Summary
Diese Arbeit beschreibt eine Standard-Immunhistochemie-Methode zur Visualisierung von Motor-Neuronen-Projektionen von späten Stadium-16 Drosophila Melanogaster Embryonen . Die gefilterte Präparation von festen Embryonen, die mit FasII-Antikörper gefärbt wurden, bietet ein leistungsfähiges Werkzeug, um die Gene zu charakterisieren, die für die motorische Axon-Pathfindung und die Zielerkennung während der neuronalen Entwicklung erforderlich sind.
Abstract
Die Etablierung funktioneller neuromuskulärer Schaltkreise beruht auf präzisen Verbindungen zwischen der Entwicklung von Motoraxonen und Zielmuskeln. Motorneuronen erweitern die Wachstumskegel, um auf bestimmten Wegen zu navigieren, indem sie auf eine große Anzahl von Axon-Guidance-Cues reagieren, die von der umgebenden extrazellulären Umgebung ausgehen. Die Wachstumskegel-Ziel-Erkennung spielt auch eine entscheidende Rolle bei der neuromuskulären Spezifität. Diese Arbeit stellt ein Standard-Immunhistochemie-Protokoll dar, um motorische Neuronprojektionen von späten Stadium-16 Drosophila melanogaster Embryonen zu visualisieren . Dieses Protokoll enthält einige wichtige Schritte, einschließlich eines Genotypisierungsverfahrens, um die gewünschten mutanten Embryonen zu sortieren; Ein Immunfärbeverfahren, um Embryonen mit Fasciclin II (FasII) Antikörper zu markieren; Und ein Dissektionsverfahren, um gefilterte Präparate aus festen Embryonen zu erzeugen. Motor-Axon-Projektionen und Muskelmuster in der Peripherie sind viel besser in flachen Präparationen von filtrierten Embryonen sichtbar als in whOle-Mount Embryonen Daher bietet die gefilterte Präparation von festen Embryonen, die mit FasII-Antikörper gefärbt sind, ein mächtiges Werkzeug, um die Gene zu charakterisieren, die für die motorische Axon-Pfadfindung und die Zielerkennung erforderlich sind, und sie können auch sowohl auf die Funktionsstörungen als auch auf die Funktionsgenauigkeits-Gattungsbildschirme angewendet werden .
Introduction
Präzise und selektive Verbindungen zwischen motorischen Axonen und Zielmuskeln während der embryonalen Entwicklung sind für die normale Fortbewegung in Drosophila- Larven essentiell . Die embryonale Strukturierung von 30 Muskelfasern in jedem der Bauchhöhenselemente A2-A7 wird nach Stufe 16 1 hergestellt. Die 36 motorischen Neuronen, die im ventralen Nervenkabel erzeugt werden, verlängern ihre Axone in die Peripherie, um spezifische Zielmuskeln zu innervieren 2 . Die motorische Axonpfadfindung und die Zielerkennung können durch Immunhistochemie mit einem Antikörper (Mausmonoklonaler Antikörper 1D4) 3 , 4 sichtbar gemacht werden. Mehrere Bilder der motorischen Axonprojektionsmuster in Wildtyp Embryonen sind auf der Bahn 5 verfügbar. Der 1D4-Antikörper markiert alle motorischen Axone und drei Längsaxon-Faszikel auf jeder Seite der Mittellinie des embryonalen Zentralnervensystems (ZNS) 4 , 6 ( Abbildung 1C und Abbildung 2A ). Daher bietet die Immunhistochemie mit FasII-Antikörper ein leistungsfähiges Werkzeug zur Identifizierung von Genen, die für die neuromuskuläre Konnektivität erforderlich sind, um die molekularen Mechanismen zu demonstrieren, die der motorischen Axon-Anleitung und der Zielerkennung zugrunde liegen.
