Summary
이 연구는 후기 단계 -16 Drosophila melanogaster 배아의 운동 뉴런 예측을 시각화하기위한 표준 면역 조직 화학 법을 상세히 설명합니다. FasII 항체로 염색 된 고정 배아의 필렛 된 준비는 신경 발달 중에 모터 축삭 돌연변이 및 표적인지에 필요한 유전자를 특성화하는 강력한 도구를 제공한다.
Abstract
기능적 신경근 회로의 구축은 모터 축색 돌기와 표적 근육의 정확한 연결에 의존한다. 모터 뉴런은 주변 세포 외 환경에서 발생하는 많은 수의 축색 유도 신호에 반응하여 특정 경로를 따라 이동하기 위해 성장 원뿔을 확장시킵니다. 성장 원뿔 표적 인식은 또한 신경근 특이성에 중요한 역할을합니다. 이 연구는 후기 무대 16 Drosophila melanogaster 배아의 운동 뉴런 예측을 시각화하기위한 표준 immunohistochemistry 프로토콜을 제공합니다. 이 프로토콜에는 원하는 돌연변이 배아를 분류하기위한 genotyping 절차를 포함한 몇 가지 주요 단계가 포함되어 있습니다. 배아에 fasciclin II (FasII) 항체를 표지하기위한 면역 염색 절차; 및 해부 절차, 고정 배아에서 filleted 준비를 생성합니다. 말초의 모터 축삭 돌기 및 근육 패턴은 filleted embryos의 편평한 준비 과정에서 wh보다 훨씬 더 잘 시각화됩니다올레 - 마운트 배아. 따라서, FasII 항체로 염색 된 고정 배아의 필렛 된 준비는 모터 축색 돌연변이 및 표적 인식에 필요한 유전자를 특성화하기위한 강력한 도구를 제공하며, 기능 상실 및 기능 상실 유전 스크린 모두에 적용될 수있다 .
Introduction
배아 발생 과정에서 모터 축삭과 표적 근육 사이의 정확하고 선택적 연결은 Drosophila 애벌레의 정상적인 이동에 필수적 입니다. 복부 hemisegment A2-A7 각각에서 30 개의 근육 섬유의 배아 패터닝은 단계 16 1 에 의해 확립된다. 복부 신경 코드에서 생성 된 36 개의 운동 뉴런은 축삭을 주변으로 확장시켜 특정 표적 근육을 신경 자극합니다 2 . 모터 축색 돌연변이와 표적인지는 항체 (마우스 단클론 항체 1D4) 3 , 4로 면역 조직 화학으로 시각화 할 수 있습니다. 야생형 배아에서 모터 축삭 돌기 패턴의 다중 이미지는 웹 5에서 사용할 수 있습니다. 1D4 항체는 배아 중추 신경계 (CNS) 4 정중선의 각 측면에있는 모든 모터 축삭 및 세 개의 세로축 축삭 줄기를 표시합니다 , 6 ( 도 1C 및 도 2A ). 따라서 FasII 항체를 이용한 면역 조직 화학은 운동 축삭 유도 및 표적 인식의 기본이되는 분자 메커니즘을 증명하기 위해 신경근 연결에 필요한 유전자를 확인하는 강력한 도구를 제공합니다.
복부 hemisegments A2-A7의 각각에서, 모터 축삭 돌기는 2 개의 주요한 신경 가지로 분열 신경 (SN) 및 intersegmental 신경 (ISN) 2 및 4 , 및 작은 신경 분기, TN ) 7 . SN은 ISN, ISNb 및 ISNd 2 , 4 라고 불리는 3 개의 신경 가지로 분할하는 반면, SN은 선택적으로 탈 섬유되어 두 개의 신경 가지 인 SNa 및 SNc를 발생시킵니다. 그 중에서도 ISN, ISNb 및 SNa 모터 축삭투상 패턴은 말기 16 기 배아가 FasII 항체로 염색되고 필렛 처리되면 가장 정확하게 시각화됩니다 ( 그림 1C 및 그림 2A ). ISN 운동 뉴런은 축삭을 등쪽 근육 1, 2, 3, 4, 9, 10, 11, 18, 19, 20 2 , 4 ( 그림 2A )를 자극하도록 확장시킵니다. ISNb 모터 뉴런은 6, 7, 12, 13, 14, 28 및 30 2 , 4 ( 그림 2A 및 2B)의 복근 근육을 자극합니다. SNa 신경 가지는 측면 근육 5, 8, 21, 22, 23 및 24 2 , 4 ( 그림 2A )에 신경을 작용하도록 돌출합니다. 두 모터 엑손으로 구성된 TN은 근육을 자극 할 수 있도록 분절 경계를 따라 일 측적으로 돌출하고, 근육에서 신경 양측 신경근 (lateral bipolar dendritic neuron, LBD)과 시냅스를 만든다.( 도 7 ). 이러한 목표 근육 내향은 특정 선택 지점에서 모터 축삭의 선택적 탈 섬유화뿐만 아니라 근육 인식을 목표로합니다. 또한, 중간 표적으로 작용하는 일부 추정 중배엽 안내 표지 세포는 ISN 및 SNa 경로 모두에서 발견되었지만 ISNb 경로에서는 발견되지 않았다. 이것은 ISNb 모터 축삭 길 찾기가 ISN 및 SNa 모터 축삭 유도와 비교하여 뚜렷한 방식으로 조절 될 수 있음을 시사하며, 또한 말초 모터 축삭 유도가 단일 안내 큐의 차별적 인 또는 보존 된 역할을 연구하기위한 매력적인 실험 모델을 제공한다는 것을 나타낸다 분자 8 .
