Summary
В этой работе подробно описан метод иммуногистохимии для визуализации проекций моторных нейронов эмбрионов Drosophila melanogaster поздней стадии 16. Филеарный препарат фиксированных эмбрионов, окрашенных антителом FasII, представляет собой мощный инструмент для характеристики генов, необходимых для отслеживания моторного аксона и распознавания мишеней при развитии нервной системы.
Abstract
Установление функциональных нервно-мышечных схем основано на точном соединении между развивающимися двигательными аксонами и мышцами мишени. Моторные нейроны расширяют конусы роста, чтобы перемещаться по определенным путям, реагируя на большое количество сигналов аксонов, которые исходят из окружающей внеклеточной среды. Признание цели конуса роста также играет критическую роль в нервно-мышечной специфичности. В этой работе представлен стандартный протокол иммуногистохимии для визуализации прогнозов моторных нейронов эмбрионов Drosophila melanogaster поздней стадии 16. Этот протокол включает в себя несколько ключевых шагов, включая процедуру генотипирования, для сортировки желаемых мутантных эмбрионов; Иммуноокрашивание, для маркировки эмбрионов с антителом fasciclin II (FasII); И процедуру вскрытия, для получения филе готовых препаратов из фиксированных эмбрионов. Прогнозы монокристалла и мышечные структуры на периферии гораздо лучше визуализируются в плоских препаратах филе эмбрионов, чем в whOle-mount эмбрионов. Таким образом, филеобразный препарат фиксированных эмбрионов, окрашенных антителом FasII, является мощным инструментом для характеристики генов, необходимых для отслеживания траектории моторного аксона и распознавания мишеней, а также может быть применен как к генетическим экранам с потерей функции, так и к генетическим характеристикам ,
Introduction
Точные и селективные связи между аксонами мотора и мышцами мишени во время эмбрионального развития необходимы для нормальной локомоции у личинок дрозофилы . Эпизодическое моделирование 30 мышечных волокон в каждом из абдоминальных полушарий A2-A7 устанавливается на этапе 16 1 . 36 двигательных нейронов, которые генерируются в брюшном нервном шнуре, расширяют свои аксоны на периферию, чтобы иннервировать определенные мышцы мишени 2 . Обнаружение пути мокрого аксона и распознавание мишени можно визуализировать с помощью иммуногистохимии с помощью антитела (мышиного моноклонального антитела 1D4) 3 , 4 . В Интернете доступно несколько изображений моделей проекции аксонных моторов у эмбрионов дикого типа 5 . 1D4-антитело обозначает все моторные аксоны и три продольных аксонных пучка на каждой стороне средней линии эмбриональной центральной нервной системы (ЦНС) 4 , 6 ( рис. 1С и рис. 2А ). Поэтому иммуногистохимия с антителом FasII обеспечивает мощный инструмент для идентификации генов, необходимых для нейромышечной связи, для демонстрации молекулярных механизмов, лежащих в основе руководства аксоном двигателя и распознавания цели.
В каждом из абдоминальных гемосегментов A2-A7 двигательные аксоны проектируются и выборочно пущены в две главные нервные ветви, сегментный нерв (SN) и межсегментный нерв (ISN) 2 , 4 и небольшая нервная ветвь, поперечный нерв (TN ) 7 . SN выборочно обезвреживает образование двух нервных ветвей, называемых SNa и SNc, тогда как ISN разбивается на три нервные ветви, называемые ISN, ISNb и ISNd 2 , 4 . Среди них ISN, ISNb и SNa моторный аксонПроекции наиболее точно визуализируются, когда эмбрионы поздней стадии 16 окрашиваются антителом FasII и филе ( фиг. 1С и фиг. 2А ). Моторные нейроны ISN расширяют свои аксоны до иннервирования дорсальных мышц 1, 2, 3, 4, 9, 10, 11, 18, 19 и 20 2 , 4 ( фиг. 2A ). Моторные нейроны ISNb иннервируют вентролатеральные мускулы 6, 7, 12, 13, 14, 28 и 30 2 , 4 ( фиг. 2A и 2B). Отделение нервной системы SNa предназначено для иннервирования боковых мышц 5, 8, 21, 22, 23 и 24 2 , 4 ( рисунок 2A ). TN, состоящая из двух моторных аксонов, реализует ipsilaterally вдоль сегментарной границы до иннервирующей мышцы 25 и делает синапсы с боковым биполярным дендритным нейроном (LBD) вПериферия 7 ( рисунок 2A ). Эти целевые мышечные иннервации требуют не только выборочной деасцикуляции моторных аксонов в определенных точках выбора, но и распознавания мишеней мышц. Кроме того, некоторые предполагаемые клетки мезодермального ориентира, которые выступают в качестве промежуточных целей, были обнаружены как в пути ISN, так и SNa, но не по пути ISNb 4 . Это может указывать на то, что отслеживание пути аксонов двигателя ISNb может быть отрегулировано в явном виде по сравнению с руководством по аксону с двигателем ISN и SNa, а также указывает на то, что руководство по аксону в периферийном двигателе обеспечивает привлекательную экспериментальную модель для изучения дифференциальных или консервативных ролей одного указательного указателя Молекула 8 .