In jedem der Bauchhöhenselemente A2-A7 projizieren motorische Axone und selektiv in zwei Hauptnervenzweige, den Segmentnerv (SN) und den intersegmentalen Nerv (ISN) 2 , 4 und einen kleinen Nervenzweig, den Quernerv (TN ) 7 . Die SN selektiv defasciculiert, um zwei Nervenzweige zu nennen, die SNa und SNc genannt werden, während die ISN in drei Nervenzweige, die so genannten ISN, ISNb und ISNd 2 , 4 , aufgeteilt werden. Unter ihnen, ISN, ISNb und SNa MotoraxonDie Projektionsmuster werden am genauesten sichtbar gemacht, wenn Spitzstadium-16-Embryos mit FasII-Antikörper gefärbt werden und filtriert werden (Abbildung 1C und Abbildung 2A ). Die ISN-Motorneuronen verlängern ihre Axone, um die Dorsalmuskeln 1, 2, 3, 4, 9, 10, 11, 18, 19 und 20 2 , 4 zu innervieren ( Fig. 2A ). Die ISNb-Motorneuronen innervieren die ventrolateralen Muskeln 6, 7, 12, 13, 14, 28 und 30 2 , 4 ( 2A und 2B). Der SNa-Nerven-Zweig projiziert, um die Seitenmuskeln 5, 8, 21, 22, 23 und 24 2 , 4 zu innervieren ( Fig. 2A ). Die TN, die aus zwei motorischen Axonen besteht, projiziert ipsilateral entlang der segmentalen Grenze, um den Muskel 25 zu innervieren und macht Synapsen mit dem lateralen bipolaren dendritischen Neuron (LBD) in derPeripherie 7 (Abbildung 2A ). Diese Zielmuskelinnervationen erfordern nicht nur die selektive Defaskik von motorischen Axonen an bestimmten Wahlpunkten, sondern auch die Zielmuskelerkennung. Darüber hinaus wurden einige mutmaßliche mesodermale Guidepost-Zellen, die als Zwischenziele fungieren, sowohl in den ISN- als auch in den SNa-Wegen gefunden, aber nicht entlang des ISNb-Weges 4 . Dies könnte darauf hindeuten, dass die ISNb-Motor-Axon-Pfadfindung im Vergleich zu der ISN- und SNa-Motor-Axon-Führung in einer bestimmten Weise reguliert werden kann, und es zeigt auch an, dass die periphere Motor-Axon-Führung ein attraktives experimentelles Modell bietet, um die Differential- oder konservierten Rollen eines einzelnen Leitfadens zu untersuchen Molekül 8
Diese Arbeit stellt eine Standardmethode dar, um die axonalen Projektionsmuster der embryonalen motorischen Neuronen in Drosophila zu visualisieren . Die beschriebenen Protokolle beinhalten, wie man feste Embryonen, die mit 1D4 a gefärbt sind, seziertNtibody und verarbeitet in 3,3'-Diaminobenzidin (DAB) für filtrierte Zubereitungen. Ein kritischer Vorteil der flachen Präparate von festen Embryonen ist die bessere Visualisierung der axonalen Projektionen und Muskelmuster in der Peripherie. Darüber hinaus zeigt diese Arbeit auch, wie man feste Embryonen genotypisiert, um die gewünschten mutanten Embryos nach der LacZ-Färbemethode zu sortieren.
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Protocol
1. Vorbereitung
- Vorbereitung von 500 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) mit t-Octylphenoxypolyethoxyethanol (PBT) -Lösung durch Zugabe von 0,5 g Rinderserumalbumin (BSA) und 0,5 ml t-Octylphenoxypolyethoxyethanol (siehe Tabelle der Materialien) auf 500 ml 1X PBS Und Rühren für mindestens 30 min. Bei 4 ° C aufbewahren. Verwenden Sie, wenn relativ frisch und speichern Sie die Lösung in einer sauberen Flasche.
- Mischen Sie 10 ml 4% Paraformaldehyd durch Zugabe von 2,5 ml einer 16% igen Stamm-Paraformaldehydlösung und 1 ml 10x PBS zu 6,5 ml entionisiertem Wasser. Bei 4 ° C aufbewahren und innerhalb einer Woche verwenden.
ACHTUNG: Hautkontakt mit Paraformaldehyd-Lösung vermeiden, da es sehr giftig ist. - Mischen Sie X-Gal-Substrat (10% w / v X-Gal in Dimethylsulfoxid (DMSO)) durch Lösen von 0,1 g X-Gal-Substrat pro 1 ml DMSO. Bei -20 ° C in 100 μl Aliquoten lagern.
- Mischen Sie X-Gal-Färbe-Lösung unter Verwendung von 10 mM Phosphatpuffer (pH 7,2), 150 mM NaCl, 1 mM MgCl 2 , 3 mMK 4 [FeII (CN) 6 ], 3 mM K 3 [FeIII (CN) 6 ] und 0,3% t-Octylphenoxypolyethoxyethanol. Bei 4 ° C im Dunkeln aufbewahren.