이 작품은 Drosophila에서 배아 운동 뉴런의 axonal 투영 패턴을 시각화하는 표준 방법을 제공합니다. 설명한 프로토콜은 1D4로 얼룩진 고정 배아를 해부하는 방법을 포함filtted 제제의 경우 3,3'- 디아 미노 벤지딘 (DAB)으로 가공한다. 고정 배아의 편평한 준비의 한 가지 중요한 이점은 주변에서 축삭 돌기 및 근육 패턴의 더 나은 시각화입니다. 또한,이 작품은 또한 LacZ 얼룩 방법을 사용하여 원하는 돌연변이 배아를 정렬 고정 배아를 유전자형하는 방법을 보여줍니다.
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Protocol
1. 준비
- 1X PBS 500 mL에 소 혈청 알부민 (BSA) 0.5 g과 t-Octylphenoxypolyethoxyethanol (표 2 참조) 0.5 mL를 첨가하여 t- 옥틸 페녹시 폴리에 톡시 에탄올 (PBT) 용액으로 인산염 완충 생리 식염수 (PBS) 30 분 이상 교반 하였다. 4 ° C에서 보관하십시오. 비교적 신선한 상태에서 사용하고 용액을 깨끗한 병에 보관하십시오.
- 탈 이온수 6.5 mL에 16 % 스톡 파라 포름 알데히드 용액 2.5 mL와 10 mL PBS 1 mL를 넣어 4 % 파라 포름 알데히드 10 mL를 만든다. 4 ° C에서 보관하고 일주일 이내에 사용하십시오.
주의 : 파라 포름 알데히드 용액은 독성이 강하기 때문에 피부와의 접촉을 피하십시오. - 1 ML의 DMSO 당 0.1 g의 X-Gal 기질을 용해하여 X-Gal 기질 (10 % w / v X-Gal / dimethyl sulfoxide (DMSO))을 만든다. 100 μL 분취 량으로 -20 ° C에서 보관하십시오.
- 10 MM 인산 완충액 (산도 7.2), 150 MM NaCl, 1 MM MgCl 2 , 3m을 사용하여 X - Gal 얼룩 솔루션을 확인하십시오MK4 [FeII (CN) 6 ], 3 mM K3 [FeIII (CN) 6 ], 및 0.3 % t- 옥틸 페녹시 폴리에 톡시 에탄올. 어둠 속에서 4 ° C에서 보관하십시오.
- 탈 이온수로 30 % 스톡 과산화수소 1:10을 희석하여 3 % 과산화수소 용액을 만드십시오.
- 신선한 PBT 용액 35 mL에 DAB 1 정 (10 mg)을 완전히 녹여 3,3'- 디아 미노 벤지딘 (DAB) 용액을 만든다. 0.2 μm 주사기 필터를 통해 여과하고 -20 ℃에서 보관하십시오 (910 μL 분취 량).
주의 : 모든 DAB 폐기물을 표백제로 처리하여 DAB를 폐기하십시오. - 사과 주스로 달걀 접시를 만드십시오. 한천 35g과 탈 이온수 1L를 2L 플라스크에 넣는다. 1L 플라스크에 33g의 자당, 2g의 테 고세이트 및 375ml의 사과즙을 넣는다. 30 분 동안 고압 증기 멸균으로 그들을 녹입니다. 두 용액을 약 60 ° C로 식힌다. 이 용액을 잘 저 어서 혼합하고 혼합하십시오. 60mm 배양 접시 당 ~ 11mL의 혼합 용액을 붓습니다.