Эта работа представляет собой стандартный метод визуализации аксонных проекционных рисунков эмбриональных моторных нейронов у Drosophila . Описанные протоколы включают в себя как рассекать фиксированные эмбрионы, окрашенные 1D4 aИ обрабатывали в 3,3'-диаминобензидине (DAB) для филе готовых препаратов. Одним из важных преимуществ плоских препаратов фиксированных эмбрионов является лучшая визуализация аксонных выступов и мышечных структур на периферии. Кроме того, эта работа также показывает, как генотипировать фиксированные эмбрионы для сортировки желаемых мутантных эмбрионов с использованием метода окрашивания LacZ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Подготовка
- Подготовьте 500 мл фосфатно-буферного солевого раствора (PBS) раствором t-октилфеноксиполиэтоксиэтанола (PBT), добавив 0,5 г бычьего сывороточного альбумина (BSA) и 0,5 мл t-октилфеноксиполиэтоксиэтанола (см. Таблицу материалов) к 500 мл 1X PBS И перемешивание в течение по меньшей мере 30 мин. Хранить при температуре 4 ° C. Используйте, когда относительно свежий, и храните раствор в чистой бутылке.
- Сделайте 10 мл 4% параформальдегида, добавив 2,5 мл 16% раствора параформальдегида и 1 мл 10x PBS до 6,5 мл деионизированной воды. Хранить при температуре 4 ° C и использовать в течение одной недели.
ПРЕДУПРЕЖДЕНИЕ. Избегайте контакта с раствором параформальдегида, потому что он очень токсичен. - Получают субстрат X-Gal (10% мас. / Об. X-Gal в диметилсульфоксиде (ДМСО)) путем растворения 0,1 г субстрата X-Gal на 1 мл ДМСО. Хранить при -20 ° С в аликвотах по 100 мкл.
- Получают раствор окрашивания X-Gal с использованием 10 мМ фосфатного буфера (рН 7,2), 150 мМ NaCl, 1 мМ MgCl 2 , 3 мMK 4 [FeII (CN) 6 ], 3 мМ K 3 [FeIII (CN) 6 ] и 0,3% трет-октилфеноксиполиэтоксиэтанола. Хранить при температуре 4 ° C в темноте.
- Сделайте 3% раствор перекиси водорода путем разбавления 30% перекиси водорода 1:10 с деионизированной водой.
- Сделайте раствор 3,3'-диаминобензидина (DAB), полностью растворяя 1 таблетку (10 мг) DAB в 35 мл свежего раствора PBT. Фильтруют через 0,2-мкм фильтр шприца и хранят при -20 ° С в аликвотах по 910 мкл.
ВНИМАНИЕ: Утилизируйте все отходы DAB в отбеливателе, чтобы уничтожить DAB. - Сделайте яйцо с яблочным соком. Добавить 35 г агара и 1 л деионизированной воды в 2-литровую колбу. Добавить 33 г сахарозы, 2 г тегосепта и 375 мл яблочного сока в 1-литровую колбу. Растопить их автоклавированием в течение 30 мин. Дайте обоим растворам остыть примерно до 60 ° C. Смешайте и смешайте эти растворы, помешивая. Залить ~ 11 мл комбинированного раствора на 60 мм культуральную чашку.