- Mischen Sie 3% Wasserstoffperoxidlösung durch Verdünnen von 30% Stamm Wasserstoffperoxid 1:10 mit deionisiertem Wasser.
- Mischen Sie 3,3'-Diaminobenzidin (DAB) -Lösung durch vollständiges Auflösen von 1 Tablette (10 mg) DAB in 35 ml frischer PBT-Lösung. Durch einen 0,2 μm-Spritzenfilter filtrieren und bei -20 ° C in 910 μl Aliquots lagern.
ACHTUNG: Alle DAB-Abfälle in Bleichmittel entsorgen, um den DAB zu zerstören. - Eierteller mit Apfelsaft herstellen. Füge 35 g Agar und 1 l entionisiertes Wasser in einen 2 l-Kolben ein. Füge 33 g Saccharose, 2 g Tegosept und 375 ml Apfelsaft in einen 1- l-Kolben ein. Schmelzen Sie sie durch Autoklavieren für 30 min. Lassen Sie beide Lösungen auf ca. 60 ° C abkühlen. Kombinieren und mischen diese Lösungen gut durch Rühren. Gießen Sie 11 ml kombinierte Lösung pro 60 mm Kulturschale.
- Machen Sie Hefepaste, indem Sie Bäcker schlagenSt in deionisiertes Wasser (Verhältnis 1: 0,8) und bei 4 ° C aufbewahren.
2. Embryo-Sammlung (Tag 1)
- Sammeln Sie junge weibliche und männliche Fliegen (jünger als 5 Tage) und halten Sie sie für 1-2 Tage in einem Plastikbecherkäfig mit einer Eiplatte (60 mm x 15 mm), die eine kleine Menge Hefepaste in der Mitte enthält.
- Für die optimale Sammlung von Spätstadium-16 Embryonen, richten Sie einen Flaschenkäfig mit Fliegen (> 50) gegen 17 Uhr auf und lassen Sie sie Eier bei 25 ° C für 3 h legen.
- Übertragen Sie die Fliegen auf eine frische Flasche.
- Schließen Sie die Eiplatte mit dem Deckel und inkubieren Sie sie bei 25 ° C in einem befeuchteten Inkubator (~ 70% Luftfeuchtigkeit) über Nacht.
3. Vorbereitung von Embryonen zur Immunfärbung (Tag 2)
- Füge 1,8 ml PBT-Lösung zur Eiplatte um 10:20 Uhr hinzu und verwende einen Wattestäbchen, um die Embryonen von der Platte zu lösen, während du sie kippst.
Hinweis: Durch sanftes Maischen der Hefepaste mit einem CottAuf Tupfer, löst es auf, falls eine große Anzahl von Embryonen darauf gefunden wird. Beginne das Sammeln der Embryos ~ 40 Minuten vor der Fixierung (gegen 11:00 Uhr). - Übertragen Sie die Embryos aus der Eiplatte auf ein 1,5-ml-Mikroröhrchen mit einer 1-ml-Pipettenspitze.
- Lassen Sie sich die Embryos so weit wie möglich absetzen und die PBT-Lösung aspirieren. Spülen Sie die Embryos zweimal mit 1 ml PBT-Lösung. Setzen Sie die PBT-Lösung so weit wie möglich ein.
- Füllen Sie das Röhrchen mit 1 ml 50% igem Bleichmittel ( dh verdünnt in entionisiertem Wasser) und dechorionieren Sie die Embryos, indem Sie sie 3 min bei Raumtemperatur (RT) auf einen Nusskern inkubieren.
Anmerkung: Dieser Schritt tötet nicht die dechorionierten Embryonen. - Lassen Sie die dechorionierten Embryos sich absetzen, aspirieren Sie die 50% ige Bleiche so weit wie möglich und spülen Sie die Embryos 3 mal mit 1 ml PBT-Lösung.
- Fügen Sie 0,5 ml Heptan hinzu und fügen Sie anschließend ca. 11 ms 0,5 ml einer 4% igen Paraformaldehydlösung zu dem Röhrchen bei RT hinzu.
- Inkubieren derEmbryos auf einem Nutator für 15 min bei RT.
- Entfernen Sie die 4% Paraformaldehydlösung (die untere Schicht).
- Fügen Sie 0,5 ml 100% Methanol hinzu und entzünden Sie die Embryos, indem Sie das Röhrchen 30 Minuten lang kräftig schütteln.