- 빵 굽는 사람을 혼합해서 효모 풀을 만드십시오(1 : 0.8 비율)에 넣고 4 ° C에서 보관하십시오.
2. 배아 컬렉션 (주 1)
- 젊은 암컷과 수컷 파리 (5 일 미만)를 모으고 1-2 일 동안 센터에 소량의 효모 페이스트가 들어있는 난 접시 (60mm x 15mm)가있는 플라스틱 비이 케이지에 넣어 유지하십시오.
- 후기 16 기 배아를 최적으로 채취하려면 오후 5 시경 파리 (> 50)로 병 케이지를 설치하고 25 ° C에서 3 시간 동안 알을 낳게하십시오.
- 파리를 신선한 음식 병으로 옮기십시오.
- 뚜껑을 달고 계란 접시를 닫고 25 ℃에서 거꾸로 가온하십시오. 가습기 배양기 (~ 70 % 습도) 하룻밤.
3. 면역 염색을위한 태아 준비 (2 일째)
- 오전 10시 20 분경에 계란 판에 PBT 용액 1.8 mL를 넣고 면봉을 사용하여 접시에서 태아를 느슨하게합니다.
참고 : 부드럽게 cott를 사용하여 효모 붙여 넣기를 매시함으로써면봉에 많은 배아가 발견 될 경우를 대비해 용해하십시오. 고정하기 전에 ~ 40 분 전에 태아 수집을 시작하십시오 (오전 11 시경). - 난 접시에서 1 ML 피펫 팁을 사용하여 1.5 ML의 마이크로 튜브로 배아를 전송합니다.
- 배아가 정착하고 가능한 한 PBT 솔루션을 대기음을 허용합니다. 배아를 PBT 솔루션 1 ML로 두 번 씻어. 가능한 한 많이 PBT 용액을 흡인하십시오.
- 50 % 표백제 ( 즉, 탈 이온수로 희석) 1 ML로 튜브를 채우고 실내 온도 (RT)에서 3 분 nutator에 배양하여 배아 dechorionate.
참고 :이 단계는 dechorionated 배아를 죽이지 않습니다. - dechorionated 배아가 정착되도록 가능한 50 % 표백제를 대기음, 그리고 PBT 솔루션 1 ML로 배아를 3 번 씻어.
- 헵탄 0.5 mL를 넣고 4 ° 파라 포름 알데히드 용액 0.5 mL를 실온에서 오전 11 시경에 관에 넣는다.
- 인큐베이터RT에서 15 분 동안 nutator에 배아.
- 4 % 파라 포름 알데히드 용액 (바닥층)을 제거한다.
- 100 % 메탄올 0.5 ML을 추가하고 격렬하게 30 초 동안 튜브를 흔드는하여 배아를 devitellinize.
- 헵탄 ( 즉, 상단 층)을 제거하십시오.
- 100 % 메탄올 0.5 ML을 추가하고 격렬하게 10 초 동안 튜브를 흔드십시오.
- 튜브를 도청하여 배아가 정착되도록 최대한 메탄올을 대기음. 10 초 미만 동안 흔들어 100 % 메탄올 1 ML로 배아를 씻어.
주 : 메탄올에 장시간 노출되면 β-Gal 활성이 파괴됩니다. - 메탄올을 제거하고 PBT 솔루션 1 ML로 devotellinized 배아를 3 번 씻어.
4. LacZ 얼룩을 사용하여 태아의 유전자형 결정 (2 일째)
- 튜브에 1 ML의 PBT 솔루션을 추가하고 15 분 37 ° C 열 블록 또는 수조에서 튜브를 품어.
- 배양하는 동안, X-Gal 염색 용액 (1 mL / tu) 65 ° C에서 수욕에서 흐려질 때까지. 37 ° C 수 욕조에서 그것을 품어.
- PBT 솔루션을 대기음 튜브에 X - Gal 얼룩 솔루션 1 ML 및 X - 갈색 기판 20 μL를 추가합니다.
- 푸른 침전물이 분명 때까지 계곡과 37 ° C에서 튜브를 품어.
참고 : 2 차 및 3 차 블루 밸런서의 배양 시간은 일반적으로 2 ~ 4 시간입니다. - X - Gal 얼룩 솔루션을 제거하고 1 ML의 RT PBT 솔루션으로 배아를 씻어 3 회.