- Сделайте дрожжевую пасту смешением пекаря даВ деионизированную воду (соотношение 1: 0,8) и хранить при 4 ° С.
2. Коллекция эмбрионов (День 1)
- Соберите молодых самцов и самцов (моложе 5 дней) и в течение 1-2 дней поддерживайте их в клетке из пластикового стакана с яичной пластинкой (60 мм x 15 мм), которая содержит небольшое количество дрожжевой пасты в центре.
- Для оптимального сбора эмбрионов поздней стадии-16, создайте бутылочную клетку с мухами (> 50) примерно в 5 часов вечера и дайте им отложить яйца при 25 ° C в течение 3 часов.
- Перенесите мух в бутылку с свежими продуктами.
- Закройте пластинку с крышкой и инкубируйте ее вверх ногами при 25 ° C в увлажненном инкубаторе (~ 70% влажности) в течение ночи.
3. Подготовка эмбрионов для иммуноокрашивания (второй день)
- Добавьте 1,8 мл раствора ПБТ к пластине с яйцом около 10:20 утра и используйте ватный тампон, чтобы ослабить эмбрионы с пластины при наклоне.
Примечание: осторожно вымачивая дрожжевую пасту с помощью котаНа тампон, растворите его, если на нем обнаружено большое количество эмбрионов. Начните собирать эмбрионы за 40 минут до фиксации (около 11:00). - Перенесите эмбрионы из яичной пластины в 1,5-мл микротрубочку, используя наконечник пипетки 1 мл.
- Позвольте эмбрионам оседать и аспирировать раствор PBT как можно больше. Промойте эмбрионы дважды 1 мл раствора PBT. Аспирируйте раствор PBT как можно больше.
- Заполните пробирку 1 мл 50% -ного отбеливателя ( то есть, разбавленного в деионизированной воде) и дефорируют эмбрионы, инкубируя их на нутаторе в течение 3 мин при комнатной температуре (RT).
Примечание. Этот шаг не убивает дехризованные эмбрионы. - Позвольте дефорированным эмбрионам оседать, как можно больше аспирируйте 50% отбеливатель и 3 раза промывайте эмбрионы 1 мл раствора PBT.
- Добавить 0,5 мл гептана и затем добавить 0,5 мл 4% раствора параформальдегида в пробирку при комнатной температуре около 11:00.
- ИнкубируйтеЭмбрионов на нутаторе в течение 15 мин при комнатной температуре.
- Удалите 4% раствор параформальдегида (нижний слой).
- Добавить 0,5 мл 100% метанола и деителлинизировать эмбрионы, энергично встряхивая пробирку в течение 30 с.
- Удалите гептан ( то есть верхний слой).
- Добавить 0,5 мл 100% метанола и интенсивно встряхивать пробирку в течение 10 с.
- Позвольте эмбрионам успокоиться, постукивая по трубе и как можно больше аспирируйте метанол. Промыть эмбрионы 1 мл 100% метанола, встряхивая в течение менее 10 с.
Примечание. Длительное воздействие метанола разрушает активность β-Gal. - Удалите метанол и промойте деителлинизированные эмбрионы 3 раза 1 мл раствора PBT.
4. Генотипирование эмбрионов с использованием окрашивания LacZ (день 2)
- Добавить 1 мл раствора PBT в пробирку и инкубировать эту трубку в термостате 37 ° C или водяной бане в течение 15 минут.
- Во время инкубации поместите X-Gal-окрашивающий раствор (1 мл на ту) При температуре 65 ° C на водяной бане до тех пор, пока не станет облачно. Инкубируйте его на водяной бане на 37 ° C.
- Аспирируйте раствор PBT и добавьте 1 мл раствора окрашивания X-Gal и 20 мкл подложки X-Gal в трубку.
- Инкубируйте пробирку при 37 ° С с нутацией до тех пор, пока не станет видно синее осаждение.
Примечание. Время инкубации для 2 -го и 3 -го синих балансиров обычно составляет от 2 до 4 часов. - Удалите раствор окрашивания X-Gal и промойте эмбрионы 3 раза 1 мл раствора RT PBT.
- Используя игольчатый зонд или щипцы, вручную сортируйте эмбрионы желаемого генотипа ( то есть, не окрашенные белые эмбрионы) с помощью светочувствительного микроскопа (цели 1,6X-2,5X).
