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Neuroscience

भ्रूण मोटर न्यूरॉन्स के एक्सोनल प्रोजेक्शन पैटर्न का विज़ुअलाइज़ेशन Published: June 16, 2017 doi: 10.3791/55830
Automatic Translation
1
1Department of Molecular Biology, Chonbuk National University

Summary

यह कार्य देर से चरण -16 ड्रोसोफिला मेलेनोगास्टर भ्रूण के मोटर न्यूरॉन अनुमानों को देखने के लिए एक मानक इम्यूनोहिस्टोकेमस्ट्री विधि का विवरण देता है। फासीआई एंटीबॉडी के साथ दागित निश्चित भ्रूणों की तैयार की गई तैयारी मरीज के लिए आवश्यक जीन को चिह्नित करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण प्रदान करता है, जो तंत्रिका विकास के दौरान मोटर अक्षतंतु के पथपथिंग और लक्ष्य मान्यता के लिए आवश्यक है।

Abstract

कार्यात्मक neuromuscular सर्किट की स्थापना मोटर axons और लक्ष्य मांसपेशियों के विकास के बीच सटीक कनेक्शन पर निर्भर करता है। मोटर न्यूरॉन्स, बड़े पैमाने पर एपोन मार्गदर्शन संकेतों का जवाब देकर विशिष्ट मार्गों के साथ नेविगेट करने के लिए विकास शंकुओं का विस्तार करते हैं जो आसपास के बाह्य वातावरण से निकलते हैं। विकास शंकु लक्ष्य मान्यता स्नायविक विशेषताओं में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाती है। यह काम देर से चरण -16 ड्रोसोफिला मेलेनोगास्टर भ्रूण के मोटर न्यूरॉन अनुमानों को देखने के लिए एक मानक इम्यूनोहिस्टोकेमेट्री प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है। वांछित उत्परिवर्ती भ्रूण को क्रमबद्ध करने के लिए, इस प्रोटोकॉल में कुछ प्रमुख कदम शामिल हैं, जिसमें जीनोटाइपिंग प्रक्रिया भी शामिल है; एक फैमिलीलिन II (फासीआई) एंटीबॉडी के साथ भ्रूण को टैग करने के लिए, एक immunostaining प्रक्रिया; और एक विच्छेदन प्रक्रिया, निर्धारित भ्रूण से filleted तैयारी उत्पन्न करने के लिए। परिधि में मोटर अक्षतंतु के अनुमानों और मांसपेशियों के पैटर्न में फ़ैलते हुए भ्रूण के फ्लैट की तैयारी में बहुत बेहतर कल्पना की जाती हैऑल-माउंट भ्रूण इसलिए, FasII एंटीबॉडी के साथ दाग वाले निश्चित भ्रूणों की तैयार की गई तैयारी मोटर एक्सॉन पथफंडिंग और लक्ष्य मान्यता के लिए आवश्यक जीन को चिह्नित करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण प्रदान करता है, और यह दोनों के नुकसान-के-फ़ंक्शन और फ़ंक्शन आनुवंशिक स्क्रीन के लिए भी लागू किया जा सकता है ।

Introduction

ड्रोसोफिला लार्वा में सामान्य गतिरोध के लिए भ्रूण के विकास के दौरान मोटर एक्सॉन और लक्ष्य की मांसपेशियों के बीच सटीक और चयनात्मक कनेक्शन आवश्यक हैं। ए 2-ए 7 के प्रत्येक पेट के गोलाकारों में 30 मांसपेशियों के फाइबर के भ्रूण पैटर्न को चरण 16 1 द्वारा स्थापित किया गया है। वेंट्रल तंत्रिका कॉर्ड में उत्पन्न 36 मोटर न्यूरॉन्स विशिष्ट लक्ष्य की मांसपेशियों को आवेशित करने के लिए परिधि में अपने एक्सॉन का विस्तार करते हैं। मोटर एक्सॉन पाथफाइंडिंग और लक्ष्य मान्यता को एंटीबॉडी (माउस मोनोक्लोनल एंटीबॉडी 1 डी 4 ) 3 , 4 के साथ प्रतिरक्षाविज्ञान द्वारा देखे जा सकते हैं। Wildtype भ्रूण में मोटर एक्सॉन प्रक्षेपण पैटर्न की कई छवियां वेब 5 पर उपलब्ध हैं । 1 डी 4 एंटीबॉडी भ्रूण केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) के मध्य रेखा के प्रत्येक हिस्से पर सभी मोटर अक्षों और तीन अनुदैर्ध्य axon fascicles लेबल करता है , 6 ( चित्रा -1 सी और चित्रा 2 ए )। इसलिए, FasII एंटीबॉडी के साथ इम्युनोहिस्टोकेमिस्ट्री, मोटर एफ़ोनन मार्गदर्शन और लक्ष्य मान्यता वाले आणविक तंत्र का प्रदर्शन करने के लिए न्यूरोस्कुल्युलर कनेक्टिविटी के लिए आवश्यक जीन की पहचान करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण प्रदान करता है।