- 바늘 프로브 또는 포 셉를 사용하여 원하는 유전자형 ( 즉, 비 얼룩 흰 배아)의 배아를 빛 해부 현미경 (1.6X - 2.5X 목적)과 손으로 정렬합니다.
주 : CyO, 액틴 -LacZ 및 TM3, 액틴 -LacZ 와 같은 일부 청색 밸런서는 액틴 프로모터의 제어하에 박테리아 β-Gal (LacZ)을 발현하는 트랜스 제닉 구조물을 지니고 있기 때문에, 유비쿼터스 방식으로 청색으로 착색 된 배아는블루 밸런서 염색체 하나 또는 두 개의 복사본. 따라서 염색되지 않은 흰 배아는 원하는 치사 대립 유전자에 대해 동형 접합체이다.
5. 항 Fasciclin II 항체로 태아의 Immunostaining (2-3 일)
- 수집 및 1 ML 피펫 팁을 사용하여 0.5 ML microtube에 원하는 유전자형 ( 즉, 비 얼룩 흰 배아)의 배아를 전송할 수 있습니다.
참고 :이 단계에서 배아는 표피의 세분화 패턴과 머리와 꼬리의 구조를 포함하여 형태 학적 기준에 따라 대략적으로 스테이징 될 수 있습니다. 머리가 빠져 나가는 동안, 난자가 놓인 후 10 시간에서 16 시간 사이에, 배아는 가장 앞쪽에있는 부분을 현저히 감소시킵니다. - 배아를 0.4 mL의 PBT 용액으로 한번 씻고 0.3 mL의 블로킹 용액 (5 % 정상 염소 혈청 및 5 % DMSO를 PBT 용액에 넣는다)을 넣는다.
- 15 분 RT에서 nutation과 배아를 차단합니다.
- 배양액을 0.4 mL의 PBT 용액으로 4 회 씻으십시오.
- 염소 항 마우스 HRP 항체 (2 μg / ML)를 포함하는 차단 용액 (PBT 용액에 5 % 정상 염소 5 %) 0.3 ML을 추가하고 하룻밤 RT에 nutration와 튜브를 품어.
- 배양액을 0.4 mL의 PBT 용액으로 6 회 씻으십시오.
- 튜브에 DAB 용액 0.3 mL를 넣는다.
주의 : 장갑을 착용하고 모든 DAB 폐기물 / 튜브 / 팁을 표백제에 넣으십시오. - 3 % 과산화수소 2 μL를 추가하고 침전물의 원하는 금액이 생산 때까지 RT에서 열차와 어둠 속에서 튜브를 품어.
참고 : 1D4 면역 조직 화학 요법의 배양 시간은 일반적으로 0.5-1 시간입니다. - 0.4 ML의 PBT 솔루션으로 배아를 4 번 씻으십시오.
주의 : DAB 용액을 제거하고 처음 두 번의 세척은 피펫과 di표백제에 그들을 두려워하십시오. - RT 또는 4 ° C에서 튜브에 70 % 글리세롤 / PBS 용액을 올려 놓고 0.2 mL를 넣으십시오.
참고 : 튜브는 빛으로부터 멀리하십시오. 배아를 90 % 글리세롤 / PBS 용액에 넣음으로써 더 깨끗한 준비를 할 수 있습니다 10 . 그러나, 90 % 글리세롤 / PBS 솔루션 10 에서 제거 된 것보다 90 % 글리세롤 / PBS 솔루션에서 제거 된 배아를 해부하는 것이 더 어렵습니다.
6. 준비, 해부, 설치 및 이미징 (4 일)
- 준비를 위해 70 % 글리세롤 / PBS로 평형 배아를 슬라이드 유리에 옮기십시오.
- 복부 부분 7 (A7), A8 및 A9 ISN 신경이 서로 닿기 위해 수렴하거나 / 또는 3 개의 밴드로 세분되는 중간 덩어리를 가진 늦은 무대 -16 배아를 수집합니다.
참고 : 1D4 항체로 얼룩진 태아는 ISN 및 ISNb 모터 axons의 투영 패턴을 기반으로 준비 할 수 있습니다. CNS, A7, A8 및 A9 ISN ne를 종료 한 후후기 16 단계 태아의 줄기는 서로 닿기 위해 수렴하고 이후에 서로 엇갈려서 등 근육으로 멀리 확장됩니다 ( 그림 1A의 화살촉). 그러나 16 단계 중반의 배아에서는 A7 ISN 신경이 A8 / A9 신경과 평행하게 확장됩니다 ( 그림 1B의 대괄호). 또한, 양쪽 hemisegments의 A6 ISNb 신경 (ventralateral 근육에 수직)의 투영 축은 대략 CNS 종축 axon fascicles ( 그림 1C의 화살표와 라인)의 후부와 정렬됩니다. 이러한 형태학적인 기준은 다른 유전형간에 다소 차이가 있습니다. 또는, 배아는 창자 형태학에 기초하여 준비 될 수있다 9 , 11 . 17 단계 이전에, midgut은 가슴과 같은 모양을 가지고있는 반면, midgut은 17 단계 12 단계로 세 개의 밴드로 세분됩니다. - 배아를 해부하십시오.