Примечание: Поскольку некоторые синие балансиры, такие как CyO, actin-LacZ и TM3, актин-LacZ , несут трансгенную конструкцию, экспрессирующую бактериальный β-Gal (LacZ) под контролем активатора актина , эмбрионы, окрашенные в синий цвет повсеместно, содержатОдна или две копии синих балансирующих хромосом. Поэтому не окрашенные белые эмбрионы являются гомозиготными по желаемому летальному аллелю.
5. Иммуноокрашивание эмбрионов антителами против Fasciclin II (2-3-й день)
- Собирают и переносят эмбрионы желаемого генотипа ( то есть не окрашенных белых эмбрионов) в 0,5 мл микротрубочки с использованием наконечника пипетки 1 мл.
Примечание: на этом этапе эмбрионы могут быть грубо поставлены в соответствии с морфологическими критериями, включая модели сегментации кутикулы и структуры головы и хвоста 9 . Во время инволюции головы, между 10 и 16 ч после укладки яиц, эмбрион подвергается значительному сокращению самого переднего сегмента 9 . - Вымойте эмбрионы один раз 0,4 мл раствора PBT и добавьте 0,3 мл блокирующего раствора (5% нормальной сыворотки коз и 5% ДМСО в растворе PBT).
- Заблокируйте эмбрионы нутацией при комнатной температуре в течение 15 мин.
- Промывайте эмбрионы 4 раза с помощью 0,4 мл раствора PBT в течение по меньшей мере 20 минут на промывку.
- Добавьте 0,3 мл блокирующего раствора (5% нормальной козьего сыворотки в PBT-раствор), содержащего антитело против кошки против мыши-HRP (2 мкг / мл) и инкубируйте пробирку с нутацией при RT в течение ночи.
- Вымойте эмбрионы 6 раз с 0,4 мл раствора PBT в течение по меньшей мере 20 минут на промывку.
- Добавить 0,3 мл раствора DAB в пробирку.
ПРЕДОСТЕРЕЖЕНИЕ: Наденьте перчатки и поместите все отходы / трубки / наконечники DAB в отбеливатель. - Добавьте 2 мкл 3% перекиси водорода и инкубируйте пробирку в темноте с нутацией при комнатной температуре до получения желаемого количества осадка.
Примечание. Время инкубации для иммуногистохимии 1D4 в целом составляет 0,5-1 ч. - Вымойте эмбрионы 4 раза с помощью 0,4 мл раствора PBT.
ПРЕДОСТЕРЕЖЕНИЕ: Удалите раствор DAB и первые две промывки пипеткой и диОшпаривают их в отбеливатель. - Добавить 0,2 мл 70% -ного раствора глицерина / PBS в пробирку и хранить при комнатной температуре или 4 ° C.
Примечание. Держите трубку подальше от света. Более чистые препараты могут быть получены путем помещения эмбрионов в 90% раствор глицерина / PBS 10 . Однако сложнее рассекать эмбрионы, очищенные в 90% растворе глицерина / PBS, чем те, которые очищены в 70% растворе глицерина / PBS 10 .
6. Проведение, рассечение, установка и визуализация эмбрионов (день 4)
- Для постановки операции переносите эмбрионы, уравновешенные 70% глицерина / PBS, на стеклянный предмет.
- Собирайте эмбрионы поздней стадии 16, у которых абдоминальный сегмент 7 (A7), A8 и A9 нервы ISN сходятся, чтобы касаться друг друга или / и имеют среднюю кишку, которая подразделяется на три группы.
Примечание. Эмбрионы, окрашенные 1D4-антителом, могут быть организованы на основе проекционных рисунков моторных аксонов ISN и ISNb. После выхода из CNS, A7, A8 и A9 ISN neRves эмбрионов поздней стадии-16 сходятся, чтобы коснуться друг друга и впоследствии расходиться, чтобы простираться далеко до дорзальных мышц (стрелка на рис. 1А ). Однако у эмбрионов середины-16 нервы A7 ISN распространяются параллельно с нервами A8 / A9 (квадратная скобка на рисунке 1B ). Кроме того, проекционные оси нервов A6 ISNb (перпендикулярно вентролатеральным мышцам) в обоих полушариях грубо выровнены с задним концом продольных аксонных пучков CNS (стрелки и линия на рисунке 1C ). Эти морфологические критерии несколько различаются между различными генотипами. Альтернативно, эмбрионы могут быть организованы на основе морфологии кишечника 9 , 11 . До этапа 17 средняя кишка имеет сердечную форму, тогда как средняя кисть подразделяется на три полосы по этапу 17 12 . - Рассеивайте эмбрионы.