प्रत्येक पेट में हेमिसिडेज ए 2-ए 7, मोटर एक्सॉन्स प्रोजेक्ट और दो प्रमुख तंत्रिका शाखाओं, कंबल तंत्रिका (एसएन) और अंतर्सैक्षीय तंत्रिका (आईएसएन) 2 , 4 , और एक छोटी सी तंत्रिका शाखा, अनुक्रम तंत्रिका (टीएन ) 7 एसएन चुनिंदा एसएनए और एसएनसी नामक दो तंत्रिका शाखाओं को जन्म देने के लिए डिस्फेक्टिबल बनाता है, जबकि आईएसएन आईएसएन, आईएसएनबी और आईएसएनडी 2 , 4 नामक तीन तंत्रिका शाखाओं में विभाजित है। उनमें से, आईएसएन, आईएसएनबी, और एसएनए मोटर एक्सॉनप्रक्षेपण पैटर्न सबसे सटीक रूप से देखा जाता है जब देर से चरण -16 भ्रूण FasII एंटीबॉडी के साथ दाग रहे हैं और उन्हें चित्रित किया गया है ( चित्रा 1 सी और चित्रा 2 ए )। आईएसएन मोटर न्यूरॉन्स पृष्ठीय मांसपेशियों 1, 2, 3, 4, 9, 10, 11, 18, 1 9, और 20 2 , 4 ( चित्रा 2 ए ) में सांत्वना करने के लिए अपने कुल्हाड़ियों का विस्तार करते हैं। आईएसएनबी मोटर न्यूरॉन्स 6, 7, 12, 13, 14, 28, और 30 2 , 4 ( चित्रा 2 ए और 2 बी) के निचले हिस्से में दांतों की खुराक पेश करते हैं। एसएनए तंत्रिका शाखाएं पाल की मांसपेशियों 5, 8, 21, 22, 23 और 24 2 , 4 ( चित्रा 2 ए ) में प्रवेश करने के लिए प्रोजेक्ट करती हैं। तमिलनाडु, जिसमें दो मोटर अक्षांश होते हैं, स्तरीय सीमा के साथ-साथ मांसपेशियों को आवेशित करने के लिए प्रोजेक्ट को दो भागों में बांधा जाता है और पार्श्व द्विध्रुवी वृक्ष के समान न्यूरॉन (एलबीडी) के साथ शल्यक्रिया करता है।परिधि 7 ( चित्रा 2 ए ) इन लक्ष्यित मांसपेशियों में रहने की जगहों की आवश्यकता न केवल विशिष्ट पसंद बिंदुओं पर मोटर अक्षरों के डिफ़ैक्ज्यूलेशन का कारण है, बल्कि मांसपेशियों की पहचान को भी लक्षित करता है। इसके अलावा, आईएसएन और एसएनए दोनों रास्तेों में इंटरमीडिएट लक्ष्य के रूप में कार्य करने वाले कुछ ख्यातन मेसोडर्मल गाइडपोस्ट कोशिका पाए गए हैं, लेकिन आईएसएनबी मार्ग 4 के साथ नहीं। यह सुझाव दे सकता है कि आईएसएनबी मोटर एक्सॉन पथफंडिंग को आईएसएन और एसएनए मोटर एक्सॉन मार्गदर्शन की तुलना में एक अलग तरीके से विनियमित किया जा सकता है, और यह भी इंगित करता है कि परिधीय मोटर अक्ष मार्गदर्शन एक एकल मार्गदर्शन क्यूई के विभेदक या संरक्षित भूमिकाओं का अध्ययन करने के लिए एक आकर्षक प्रायोगिक मॉडल प्रदान करता है अणु 8