- 1m 사용L 주사기, 글리세롤 드롭에서 각 배아를 이동하고 배아 복부 - 얼굴을 위로 놓습니다. 전신 부분의 1/4과 전 축삭 돌기가없는 가장 후방 부위에서 앞쪽 부분을 잘라냅니다.
- 바늘 탐침을 사용하여 글리세롤 드롭에서 끝 컷 배아를 움직여 배면쪽으로 위로 향하게하고 롤을 필드에 수평으로 놓습니다.
참고 : 배아가 글리세롤 방울 밖으로 옮겨지면 배아와 관련된 글리세롤이 약간 끈적 거리게됩니다. - 하나의 매우 미세한 텅스텐 바늘 13을 사용하여 지느러미 중간 선을 따라 배아를 잘라내십시오. 배아의 후부 끝 부분에 작은 상처를 만들고 앞쪽을 향해 지느러미 중간 선을 계속 잘라내십시오. 반대 방향으로 절단해도 괜찮습니다.
- 바늘 탐침을 사용하여 정중선 절단 배아를 글리세롤 방울로 옮기고 등쪽면을 위로 향하게하고 각 몸 벽을 ventralateral (대각선) 방향으로 펼쳐서 몸 벽에서 창자를 분리합니다 (2.5X 목표).
참고 : 등쪽 중간 선이 완전히 절단되어 왼쪽 및 오른쪽 몸체 벽이 완전히 분리되도록하십시오. - 조심스럽게 정중선 컷 배아를 글리세롤 드롭 밖으로 이동하고 미세 바늘 프로브 (2.5X 객관적인)를 사용하여 유리 슬라이드에 몸 벽의 두 플랩을 내려 놓으십시오.
- 아주 미세한 텅스텐 바늘을 사용하여 내부 장기를 옆으로 밀어 (5X 객관적인) 해부 된 배아에서 제거하십시오.
참고 : 비슷한 해부 절차에 대한 자세한 설명은 웹 사이트 5 에서 찾을 수 있습니다.
- 장착을 위해 깨끗하고 해부 된 배아에 70 % 글리세롤 / PBS 용액 2 ~ 3 μL를 넣고 미세 바늘 프로브를 사용하여 7 μL의 70 % 글리세롤 / PBS 용액이 퍼져있는 새로운 유리 슬라이드로 옮깁니다 센터 (2.5X 대물 렌즈).
- 커버 슬립 (18mm x 18mm)을 착용하십시오. 정기 매니큐어로 커버 슬립의 가장자리를 봉인하십시오 (맑거나 채색이 좋다).
- 제조업체의 지침에 따라 차동 간섭 명암 (DIC) 광학 현미경으로 고해상도 (20X, 40X 및 63X 오일 침지 대물 렌즈)로 이미지를 캡처합니다.
참고 : 특히 ISNb 모터 축삭 돌기에 대한보다 나은 시각화 및 표현형 특성 분석은 63X 오일 침지 객관 물을 사용하여 생성 할 수 있습니다.
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Representative Results
신경 발달 동안 모터 축삭과 표적 근육 사이의 정확한 연결은 선택적 축삭 - 축색 반발과 특정 선택 지점에서의 표적 인식에 달려 있습니다 4 . 초파리에서 모터 축삭 사이의 선택 반발은 부분 1과 2 세마포린 (Sema-1a, Sema-2a, Sema-2b 8 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 . 따라서 Sema-1a 기능이 상실되면 ISNb 축삭 돌기가 특정 선택 지점에서 결석이 제거되어 비정상적으로 두꺼운 형태를 보이지 않게됩니다 ( 그림 2C의 화살촉). wildtype 배아에서, 적어도 7 모터 뉴런은 확장하고 축삭을 형성 ISNb 신경 가지 ( 그림 2A ). ISNb 신경 분지가 근육 6과 7 사이에있는 선택 지점에 도달하면, 두 개의 축삭이 주 ISNb 묶음에서 선택적으로 결말을 제거하고이어서 근육 6과 7을 자극합니다 ( 그림 2B ). 근육 6, 13 및 30 사이에있는 다음 선택 지점에서 또 다른 세 개의 모터 축삭은 근육을 13, 14 및 30 ( 그림 2B ) 신경을 자극하도록 선택적으로 모근 제거합니다. 나머지 두 개의 축색은 근육 12의 가장자리 근처의 마지막 선택 지점에 도달하기 위해 등쪽으로 확장되어 근육 12를 반대 방향으로 자극합니다 ( 그림 2B ). 이러한 결과는 filleted preparation protocol이 motor axon guidance에 필요한 유전자를 연구하는데 유용한 tool임을 보여줍니다.