- Entfernen Sie die Heptane ( dh die obere Schicht).
- Fügen Sie 0,5 ml 100% Methanol hinzu und schütteln Sie das Röhrchen für 10 s kräftig.
- Lassen Sie die Embryos sich niederlassen, indem Sie das Röhrchen klopfen und das Methanol so weit wie möglich absaugen. Spülen Sie die Embryonen mit 1 ml 100% Methanol, Schütteln für weniger als 10 s.
Anmerkung: Ausgedehnte Exposition gegenüber Methanol zerstört die β-Gal-Aktivität. - Das Methanol entfernen und die devitellinisierten Embryos 3 mal mit 1 ml PBT-Lösung abspülen.
4. Genotypisierung der Embryonen mit LacZ-Färbung (Tag 2)
- Füge 1 ml PBT-Lösung dem Röhrchen zu und inkubiere das Röhrchen in einem 37 ° C Hitzestrom oder Wasserbad für 15 min.
- Während der Inkubation wird die X-Gal-Färbelösung (1 ml pro TuWerden bei 65 ° C in einem Wasserbad, bis es bewölkt wird. Inkubieren Sie es in einem 37 ° C Wasserbad.
- Die PBT-Lösung einatmen und 1 ml X-Gal-Färbelösung und 20 & mgr; l X-Gal-Substrat zu dem Röhrchen geben.
- Inkubieren Sie das Röhrchen bei 37 ° C mit Nutation, bis ein blauer Niederschlag offensichtlich ist.
Hinweis: Die Inkubationszeit für die 2. und 3. Blue Balancer im Allgemeinen reicht von 2-4 h. - Die X-Gal-Färbe-Lösung entfernen und die Embryos dreimal mit 1 ml RT-PBT-Lösung spülen.
- Mit einer Nadelsonde oder Pinzette, sortieren Sie die Embryonen des gewünschten Genotyps ( dh nicht gebeizte weiße Embryos) mit einem leichten Seziermikroskop (1.6X-2.5X-Ziele).
Anmerkung: Da einige blaue Balancer wie CyO, Actin-LacZ und TM3, Actin-LacZ , ein transgenes Konstrukt tragen, das unter der Kontrolle des Aktin-Promotors bakterielles β-Gal (LacZ) exprimiert, enthalten Embryos, die in einer ubiquitären Weise blau gefärbt sindEin oder zwei Kopien von Blue Balancer Chromosomen. Daher sind nicht gefärbte weiße Embryos für das gewünschte tödliche Allel homozygot.
5. Immunfärbung von Embryonen mit Anti-Fasciclin II-Antikörpern (Tag 2-3)
- Sammeln und übertragen die Embryos des gewünschten Genotyps ( dh nicht gefärbten weißen Embryos) zu einem 0,5 ml-Mikroröhrchen unter Verwendung einer 1 ml-Pipettenspitze.
Anmerkung: In diesem Schritt können die Embryos nach morphologischen Kriterien grob inszeniert werden, einschließlich der Segmentierungsmuster der Nagelhaut und der Strukturen von Kopf und Schwanz 9 . Während der Kopfinvasion, zwischen 10 und 16 h nach dem Verlegen der Eier, erfährt der Embryo eine ausgeprägte Reduktion des vordersten Segments 9 . - Die Embryos einmal mit 0,4 ml PBT-Lösung waschen und 0,3 ml Blockierungslösung (5% normales Ziegenserum und 5% DMSO in PBT-Lösung) zugeben.
- Blockiere die Embryos mit Nutation bei RT für 15 min.
- Die Embryonen 4 mal mit 0,4 ml PBT-Lösung für mindestens 20 min pro Waschung waschen.
- Füge 0,3 mL Blockierungslösung (5% normales Ziegenserum in PBT-Lösung) mit Ziegen-anti-Maus-HRP-Antikörper (2 μg / ml) hinzu und inkubiere das Röhrchen mit Nussation bei RT über Nacht.
- Die Embryos 6 mal mit 0,4 ml PBT-Lösung für mindestens 20 min pro Waschung waschen.
- Füge 0,3 ml DAB-Lösung dem Röhrchen hinzu.
ACHTUNG: Handschuhe tragen und alle DAB-Abfälle / Röhrchen / Spitzen in Bleichmittel stellen. - Man gibt 2 μl 3% iges Wasserstoffperoxid zu und inkubiert das Röhrchen im Dunkeln mit Nutation bei RT, bis die gewünschte Menge an Niederschlag entsteht.