ड्रोसोफिला में भ्रूण मोटर न्यूरॉन्स के अक्षीय प्रक्षेपण पैटर्न की कल्पना करने के लिए यह काम एक मानक विधि प्रस्तुत करता है। वर्णित प्रोटोकॉल में 1 डी 4 ए के साथ दाग वाले निश्चित भ्रूण को कैसे छेड़ना हैNtibody और तैयार की गई तैयारी के लिए 3,3'-हिरिनोबेंज़ाइडिन (डीएबी) में संसाधित। निश्चित भ्रूण की सपाट तैयारियों का एक महत्वपूर्ण लाभ परिधि में axonal अनुमानों और मांसपेशियों के पैटर्न का बेहतर दृश्य है। इसके अलावा, यह काम यह भी दिखाता है कि एलएसीजेड धुंधला विधि का उपयोग करने वाले वांछित उत्परिवर्ती भ्रूण को क्रमबद्ध करने के लिए निर्धारित भ्रूण को कैसे जीनोटाइप किया जा सकता है।

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Protocol

1. तैयारी

  1. 1X पीबीएस के 500 एमएल के लिए 0.5 एमएल बायोवाइन सीरम अल्ब्यूमिन (बीएसए) और 0.5 एमएल ऑफ टी-ऑक्टाइलपीनएक्सी पॉलीइथॉक्सीएथेनॉल (सामग्री की तालिका देखें) को जोड़कर 500 मिलीलीटर फॉस्फेट-बफर्ड खारा (पीबीएस) टी-ऑक्टाइलपीनएक्सीपोलिथॉक्सीथानॉल (पीबीटी) समाधान के साथ तैयार करें। और कम से कम 30 मिनट के लिए सरगर्मी 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें अपेक्षाकृत ताजे समय का उपयोग करें और एक साफ बोतल में समाधान का संग्रह करें।
  2. 8 एमएल 4% पैराफॉर्मालाडीहैड को 2.5 एमएल का 16% स्टॉक पैराफार्मैडाइहाइड समाधान और 1 एमएल का 10 एक्स पीबीएस को डीओनेज्ड वॉटर के 6.5 एमएल जोड़कर बनायें। 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें और एक सप्ताह में उपयोग करें।
    सावधानी: पैराफॉर्माल्डहाइड समाधान से त्वचा से बचें, क्योंकि यह बेहद विषाक्त है।
  3. डीएमएसओ के 1 एमएल प्रति एक्स-गैल सब्सट्रेट के 0.1 ग्राम को भंग करके एक्स-गैल सब्सट्रेट (10% वाय / वी डाइमिथाइल सल्फ़ॉक्साइड (डीएमएसओ) में एक्स-गैल करें) 100 μL aliquots में -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें
  4. 10 मिमी फॉस्फेट बफर (पीएच 7.2), 150 मिमी NaCl, 1 मिमी एमजीसीएल 2 , 3 मीएम 4 [FeII (सीएन) 6 ], 3 एमएम के 3 [FeIII (सीएन) 6 ], और 0.3% टी-ऑक्टाइलपीनॉक्सीओपीओलेक्सीथानॉल। अंधेरे में 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  5. विआयनीकृत पानी के साथ 30% स्टॉक हाइड्रोजन पेरोक्साइड 1:10 को कम करके 3% हाइड्रोजन पेरोक्साइड समाधान करें।
  6. 3 एमएएल के ताजा पीबीटी समाधान में 1 टैबलेट (10 मिलीग्राम) डीएबी में पूरी तरह से भंग करके 3,3'-हिरणोबेंजिडाइन (डीएबी) समाधान करें। एक 0.2-माइक्रोन सिरिंज फिल्टर के माध्यम से फिल्टर करें और 910 μL अल्कोट्स में -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    सावधानी: डीएबी को नष्ट करने के लिए ब्लीच में सभी डैब अपशिष्ट का निपटारा
  7. सेब के रस के साथ अंडा प्लेट बनायें 35 ग्राम अगर और 2 एल फ्लास्क के लिए 1 एल विआयनीकृत पानी जोड़ें। 1 जी एल फ्लास्क में 33 ग्राम सूरोज़, 2 ग्राम टेगॉसिस्ट और 375 एमएल सेब का रस जोड़ें। उन्हें 30 मिनट के लिए आटोक्लेविंग द्वारा पिघलाना दोनों समाधानों को लगभग 60 डिग्री सेल्सियस तक शांत करने दें सरगर्मी करके इन समाधानों को मिलाकर मिश्रण करें। 60 मिमी संस्कृति डिश के लिए संयुक्त समाधान के 11 एमएल डालो।
  8. बेकर हाँ मिश्रण करके खमीर पेस्ट करेंविखंडित पानी (1: 0.8 अनुपात) में सेंट और 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें

2. भ्रूण संग्रह (1 दिन)

  1. युवा महिला और पुरुष मक्खियों को इकट्ठा (5 दिनों से कम), और 1-2 दिनों के लिए, उन्हें अंडे की थाली (60 मिमी x 15 मिमी) के साथ एक प्लास्टिक बीकर के पिंजरे में बनाए रखें जिसमें केंद्र में खमीर की एक छोटी पेस्ट होती है।
  2. देर से चरण -16 भ्रूण के इष्टतम संग्रह के लिए, लगभग 5 बजे मक्खियों (> 50) के साथ एक बोतल के पिंजरे की स्थापना करें और उन्हें 3 घंटे के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर अंडे दें।
  3. मक्खियों को एक ताजा भोजन की बोतल में स्थानांतरित करें
  4. ढक्कन के साथ अंडे की प्लेट को बंद करें और रात भर में उमसदार इनक्यूबेटर (~ 70% आर्द्रता) में 25 डिग्री सेल्सियस पर उल्टी से उतारें।

3. Immunostaining के लिए भ्रूण की तैयारी (2 दिन)

  1. 10:20 पूर्वाह्न के आसपास अंडे की थाली के लिए पीबीटी समाधान के 1.8 एमएल जोड़ें और एक कपास झाड़ू का प्रयोग करें ताकि भ्रूण को ढकने के दौरान प्लेट से ढंकना पड़े।
    नोट: एक कॉट का उपयोग करते हुए खमीर पेस्ट को धीरे से मैश करनास्वाब पर, उस पर भ्रूण की एक बड़ी संख्या पाए जाने पर इसे भंग कर दें। भ्रूण एकत्र करना शुरू करें ~ निर्धारण के पहले 40 मिनट (लगभग 11:00 पूर्वाह्न)।
  2. भ्रूण को 1 एमएल विंदुक टिप का प्रयोग करके अंडा प्लेट से 1.5 एमएल माइक्रोट्यूब में स्थानांतरित करें।
  3. भ्रूण को व्यवस्थित करने और पीबीटी समाधान को जितना संभव हो उतना ही असीमित करने की अनुमति दें। पीबीटी समाधान के 1 एमएल के साथ भ्रूण दो बार कुल्ला। जितना संभव हो उतना पीबीटी समाधान की आकांक्षा।
  4. 50% ब्लीच ( यानी, विआयनीकृत पानी में पतला) के 1 एमएल के साथ ट्यूब भरें और कमरे के तापमान (आरटी) पर 3 मिनट के लिए एक न्युटोनेटर पर इनक्यूबेट करके भ्रूण को भ्रष्ट करें।
    ध्यान दें: यह कदम dechorionated भ्रूण को मार नहीं करता है।
  5. Dechorionated भ्रूण को व्यवस्थित करने की अनुमति दें, जितना संभव हो उतना 50% ब्लीच महाप्राणण करें, और पीबीटी समाधान के 1 एमएल के साथ भ्रूण को 3 बार कुल्ला।
  6. हेप्टेन की 0.5 मिलीलीटर जोड़ें और बाद में लगभग 11:00 बजे आरटी पर ट्यूब के 0.5 मिलीलीटर 4% पैराफॉर्मालाइडहाइड समाधान जोड़ें।
  7. इस सेते हैंआरटी पर 15 मिनट के लिए एक nutator पर भ्रूण
  8. 4% पैराफार्मैडाइहाइड समाधान (नीचे की परत) निकालें।
  9. 100 मीथेनॉल में 0.5 एमएल जोड़ें और भ्रूण को 30 सेकंड के लिए सख्ती से ट्यूब मिलाते हुए विकृत करें।
  10. हेपटेन निकालें ( यानी, ऊपर की परत)।
  11. 100 मीथेनॉल में 0.5 एमएल जोड़ें और 10 एस के लिए सख्ती से ट्यूब को हिलाएं।
  12. भ्रूण को ट्यूब दोहन करके व्यवस्थित करने की अनुमति दें और जितना संभव हो मेथनॉल को महाप्राणण करें। 100% मेथनॉल के 1 एमएल के साथ भ्रूण कुल्ला, 10 से कम के लिए मिलाते हुए
    नोट: मेथनॉल के विस्तारित जोखिम ने बीए-गैल गतिविधि को नष्ट कर दिया।
  13. मेथनॉल को निकालें और पीवीटी समाधान के 1 एमएल के साथ 3 बार भ्रूण भंग भ्रूण को कुल्ला।