그림 2 : 야생형 및 Sema-1a 돌연변이 배아에서 모터 축삭 투영 패턴. ( A - C ) FasII 항체로 염색 된 16 기 배아 말기의 준비. 앞쪽은 왼쪽이고 복부는 아래쪽입니다. 각 패널에 표시된 축 방향 투영 패턴을 보여주는 구성도. 눈금 막대 = 15 μm. ( A ) 야생형 배아에서 두 개의 순차적 인 복부 반상 (A3 및 A4)의 밝은 현장 사진. 3 개의 양측 대칭 종축 축삭 덩어리가 중추 신경계에 존재한다. ISNb, SNa, ISN 및 TN 모터 축삭의 정상적인 신경 분포 패턴은 주변에 상자와 화살표로 표시됩니다. 알레르기 근육을 자극하는 lateral bipolar dendrite neuron (LBD)화살촉에 의해 ed. 개략도에서, ISNb (갈색), SNa (파란색), ISN (녹색), TN (노란색) 운동 신경 및 그 표적 근육의 신경 가지 및 신경 분포 패턴을 제시한다. 중추 신경계에서 이러한 운동 신경 세포의 세포체 위치도 자신의 색깔로 표시됩니다. ( B ) 야생형 배아에서, ISNb 축색 돌기는 번호가 매겨진 비 측 근육에 투영되고, 특정 선택 지점 (DIC 이미지의 화살표)에 신경 자극한다. ( C ) Sema-1a 기능 상실 돌연변이 체에서, ISNb 축삭은 종종 근육 6과 13 사이에서 서로 탈 섬유화되지 않는다 (DIC 영상에서 화살촉). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
모터 축색 돌연변이 결함의 세부 사항은 DAB로 얼룩진 배아의 filleted 준비가 형광으로 표시된 것들의 공 촛점 현미경 검사보다 더 빠르고 정확도가 높습니다. 따라서, 고정 및 1D4 얼룩 배아의 필렛 된 준비는 안내 큐 분자의 기능적 특성 결정에 가장 적합합니다. 넷린, 슬릿, 세마포린 (semas) 및 에프 린을 비롯한 네 가지 주요 안내 단서와 그 동족 수용체는 웜, 파리 및 척추 동물을 통해 진화 적으로 보존 된 역할을합니다 20 . Drosophila Robo는 Slit에 대한 수용체 역할을하는 원형 (Robo) 계열 분자 중에서 CNS 6 에서 반발 유도 기능을 매개하는 것으로 처음 확인되었습니다. Semas는 plexin-containing 수용체 복합체 22 에 결합하는 안내 분자의 큰 계열입니다. Semas의 축삭 유도 기능메뚜기 CNS 14 에서 처음 발견되었습니다. 이어서, 클래스 1 막 횡단 Semaphorin Sema-1a는 Drosophila에서 광범위하게 특성화 되었다. Sema-1a는 plexin A의 리간드로서뿐만 아니라 알려지지 않은 리간드의 수용체 로서도 기능하며 , 배아 신경 발달 동안 특정 선택 지점에서 축삭 - 축색 반발에 중요한 역할을한다 15 , 16 , 17 , 18 ( 도 2c ).
현재 프로토콜에서 발생할 수있는 몇 가지 일반적인 문제 해결 단계가 있습니다. 첫째, 단계 3.9-3.13에서 태아는 너무 많거나 너무 작은 배아가 메탄올 탈락 과정에서 사용된다면 낮은 효율성으로 박탈 될 수있다. 이 경우 단계 3.5에서 탈락 소화를위한 고정 배아의 체적 40 ~ 80 μL를 사용하는 것이 좋습니다. 둘째, steps 3.9-3.13, 메탄올 또는 불완전 헵탄 제거에 오래 노출 될 경우 약한 X-Gal 염색이 발생할 수 있는데, 이는 고정액으로 사용되는 메탄올이 β-Gal 활성을 파괴하기 때문입니다. 이 경우 단계 3.9-3.13에서 메탄올을 사용하는 이탈 제거 절차가 가능한 한 빨리 수행되는 것이 가장 좋습니다. 또한 메탄올에 가용화 된 잔류 헵탄은 염색을 방해 할 수 있습니다. 그러므로 단계 3.11-3.13에서 최대한 많은 메탄올을 제거하는 것이 가장 좋습니다.