Anmerkung: Die Inkubationszeit für 1D4 Immunhistochemie im Allgemeinen reicht von 0,5-1 h. - Die Embryos 4 mal mit 0,4 ml PBT-Lösung waschen.
ACHTUNG: Entfernen Sie die DAB-Lösung und die ersten beiden Wäschen mit einer Pipette und diSchmeißt sie in Bleiche. - Füge 0,2 ml der 70% igen Glycerin / PBS-Lösung in das Röhrchen ein und lag bei RT oder 4 ° C auf.
Hinweis: Halten Sie den Schlauch von Licht fern. Klarere Präparate können erhalten werden, indem die Embryonen in eine 90% ige Glycerin / PBS-Lösung 10 gegeben werden . Jedoch ist es schwieriger, Embryonen, die in 90% Glycerin / PBS-Lösung freigesetzt wurden, zu sezieren, als die, die in 70% Glycerin / PBS-Lösung 10 freigesetzt wurden.
6. Inszenierung, Dissektion, Montage und Bildgebung der Embryonen (Tag 4)
- Zur Inszenierung die mit 70% Glycerin / PBS äquilibrierten Embryonen auf einen Glasrutsche übertragen.
- Sammeln Sie späte Stadium-16 Embryonen, die Bauchsegment 7 (A7), A8 und A9 ISN Nerven konvergieren, um einander zu berühren oder / und haben midgut, die in drei Banden unterteilt ist.
Hinweis: Embryos, die mit 1D4-Antikörper gefärbt sind, können auf der Grundlage der Projektionsmuster von ISN- und ISNb-Motoraxonen inszeniert werden. Nach dem Verlassen des ZNS, A7, A8 und A9 ISN neRs der späten Stadium-16 Embryonen konvergieren, um einander zu berühren und anschließend divergieren, um weit hinaus zu den dorsalen Muskeln (Pfeilspitze in Abbildung 1A ) zu verlängern. In der Mitte der Stufe-16 Embryonen, aber A7 ISN Nerven erstrecken sich parallel zu A8 / A9 Nerven (eckige Klammer in Abbildung 1B ). Darüber hinaus sind die Projektionsachsen der A6 ISNb-Nerven (senkrecht zu den ventrolateralen Muskeln) in beiden Hämisenteilen grob mit dem hinteren Ende der ZNS-Längsaxon-Faszikel (Pfeile und einer Linie in Abbildung 1C ) ausgerichtet. Diese morphologischen Kriterien variieren etwas zwischen verschiedenen Genotypen. Alternativ können Embryonen auf der Grundlage der Darmmorphologie 9 , 11 inszeniert werden . Vor der Stufe 17 hat der Midgut eine herzförmige Form, während der Midgut nach Stufe 17 12 in drei Banden unterteilt ist. - Zerschneiden die Embryonen.
- Mit einer 1 mL-Spritze, bewegen Sie jeden Embryo aus dem Glycerin-Tropfen und legen Sie den Embryo ventral-Gesicht nach oben. Schneide den vorderen Teil bei 1/4 der Körperlänge und dem hintersten Bereich ab, der frei von Motoraxonen ist.
- Mit einem Nadel-Sonde, verschieben Sie den End-Cut-Embryo aus dem Glycerin-Drop, rollen, um es dorsal-side nach oben zu orientieren, und legen Sie es horizontal auf dem Feld.
Anmerkung: Wenn der Embryo aus dem Glycerintropfen herausgezogen wird, macht ein bisschen Glycerin, das mit dem Embryo assoziiert ist, es klebrig. - Schneiden Sie den Embryo entlang der dorsalen Mittellinie mit einer einzigen sehr feinen Wolframnadel 13 . Machen Sie einen kleinen Schnitt am hinteren Ende des Embryos und dann weiter, um die dorsale Mittellinie in Richtung der vorderen zu reduzieren; Schneiden in die entgegengesetzte richtung ist auch gut
- Mit einem Nadelsonden den Mittellinie-Embryo in den Glycerin-Tropfen verwandeln, ihn dorsal nach oben stellen und den Darm von der Körperwand lösen, indem er jede Körperwand in einer ventrolateralen (diagonalen) Richtung entfaltet (2.5X Ziel).