4. एलएसीजेड स्नेनिंग का प्रयोग करने वाले भ्रूण को जीनोटाइपिंग (2 दिन)

  1. ट्यूब में पीबीटी समाधान के 1 एमएल जोड़ें और ट्यूब को 37 डिग्री सेल्सियस गर्मी ब्लॉक या 15 मिनट के लिए पानी के स्नान में सेते हैं।
  2. ऊष्मायन के दौरान, X-Gal धुंधला हो जाना समाधान (1 एमएल प्रति टीयूहो) 65 डिग्री सेल्सियस पर पानी के स्नान में जब तक बादल न हो जाए। इसे 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में सेते हैं।
  3. पीबीटी समाधान की आकांक्षा और ट्यूब में X-Gal धुंधला हो जाना समाधान के 1 एमएल और X-Gal सब्सट्रेट के 20 μL जोड़ें।
  4. निषेध तक 37 डिग्री सेल्सियस पर ट्यूब को सेते हैं, जब तक कि एक नीली गति नहीं होती है।
    नोट: 2 से 4 घंटे के सामान्य श्रेणी में 2 एन डी और 3 डी नीले रंग के बैलेंसर्स के लिए ऊष्मायन समय
  5. एक्स-गैल धुंधला हो जाना निकालें और भ्रूण को 3 बार आरटी पीबीटी समाधान के 1 एमएल के साथ कुल्ला।
  6. सुई जांच या संदंश का प्रयोग करना, प्रकाश विदारक माइक्रोस्कोप (1.6X-2.5X उद्देश्यों) के साथ वांछित जीनोटाइप ( यानी, गैर-सना हुआ सफेद भ्रूण) के भ्रूण को हाथ से सॉर्ट करना।
    नोट: चूंकि कुछ ब्लू बैलेंसर, जैसे कि साइओ, एक्टिन-एलएसीजेड और टीएम 3, एक्टिन-एलएसीजेड, एक्टिन प्रमोटर के नियंत्रण में बैक्टीरियल β-Gal (एलएसीजेड) को व्यक्त करने वाला एक ट्रांसजेनिक कन्स्ट्रक्शन लेते हैं, भ्रूण को एक सर्वव्यापी तरीके से सना हुआ नीलानीले बैलेंसर गुणसूत्रों की एक या दो प्रतियां इसलिए, वांछित घातक एलील के लिए गैर-सना हुआ सफेद भ्रूण समरूप हैं।

5. एंटी-फस्किकलिन II एंटीबॉडी के साथ भ्रूण का प्रतिरक्षण (2-3 दिन)

  1. वांछित जीनोटाइप ( यानी गैर-सना हुआ सफेद भ्रूण) के भ्रूण को 1 एमएल विंदुक टिप का उपयोग करके 0.5 एमएल माइक्रोट्यूब में ले लीजिए और स्थानांतरित करें।
    नोट: इस चरण में, भ्रूण को मोटे तौर पर आकृति विज्ञान के मानदंडों के अनुसार रखा जा सकता है, जिसमें छल्ली के विभाजन पैटर्न और सिर और पूंछ 9 की संरचनाएं शामिल हैं। अंडे के बाद 10 से 16 घंटे के बीच सिर में शामिल होने के दौरान, भ्रूण सबसे पूर्वकाल सेगमेंट 9 की स्पष्ट कमी से गुजरता है।
  2. एक बार भ्रूण को पीबीटी समाधान के 0.4 एमएल के साथ धो लें और 0.3 एमएल अवरुद्ध समाधान (5% सामान्य बकरी सीरम और पीबीटी समाधान में 5% डीएमएसओ) जोड़ें।
  3. आरटी पर 15 मिनट के लिए भ्रूण के साथ भ्रूण को ब्लॉक करें।
  4. कम से कम 20 मिनट प्रति धोने के लिए पीबीटी समाधान के 0.4 एमएल के साथ भ्रूण को 4 बार धो लें।
  5. 0.3 एमएल अवरुद्ध समाधान (पीबीटी समाधान में 5% सामान्य बकरी सीरम) बकरी एंटी-माउस-एचआरपी एंटीबॉडी युक्त (2 माइक्रोग्राम / एमएल) जोड़ें और रात भर में आरटी पर न्युटेशन के साथ ट्यूब सेते।
  6. कम से कम 20 मिनट प्रति धोने के लिए पीबीटी समाधान के 0.4 एमएल के साथ भ्रूण को 6 बार धो लें।
  7. ट्यूब में 0.3 एमएल डीएबी समाधान जोड़ें।
    सावधानी: दस्ताने पहनें और ब्लीच में सभी डीएबी कचरे / ट्यूब / टिप्स रखें।
  8. 3% हाइड्रोजन पेरोक्साइड के 2 μL जोड़ें और आरटी पर न्युटेशन के साथ अंधेरे में ट्यूब सेते रहें जब तक वांछित मात्रा में द्रव का उत्पादन नहीं किया जाता है।
    नोट: सामान्य में 1 डी 4 इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री के लिए ऊष्मायन समय 0.5-1 एच से होता है
  9. पीबीटी समाधान के 0.4 एमएल के साथ भ्रूण को 4 बार धोएं।
    सावधानी: डीएबी समाधान निकालें और विंदुक और डी के साथ पहले दो धोनाउन्हें ब्लीच में डालें
  10. आरटी या 4 डिग्री सेल्सियस पर ट्यूब में 70% ग्लिसरॉल / पीबीएस समाधान बढ़ते हुए 0.2 एमएल जोड़ें।
    नोट: ट्यूब को प्रकाश से दूर रखें। भ्रूण को 90% ग्लिसरॉल / पीबीएस समाधान 10 में रखकर स्पष्ट तैयारियां प्राप्त की जा सकती हैं। हालांकि, 90% ग्लिसरॉल / पीबीएस समाधान में 70% ग्लिसरॉल / पीबीएस समाधान 10 में साफ किए गए भ्रूण को साफ करने के लिए भ्रूण निकालना अधिक कठिन है।

