).
- Yang, D. S., Roh, S., Jeong, S. The axon guidance function of Rap1 small GTPase is independent of PlexA RasGAP activity in Drosophila. Dev. Biol. 418 (2), 258-267 (2016).
- Yu, H. H., Araj, H. H., Ralls, S. A., Kolodkin, A. L. The transmembrane Semaphorin Sema I is required in Drosophila for embryonic motor and CNS axon guidance. Neuron. 20 (2), 207-220 (1998).
- Hartenstein, V. Stages of Embryonic Development. Atlas of Drosophila. development. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. Available from: http://www.sdbonline.org/sites/fly/atlas/52.htm 52 (1993).
- Dickson, B. J.
- Kidd, T. Roundabout controls axon crossing of the CNS midline and defines a novel subfamily of evolutionarily conserved guidance receptors. Cell. 92 (2), 205-215 (1998).
- Pasterkamp, R. J. Getting neural circuits into shape with semaphorins. Nat. Rev. Neurosci. 13 (9), 605-618 (2012).