현재 filleted preparation protocol은 기능 상실 및 기능 상실 유전 스크린에 적용되어 모터 축색 돌연변이 및 표적인지에 관여하는 새로운 유전자를 확인합니다. 그러나,이 프로토콜의 단점은 filleted 준비를 생성 고정 배아를 해부하는 것은 꽤 시간이 걸리는 것입니다. 이 문제를 극복하기 위해 축색 돌기의 표현형 특성을 1D4로 염색 된 emb이 방법은 주변부에서 축삭 돌기의 저해상도 시각화를 제공하지만, 그럼에도 불구하고, 전체 마운트 준비 프로토콜은 축삭 유도 유전자 4 를 스크리닝하는 효율적인 방법임이 입증되었습니다. 형광 라벨 배아의 라이브 해부를 사용하여 대체 프로토콜은 최근 체계적인 심사를 위해 개발되었습니다 11 . 라이브 해부 프로토콜은 phenotypic 분석 11 비교적 빠른 준비를 허용합니다. 그러나,이 프로토콜은 단계 17 11 의 시작보다 오래된 배아에 적합하지 않습니다.
여기에 설명 된 filleted preparation protocol은 다른 항체로 단백질 발현 양상을 조사하는데 사용될 수있다. 또한,이 프로토콜은 개발 의 다양한 단계에서 초파리 배아에 적용 할 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 그가 경쟁하는 재정적 이해 관계가 없다고 선언한다.
Acknowledgments
Alex L. Kolodkin에게 감사의 말을 전합니다. 그의 실험실에서이 필렛 준비 프로토콜을 배웠습니다. 홍영기 씨에게도 기술 지원에 감사드립니다. 이 연구는 NRF-2013R1A1A4A01011329 (SJ)에 의해 지원되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | t-Octylphenoxypolyethoxyethanol |
| 16% Paraformaldehyde Solution | Ted Pella | 18505 | |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S5886 | |
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P5405 | |
| Sodium Phosphate Dibasic | Sigma-Aldrich | 30435 | |
| Sodium Phosphate Monobasic | Sigma-Aldrich | 71500 | |
| X-Gal Substrate | US Biological | X1000 | X-Gal (5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-b-D-galactoside galactopyranoside) |
| Dimethyl Sulfxide | Sigma-Aldrich | D4540 | |
| Magnesium Chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Potassium hexacyanoferrate(II) trihydrate | Sigma-Aldrich | P9387 | |
| Potassium hexacyanoferrate(III) | Sigma-Aldrich | 244023 | |
| Hydrogen Peroxide | Sigma-Aldrich | 216763 | |
| 3,3'-diaminobenzidine Tetrahydrochloride | Sigma-Aldrich | D5905 | |
| Agar | US Biological | A0930 | |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-3 | |
| Tegosept (Methy 4-Hydroxybenzoate) | Sigma-Aldrich | H5501 | |
| Culture Dish (60 mm) | Corning | 430166 | |
| Tricon Beaker | Simport | B700-100 | This is used to make a plastic beaker cage for embryo collection. |
| Yeast | Societe Industrielle Lesaffre | Saf Instant Yeast Red | |
| Cotton Swab (Wooden Single Tip Cotton PK100) | VWR | 14220-263 | |
| Eppendorf Tube (1.5 ml) | Sarstedt | #72.690 | |
| Bleach | The Clorox Company | Clorox | |
| Heptane | Sigma-Aldrich | 246654 | |
| Methanol | J.T. Baker | UN1230 | |
| Normal Goat Serum | Life Technologies | 16210-064 | |
| Anti-FasciculinII Antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | 1D4 anti-Fasciclin II | |
| Goat Anti-mouse-HRP Antibody | Jackson Immunoresearch | 115-006-068 | AffiniPure F(ab')2 Fragment Goat Anti-Mouse IgG+IgM (H+L) (min X Hu, Bov, Hrs Sr Prot |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G9012 | |
| Slide Glass | Duran Group | 235501403 | |
| Coverslip | Duran Group | 235503104 | 18 x 18 mm |
| 1 ml Syringe | Becton Dickinson Medical(s) | 301321 | |
| Tungsten Needle | Ted Pella | #27-11 | Tungsten Wire, ø0.13mm/6.1m (ø.005"/20 ft.) |
| Nutator (Mini twister) | Korean Science | KO.VS-96TWS | Alternatively, BD Clay Adams Brand Nutator (BD 421125) |
References
- Bate, M. The embryonic development of larval muscles in Drosophila. Development. 110 (3), 791-804 (1990).