- Использование 1 мL, переместите каждый эмбрион из глицериновой капли и поместите эмбрион вентрально вверх. Отрежьте переднюю часть на 1/4 длины тела и самую заднюю область, свободную от моторных аксонов.
- Используя игольчатый зонд, переместите вырезанный эмбрион из глицериновой капли, чтобы ориентировать его дорзальной стороной вверх и поместить его горизонтально в поле.
Примечание: Когда эмбрион перемещается из глицериновой капли, немного глицерина, связанного с эмбрионом, делает его липким. - Вырежьте эмбрион вдоль спинной срединной линии, используя одну очень тонкую вольфрамовую иглу 13 . Сделайте небольшой разрез на заднем конце эмбриона, а затем продолжайте резать спинную среднюю линию к передней; Резка в противоположном направлении также прекрасна.
- Используя игольчатый зонд, переместите срединный срезанный эмбрион в каплю глицерина, поместите его дорзальной стороной вверх и отсоедините кишечник от стенки корпуса, развернув каждую стенку тела в вентролатеральном (диагональном) направлении (2.5X).
Примечание. Убедитесь, что спинная средняя линия полностью отрезана, что приводит к полному разделению между левой и правой стенками корпуса. - Осторожно перемещайте эмбрион с срединной средой из глицериновой капли, а затем положите два лоскута стенки тела на стеклянную ползунь с помощью тонкого иглодержателя (цель 2.5X).
- Используя очень тонкую вольфрамовую иглу, удалите внутренние органы из расчлененного эмбриона, нажимая их в поперечном направлении (объектив 5X).
Примечание. Более подробное описание другой аналогичной процедуры вскрытия можно найти на веб-сайте 5 .
- Для монтажа добавьте 2-3 мкл 70% раствора глицерина / PBS для очистки, рассечения эмбрионов и, используя тонкий иглопробивной аппарат, перенесите их на новый стеклянный предмет, на который 8 мкл 70% раствора глицерина / PBS Центр (цель 2.5X).
- Наденьте покровное (18 мм x 18 мм). Уплотните края покровного стекла обычным лаком для ногтей (либоПрозрачный или цветной).
- Захват изображений с высоким разрешением (20X, 40X и 63X маслонаполняющих целей) под микроскопом с дифференциальным помеховым контрастом (DIC) в соответствии с инструкциями производителя.
Примечание. Лучшая визуализация и фенотипическая характеристика, особенно для аксонов двигателя ISNb, могут быть получены с использованием объекта 63X для погружения масла.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Точные соединения между аксонами мотора и мышцами мишени при развитии нервной системы зависят от селективного отталкивания аксонов и аксонов и распознавания цели в определенных точках выбора 4 . У дрозофилы селективное отталкивание между моторными аксонами частично регулируется комбинированным действием семафоринов класса 1 и 2 (Семас), включая Sema-1a, Sema-2a и Sema-2b 8 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , Таким образом, потеря функции Sema-1a часто приводит к отказу аксонов ISNb к обезвреживанию в определенных точках выбора, заставляя их проявлять аномально толстую морфологию (стрелка на рисунке 2C ). У эмбрионов дикого типа, по крайней мере, 7 двигательных нейронов расширяются и разбухают их аксоны, образуя ISNB нервная ветвь ( рис. 2А ). Когда нервная ветвь ISNb достигает точки выбора, которая расположена между мышцами 6 и 7, два аксона выборочно обезглавливаются из основного пучка ISNb и затем иннервируют мышцы 6 и 7 ( рисунок 2B ). В следующем пункте выбора, который расположен между мышцами 6, 13 и 30, еще три моторных аксона выборочно обезвреживаются для иннервирования мышц 13, 14 и 30 ( рисунок 2B ). Оставшиеся два аксона простираются дорзально, чтобы достичь последней точки выбора вблизи края мышцы 12, тем самым иннервируя мышцу 12 в противоположном направлении ( рис. 2В ). Эти результаты ясно показывают, что протокол филе готового препарата является полезным инструментом для изучения генов, необходимых для руководства двигательным аксоном.