Hinweis: Stellen Sie sicher, dass die dorsale Mittellinie vollständig geschnitten ist, was zu einer vollständigen Trennung zwischen den linken und rechten Körperwänden führt. - Ziehen Sie den Mittellinien-Embryo vorsichtig aus dem Glycerin-Tropfen und legen Sie dann mit einer feinen Nadelsonde (2.5X-Objektiv) zwei Klappen der Körperwand auf den Glasschieber.
- Mit einer sehr feinen Wolframnadel, entfernen Sie die inneren Organe aus dem sezierten Embryo, indem Sie sie seitlich (5X Objektiv) drücken.
Anmerkung: Eine ausführlichere Beschreibung eines anderen ähnlichen Dissektionsprozesses finden Sie auf der Website 5 .
- Zur Montage fügen Sie 2-3 μl 70% ige Glycerin / PBS-Lösung zum Reinigen, Sezieren von Embryonen und überführen sie mit einer feinen Nadelsonde auf einen neuen Glasschieber, auf den 8 μl 70% Glycerin / PBS-Lösung verteilt wurden Das Zentrum (2.5X Ziel).
- Setzen Sie auf ein Deckglas (18 mm x 18 mm). Die Kanten des Deckglases mit regelmässigem Nagellack abdichten (entwederKlar oder farbig ist gut).
- Erfassen Sie Bilder mit hoher Auflösung (20X, 40X und 63X Öl-Immersions-Objektiven) unter einem DIC-Lichtmikroskop (Differential Interference contrast) gemäß den Anweisungen des Herstellers.
Hinweis: Eine bessere Visualisierung und phänotypische Charakterisierung, insbesondere für ISNb-Motoraxone, können mit einem 63X-Öl-Immersions-Objektiv hergestellt werden.
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Representative Results
Präzise Verbindungen zwischen motorischen Axonen und Zielmuskeln während der neuronalen Entwicklung hängen von der selektiven Axonaxonabstoßung und der Zielerkennung an bestimmten Wahlpunkten ab 4 . In Drosophila wird die selektive Abstoßung zwischen motorischen Axonen teilweise durch die kombinierte Wirkung von Klasse 1 und 2 Semaphorinen (Semas), einschließlich Sema-1a, Sema-2a und Sema-2b 8 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 reguliert . Daher führt der Verlust der Sema-1a- Funktion häufig zum Ausfall von ISNb-Axonen, um an bestimmten Wahlpunkten defascikulieren zu können, wodurch sie eine ungewöhnlich dicke Morphologie (Pfeilspitze in 2C ) zeigen. Bei Wildtyp-Embryonen verlängern und faszinieren mindestens 7 motorische Neuronen ihre Axone, um ein I zu bildenSNb-Nerven-Ast (Abbildung 2A ). Wenn der ISNb-Nervenzweig einen Wahlpunkt erreicht, der sich zwischen den Muskeln 6 und 7 befindet, werden zwei Axone selektiv vom Haupt-ISNb-Bündel defascikulieren und anschließend die Muskeln 6 und 7 innervieren (Abbildung 2B ). Am nächsten Wahlpunkt, der sich zwischen den Muskeln 6, 13 und 30 befindet, werden weitere drei Motoraxone selektiv entvasfizieren, um die Muskeln 13, 14 und 30 zu innervieren ( Fig. 2B ). Die verbleibenden zwei Axone erstrecken sich dorsal, um den letzten Wahlpunkt nahe dem Rand des Muskels 12 zu erreichen, wodurch der Muskel 12 in der entgegengesetzten Richtung innerviert wird ( Fig. 2B ). Diese Ergebnisse zeigen deutlich, dass das gefilterte Präparations-Protokoll ein nützliches Werkzeug zur Untersuchung der Gene bietet, die für die motorische Axon-Führung erforderlich sind.