- Landgraf, M., Thor, S. Development of Drosophila motoneurons: specification and morphology. Semin. Cell Dev. Biol. 17 (1), 3-11 (2006).
- Grenningloh, G., Rehm, E. J., Goodman, C. S. Genetic analysis of growth cone guidance in Drosophila: fasciclin II functions as a neuronal recognition molecule. Cell. 67 (1), 45-57 (1991).
- Vactor, D. V., Sink, H., Fambrough, D., Tsoo, R., Goodman, C. S. Genes that control neuromuscular specificity in Drosophila. Cell. 73 (6), 1137-1153 (1993).
- Zinn Lab. , California Institute of Technology. Available from: https://www.its.caltech.edu/~zinnlab/motoraxons.html (2017).
- Seeger, M., Tear, G., Ferres-Marco, D., Goodman, C. S. Mutations affecting growth cone guidance in Drosophila: genes necessary for guidance toward or away from the midline. Neuron. 10 (3), 409-426 (1993).
- Thor, S., Thomas, J. B. The Drosophila islet gene governs axon pathfinding and neurotransmitter identity. Neuron. 18 (3), 397-409 (1997).
- Roh, S., Yang, D. S., Jeong, S. Differential ligand regulation of PlexB signaling in motor neuron axon guidance in Drosophila. Int. J. Dev. Neurosci. 55, 34-40 (2016).
- Campos-Ortega, J. A., Hartenstein, V. The embryonic development of Drosophila melanogaster. , Springer-Verlag. New York. (1985).
- Patel, N. H. Imaging neuronal subsets and other cell types in whole mount Drosophila embryos and larvae using antibody probes. Methods in cell biology, vol 44. Drosophila melanogaster: practical uses in cell biology. Goldstein, L. S. B., Fyrberg, E. 44, Academic Press. New York. 445-487 (1994).
- Lee, H. K., Wright, A. P., Zinn, K. Live dissection of Drosophila embryos: streamlined methods for screening mutant collections by antibody staining. J. Vis. Exp. (34), (2009).
- Hartenstein, V. Stages of Embryonic Development. Atlas of Drosophila. development. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. Available from: http://www.sdbonline.org/sites/fly/atlas/52.htm 52 (1993).
- Brady, J. A simple technique for making very fine, durable dissecting needles by sharpening tungsten wire electrolytically. Bull. World Health Organ. 32 (1), 143-144 (1965).
- Kolodkin, A. L. Fasciclin IV: sequence, expression, and function during growth cone guidance in the grasshopper embryo. Neuron. 9 (5), 831-845 (1992).
- Jeong, S., Juhaszova, K., Kolodkin, A. L. The Control of semaphorin-1a-mediated reverse signaling by opposing pebble and RhoGAPp190 functions in Drosophila. Neuron. 76 (4), 721-734 (2012).
- Winberg, M. L. Plexin A is a neuronal semaphorin receptor that controls axon guidance. Cell. 95 (7), 903-916 (1998).
- Yang, D. S., Roh, S., Jeong, S. The axon guidance function of Rap1 small GTPase is independent of PlexA RasGAP activity in Drosophila. Dev. Biol. 418 (2), 258-267 (2016).
- Yu, H. H., Araj, H. H., Ralls, S. A., Kolodkin, A. L. The transmembrane Semaphorin Sema I is required in Drosophila for embryonic motor and CNS axon guidance. Neuron. 20 (2), 207-220 (1998).
- Hartenstein, V. Stages of Embryonic Development. Atlas of Drosophila. development. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. Available from: http://www.sdbonline.org/sites/fly/atlas/52.htm 52 (1993).
- Dickson, B. J.
- Kidd, T. Roundabout controls axon crossing of the CNS midline and defines a novel subfamily of evolutionarily conserved guidance receptors. Cell. 92 (2), 205-215 (1998).
- Pasterkamp, R. J. Getting neural circuits into shape with semaphorins. Nat. Rev. Neurosci. 13 (9), 605-618 (2012).