Рисунок 2: Модели проекции аксонных моторов в эмбрионах дикого типа и Sema-1a . ( A - C ) Филе готового препарата эмбрионов поздней стадии-16, окрашенных антителом FasII. Передний левый и вентральный вниз. Схематические диаграммы, показывающие рисунки проекции аксонов, представленные на каждой панели. Шкала шкалы = 15 мкм. ( A ) Яркая фотография поля двух последовательных абдоминальных hemisegments, A3 и A4, у эмбрионов дикого типа. В ЦНС присутствуют три билатерально симметричных продольных пучка аксонов. Нормальные образцы иннервации монгольских аксонов ISNb, SNa, ISN и TN обозначены коробками и стрелкой на периферии. Боковой нейронов биполярного дендрита (LBD), который иннервирует мышцы алари, является индикаторомEd стрелкой. На схематической диаграмме представлены нервные ветви и образцы иннервации ISNb (коричневого цвета), SNa (в синем), ISN (в зеленом цвете) и TN (в желтых) моторных нейронах и их мышцах-мишенях. Позиции тела клеток этих моторных нейронов в ЦНС также показаны в их собственных цветах. ( B ) У эмбрионов дикого типа аксоны ISNb проецируются в вентролатеральные мышцы, которые нумеруются и иннервируют их в определенных точках выбора (стрелки на изображении DIC). ( C ) В Sema-1a мутанты с потерями функциональности аксоны ISNb часто не могут обезвредить друг друга между мышцами 6 и 13 (стрелка в изображении DIC). Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Детали дефектов наведения аксонов двигателя оцениваются быстрее и с большей точностью путем филеарного приготовления эмбрионов, окрашенных DAB, чем лазерная сканирующая конфокальная микроскопия флуоресцентно меченных. Таким образом, филеобразный препарат фиксированных и 1D4-окрашенных эмбрионов лучше всего подходит для функциональной характеристики молекул контрольной кии. Четыре основных класса рекомендаций, в том числе нетрины, разрезы, семафорины (Семас) и эфрины, и их родственные рецепторы имеют эволюционно сохраняющиеся роли у червей, мух и позвоночных 20 . Среди кольцевых (Robo) семейных молекул, которые действуют как рецепторы для Slits, Drosophila Robo впервые была идентифицирована, чтобы опосредовать функцию отталкивающего наведения в CNS 6 , 21 . Семамы - это большое семейство молекул наведения, которые связываются с плексинсодержащими рецепторными комплексами 22 . Функция управления аксоном СемасаБыл впервые обнаружен в кузнечике ЦНС 14 . Впоследствии трансмембранный семафорин класса 1 был подробно описан в Drosophila . Сема-1а, которая функционирует не только как лиганд для плексина А, но и как рецептор для неизвестного лиганда, играет важную роль в отталкивании аксоном-аксоном в определенных точках выбора во время эмбрионального нейронного развития 15 , 16 , 17 , 18 ( Рисунок 2C ).
Существует несколько общих шагов устранения неполадок, которые могут возникнуть в текущем протоколе. Во-первых, на этапах 3.9-3.13 эмбрионы могут быть деителлинизированы с низкой эффективностью, если слишком много или слишком мелких эмбрионов используются в методе деителлинизации метанола. В этом случае рекомендуется использовать объем ложа 40-80 мкл фиксированных эмбрионов для деителлинизации на этапе 3.5. Во-вторых, в stePs 3,9-3,13, слабое окрашивание X-Gal может происходить в случае более длительного воздействия метанола или неполного удаления гептана, поскольку метанол, используемый в качестве фиксатора, разрушает активность β-Gal. В этом случае лучше всего, чтобы процедура деителлинизации с использованием метанола на этапах 3.9-3.13 выполнялась как можно быстрее. Кроме того, остаточный гептан, который растворяется в метаноле, может препятствовать окрашиванию; Поэтому лучше всего удалить столько метанола, сколько возможно на этапах 3.11-3.13.