Abbildung 2: Motoraxonprojektionsmuster in Wildtyp- und Sema-1a- Mutantenembryonen. ( A - C ) Filetierte Präparation von späten Stadium-16 Embryonen, gefärbt mit FasII-Antikörper. Anterior ist links und ventral ist unten. Schematische Diagramme, die die in jedem Panel dargestellten axonalen Projektionsmuster zeigen. Die Maßstäbe = 15 μm. ( A ) Eine helle Feldphotographie von zwei aufeinanderfolgenden Bauchhöhen, A3 und A4, in Wildtyp-Embryonen. Drei zweiseitig symmetrische Längsaxonbündel sind im ZNS vorhanden. Die normalen Innervationsmuster von ISNb-, SNa-, ISN- und TN-Motoraxonen werden durch die Boxen und einen Pfeil in der Peripherie angezeigt. Das laterale bipolare Dendritneuron (LBD), das die Alary-Muskeln innerviert, ist indikativDurch eine Pfeilspitze. In der schematischen Darstellung werden die Nervenverzweigungen und Innervationsmuster des ISNb (in braun), SNa (in blau), ISN (in grün) und TN (in gelb) motorischen Neuronen und deren Zielmuskeln dargestellt. Die Zellenkörperpositionen dieser motorischen Neuronen im ZNS werden auch in ihren eigenen Farben gezeigt. ( B ) Bei Wildtyp-Embryonen projizieren die ISNb-Axone die ventrolateralen Muskeln, die nummeriert sind, und innervieren sie an bestimmten Auswahlpunkten (Pfeile im DIC-Bild). ( C ) In Sema-1a- Verlust-of-Function-Mutanten, ISNb-Axone häufig nicht defascikulieren von einander zwischen Muskeln 6 und 13 (Pfeilspitze im DIC-Bild). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Die Details der Motor-Axon-Führungsdefekte werden durch die gefilterte Vorbereitung von DAB-gefärbten Embryonen schneller und mit besserer Genauigkeit erzielt als durch eine konfokale Mikroskopie von fluoreszenzmarkierten Laserscanning. Daher eignet sich die filtrierte Präparation von fixierten und 1D4-gefärbten Embryonen am besten für die funktionelle Charakterisierung von Guidance Cue Molekülen. Vier Hauptklassen von Leitlinien, darunter Netrine, Schlitze, Semaphorine (Semas) und Ephrine, und ihre verwandten Rezeptoren haben evolutionär Rollen über Würmer, Fliegen und Wirbeltiere konserviert 20 . Unter den Kreisel- (Robo-) Familienmolekülen, die als Rezeptoren für Schlitze wirken, wurde Drosophila Robo zuerst identifiziert, um eine abstoßende Führungsfunktion im ZNS 6 , 21 zu vermitteln. Semas sind eine große Familie von Leitmolekülen, die an Plexin-haltige Rezeptorkomplexe 22 binden. Die Axonführungsfunktion von SemasWurde zuerst in der Heuschrecke ZNS 14 entdeckt. Anschließend wurde das Transmembran-Semaphorin Sema-1a der Klasse 1 in Drosophila weitgehend charakterisiert . Sema-1a, das nicht nur als Ligand für Plexin A, sondern auch als Rezeptor für einen unbekannten Liganden fungiert, spielt bei der axon-axon-Abstoßung bei bestimmten Wahlpunkten während der embryonalen neuronalen Entwicklung eine wichtige Rolle 15 , 16 , 17 , 18 ( Fig. 2C ).
Es gibt einige gängige Fehlerbehebungsschritte, die mit dem aktuellen Protokoll auftreten können. Zuerst können in den Schritten 3.9-3.13 die Embryonen mit geringem Wirkungsgrad devitellinisiert werden, wenn zu viele oder zu kleine Embryonen im Methanol-Devitellinierungsverfahren eingesetzt werden. In diesem Fall empfiehlt es sich, ein Bettvolumen von 40-80 μl fester Embryonen zur Devitellinisierung in Schritt 3.5 zu verwenden. Zweitens in stePs 3.9-3.13 kann eine schwache X-Gal-Färbung im Falle einer längeren Exposition gegenüber Methanol oder einer unvollständigen Heptanentfernung auftreten, da Methanol, das als Fixiermittel verwendet wird, die β-Gal-Aktivität zerstört. In diesem Fall ist es am besten, dass das Devitellinierungsverfahren mit Methanol in den Schritten 3.9-3.13 so schnell wie möglich durchgeführt wird. Darüber hinaus kann Restheptan, das in Methanol solubilisiert wird, die Färbung stören; Daher ist es am besten, so viel Methanol wie möglich in den Schritten 3.11-3.13 zu entfernen.