Текущий протокол филе готового препарата может быть применен к генетическим экранам с потерей функции и усилением функции, чтобы идентифицировать новые гены, которые участвуют в отслеживании пути мотора и распознавании цели. Однако недостатком этого протокола является то, что отнимать фиксированные эмбрионы для создания филе готовых препаратов довольно трудоемко. Чтобы преодолеть эту проблему, фенотипическая характеристика аксонных проекций может контролироваться при подготовке к целому набору 1D4-окрашенных эмбрионовRyos, хотя этот метод обеспечивает визуализацию аксонных проекций на периферии с низким разрешением. Тем не менее, протокол подготовки всего монтирования оказался эффективным подходом для скрининга генов для руководства аксоном 4 . Альтернативный протокол, использующий активную рассечение флуоресцентно меченных эмбрионов, был недавно разработан для систематического скрининга 11 . Протокол живой диссекции позволяет относительно быстро подготовиться к фенотипическому анализу 11 . Однако этот протокол не подходит для эмбрионов старше начала 17-го этапа.
Протокол филеобразного препарата, описанный здесь, может быть использован для изучения образцов экспрессии белка с различными антителами. Кроме того, этот протокол может также применяться к эмбрионам дрозофилы на разных стадиях развития.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Автор заявляет, что у него нет конкурирующих финансовых интересов.
Acknowledgments
Я благодарю Алексея Колодкина, так как я узнал этот протокол филе подготовки в своей лаборатории. Я также благодарю Young Gi Hong за техническую помощь. Это исследование было поддержано NRF-2013R1A1A4A01011329 (SJ).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | t-Octylphenoxypolyethoxyethanol |
| 16% Paraformaldehyde Solution | Ted Pella | 18505 | |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S5886 | |
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P5405 | |
| Sodium Phosphate Dibasic | Sigma-Aldrich | 30435 | |
| Sodium Phosphate Monobasic | Sigma-Aldrich | 71500 | |
| X-Gal Substrate | US Biological | X1000 | X-Gal (5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-b-D-galactoside galactopyranoside) |
| Dimethyl Sulfxide | Sigma-Aldrich | D4540 | |
| Magnesium Chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Potassium hexacyanoferrate(II) trihydrate | Sigma-Aldrich | P9387 | |
| Potassium hexacyanoferrate(III) | Sigma-Aldrich | 244023 | |
| Hydrogen Peroxide | Sigma-Aldrich | 216763 | |
| 3,3'-diaminobenzidine Tetrahydrochloride | Sigma-Aldrich | D5905 | |
| Agar | US Biological | A0930 | |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-3 | |
| Tegosept (Methy 4-Hydroxybenzoate) | Sigma-Aldrich | H5501 | |
| Culture Dish (60 mm) | Corning | 430166 | |
| Tricon Beaker | Simport | B700-100 | This is used to make a plastic beaker cage for embryo collection. |
| Yeast | Societe Industrielle Lesaffre | Saf Instant Yeast Red | |
| Cotton Swab (Wooden Single Tip Cotton PK100) | VWR | 14220-263 | |
| Eppendorf Tube (1.5 ml) | Sarstedt | #72.690 | |
| Bleach | The Clorox Company | Clorox | |
| Heptane | Sigma-Aldrich | 246654 | |
| Methanol | J.T. Baker | UN1230 | |
| Normal Goat Serum | Life Technologies | 16210-064 | |
| Anti-FasciculinII Antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | 1D4 anti-Fasciclin II | |
| Goat Anti-mouse-HRP Antibody | Jackson Immunoresearch | 115-006-068 | AffiniPure F(ab')2 Fragment Goat Anti-Mouse IgG+IgM (H+L) (min X Hu, Bov, Hrs Sr Prot |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G9012 | |
| Slide Glass | Duran Group | 235501403 | |
| Coverslip | Duran Group | 235503104 | 18 x 18 mm |
| 1 ml Syringe | Becton Dickinson Medical(s) | 301321 | |
| Tungsten Needle | Ted Pella | #27-11 | Tungsten Wire, ø0.13mm/6.1m (ø.005"/20 ft.) |
| Nutator (Mini twister) | Korean Science | KO.VS-96TWS | Alternatively, BD Clay Adams Brand Nutator (BD 421125) |
References
- Bate, M. The embryonic development of larval muscles in Drosophila. Development. 110 (3), 791-804 (1990).