Das gegenwärtig gefilterte Vorbereitungsprotokoll kann auf Funktionsverlust-Funktions- und Gain-of-Function-Gen-Screenes angewendet werden, um neuartige Gene zu identifizieren, die an der motorischen Axon-Pfadfindung und der Zielerkennung beteiligt sind. Ein Nachteil dieses Protokolls ist jedoch, dass es ziemlich zeitaufwändig ist, feste Embryos zu sezieren, um gefilterte Präparate zu erzeugen. Um dieses Problem zu überwinden, kann die phänotypische Charakterisierung der axonalen Projektionen in einer ganzheitlichen Vorbereitung von 1D4-gefärbten embRyos, obwohl diese Methode eine aufeinanderfolgende Visualisierung der axonalen Projektionen in der Peripherie ermöglicht. Dennoch hat sich das gesamte Vorbereitungsprotokoll als ein effizienter Ansatz für das Screening von Axonführungsgenen erwiesen 4 . Ein alternatives Protokoll unter Verwendung der lebenden Dissektion von fluoreszenzmarkierten Embryonen wurde vor kurzem für systematische Screening 11 entwickelt. Das lebende Dissektionsprotokoll ermöglicht eine relativ schnelle Vorbereitung der phänotypischen Analyse 11 . Allerdings ist dieses Protokoll für Embryonen, die älter als der Anfang der Stufe 17 sind, nicht ausreichend.
Das hier beschriebene Filament-Präparations-Protokoll kann verwendet werden, um Protein-Expressionsmuster mit verschiedenen Antikörpern zu untersuchen. Darüber hinaus kann dieses Protokoll auch auf Drosophila Embryonen in verschiedenen Stadien der Entwicklung angewendet werden.
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Disclosures
Der Autor erklärt, dass er keine konkurrierenden finanziellen Interessen hat.
Acknowledgments
Ich danke Alex L. Kolodkin, als ich dieses gefilmte Vorbereitungsprotokoll in seinem Labor gelernt habe. Ich danke auch Young Gi Hong für technische Unterstützung. Diese Studie wurde von NRF-2013R1A1A4A01011329 (SJ) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | t-Octylphenoxypolyethoxyethanol |
| 16% Paraformaldehyde Solution | Ted Pella | 18505 | |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S5886 | |
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P5405 | |
| Sodium Phosphate Dibasic | Sigma-Aldrich | 30435 | |
| Sodium Phosphate Monobasic | Sigma-Aldrich | 71500 | |
| X-Gal Substrate | US Biological | X1000 | X-Gal (5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-b-D-galactoside galactopyranoside) |
| Dimethyl Sulfxide | Sigma-Aldrich | D4540 | |
| Magnesium Chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Potassium hexacyanoferrate(II) trihydrate | Sigma-Aldrich | P9387 | |
| Potassium hexacyanoferrate(III) | Sigma-Aldrich | 244023 | |
| Hydrogen Peroxide | Sigma-Aldrich | 216763 | |
| 3,3'-diaminobenzidine Tetrahydrochloride | Sigma-Aldrich | D5905 | |
| Agar | US Biological | A0930 | |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-3 | |
| Tegosept (Methy 4-Hydroxybenzoate) | Sigma-Aldrich | H5501 | |
| Culture Dish (60 mm) | Corning | 430166 | |
| Tricon Beaker | Simport | B700-100 | This is used to make a plastic beaker cage for embryo collection. |
| Yeast | Societe Industrielle Lesaffre | Saf Instant Yeast Red | |
| Cotton Swab (Wooden Single Tip Cotton PK100) | VWR | 14220-263 | |
| Eppendorf Tube (1.5 ml) | Sarstedt | #72.690 | |
| Bleach | The Clorox Company | Clorox | |
| Heptane | Sigma-Aldrich | 246654 | |
| Methanol | J.T. Baker | UN1230 | |
| Normal Goat Serum | Life Technologies | 16210-064 | |
| Anti-FasciculinII Antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | 1D4 anti-Fasciclin II | |
| Goat Anti-mouse-HRP Antibody | Jackson Immunoresearch | 115-006-068 | AffiniPure F(ab')2 Fragment Goat Anti-Mouse IgG+IgM (H+L) (min X Hu, Bov, Hrs Sr Prot |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G9012 | |
| Slide Glass | Duran Group | 235501403 | |
| Coverslip | Duran Group | 235503104 | 18 x 18 mm |
| 1 ml Syringe | Becton Dickinson Medical(s) | 301321 | |
| Tungsten Needle | Ted Pella | #27-11 | Tungsten Wire, ø0.13mm/6.1m (ø.005"/20 ft.) |
| Nutator (Mini twister) | Korean Science | KO.VS-96TWS | Alternatively, BD Clay Adams Brand Nutator (BD 421125) |
References
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