- Landgraf, M., Thor, S. Development of Drosophila motoneurons: specification and morphology. Semin. Cell Dev. Biol. 17 (1), 3-11 (2006).
- Grenningloh, G., Rehm, E. J., Goodman, C. S. Genetic analysis of growth cone guidance in Drosophila: fasciclin II functions as a neuronal recognition molecule. Cell. 67 (1), 45-57 (1991).
- Vactor, D. V., Sink, H., Fambrough, D., Tsoo, R., Goodman, C. S. Genes that control neuromuscular specificity in Drosophila. Cell. 73 (6), 1137-1153 (1993).
- Zinn Lab. , California Institute of Technology. Available from: https://www.its.caltech.edu/~zinnlab/motoraxons.html (2017).
- Seeger, M., Tear, G., Ferres-Marco, D., Goodman, C. S. Mutations affecting growth cone guidance in Drosophila: genes necessary for guidance toward or away from the midline. Neuron. 10 (3), 409-426 (1993).
- Thor, S., Thomas, J. B. The Drosophila islet gene governs axon pathfinding and neurotransmitter identity. Neuron. 18 (3), 397-409 (1997).
- Roh, S., Yang, D. S., Jeong, S. Differential ligand regulation of PlexB signaling in motor neuron axon guidance in Drosophila. Int. J. Dev. Neurosci. 55, 34-40 (2016).
- Campos-Ortega, J. A., Hartenstein, V. The embryonic development of Drosophila melanogaster. , Springer-Verlag. New York. (1985).
- Patel, N. H. Imaging neuronal subsets and other cell types in whole mount Drosophila embryos and larvae using antibody probes. Methods in cell biology, vol 44. Drosophila melanogaster: practical uses in cell biology. Goldstein, L. S. B., Fyrberg, E. 44, Academic Press. New York. 445-487 (1994).
- Lee, H. K., Wright, A. P., Zinn, K. Live dissection of Drosophila embryos: streamlined methods for screening mutant collections by antibody staining. J. Vis. Exp. (34), (2009).
- Hartenstein, V. Stages of Embryonic Development. Atlas of Drosophila. development. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. Available from: http://www.sdbonline.org/sites/fly/atlas/52.htm 52 (1993).
- Brady, J. A simple technique for making very fine, durable dissecting needles by sharpening tungsten wire electrolytically. Bull. World Health Organ. 32 (1), 143-144 (1965).
- Kolodkin, A. L. Fasciclin IV: sequence, expression, and function during growth cone guidance in the grasshopper embryo. Neuron. 9 (5), 831-845 (1992).
- Jeong, S., Juhaszova, K., Kolodkin, A. L. The Control of semaphorin-1a-mediated reverse signaling by opposing pebble and RhoGAPp190 functions in Drosophila. Neuron. 76 (4), 721-734 (2012).
- Winberg, M. L. Plexin A is a neuronal semaphorin receptor that controls axon guidance. Cell. 95 (7), 903-916 (1998).
- Yang, D. S., Roh, S., Jeong, S. The axon guidance function of Rap1 small GTPase is independent of PlexA RasGAP activity in Drosophila. Dev. Biol. 418 (2), 258-267 (2016).
- Yu, H. H., Araj, H. H., Ralls, S. A., Kolodkin, A. L. The transmembrane Semaphorin Sema I is required in Drosophila for embryonic motor and CNS axon guidance. Neuron. 20 (2), 207-220 (1998).
- Hartenstein, V. Stages of Embryonic Development. Atlas of Drosophila. development. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. Available from: http://www.sdbonline.org/sites/fly/atlas/52.htm 52 (1993).
- Dickson, B. J.
- Kidd, T. Roundabout controls axon crossing of the CNS midline and defines a novel subfamily of evolutionarily conserved guidance receptors. Cell. 92 (2), 205-215 (1998).
- Pasterkamp, R. J. Getting neural circuits into shape with semaphorins. Nat. Rev. Neurosci. 13 (9), 605-618 (2012).