6. भ्रमण, विच्छेदन, बढ़ते, और भ्रूण इमेजिंग (4 दिन)

  1. स्टेजिंग के लिए, एक ग्लास स्लाइड पर 70% ग्लिसरॉल / पीबीएस के साथ समेकित भ्रूणों को स्थानांतरित करें।
  2. देर के चरण -16 भ्रूण को ले लीजिए जिनके पेट का सेगमेंट 7 (ए 7), ए 8, और ए 9 आईएसएन नसों को एक-दूसरे को छूने के लिए सम्मिलित किया जाता है / या उनमें मध्य-बंधन है जो तीन बैंडों में विभाजित है।
    नोट: आईएसएन और आईएसएनबी मोटर एक्सॉन के प्रक्षेपण पैटर्न के आधार पर 1 डी 4 एंटीबॉडी के साथ दाग की गई भ्रूण का मंचन किया जा सकता है। सीएनएस, ए 7, ए 8 और ए 9 आईएसएन ने बाहर निकलने के बाददेर से चरण -16 भ्रूण के उत्थान एक-दूसरे को स्पर्श करने के लिए एक साथ होते हैं और बाद में पृष्ठीय मांसपेशियों ( चित्रा 1 ए में तीक्ष्ण) तक पहुंचने के लिए अलग-थलग होते हैं। मध्य चरण -16 भ्रूण में, हालांकि, ए 7 आईएसएन तंत्रिका ए 8 / ए 9 नसों ( चित्रा 1 बी में चौकोर ब्रैकेट) के समानांतर में फैली हुई है। इसके अलावा, ए 6 आईएसएनबी नसों (दोनों के ऊतक-संदंश की मांसपेशियों के लिए लंबवत) के प्रक्षेपण कुल्हाड़ी सीएनएस अनुदैर्ध्य धुंचना फॉम्पिकल्स (तीर और चित्रा 1 सी में एक पंक्ति) के पीछे के अंत के साथ लगभग गठबंधन हैं। ये आकारिकी मानदंड कुछ अलग-अलग जीनोटाइप के बीच अलग-अलग होते हैं। वैकल्पिक रूप से, पेट के आकारिकी 9 , 11 के आधार पर भ्रूण का मंचन किया जा सकता है। स्टेज 17 से पहले, मिडगुत के पास दिल की तरह आकार है, जबकि मध्ययुग को चरण 17 12 द्वारा तीन बैंड में विभाजित किया गया है।
  3. भ्रूण काटना
    1. 1 मीटर का उपयोग करनाएल सिरिंज, प्रत्येक भ्रूण को ग्लिसरॉल ड्रॉप से ​​बाहर निकालना और भ्रूण ऊतक-चेहरे को ऊपर रखें। शरीर की लम्बाई के 1/4 हिस्से पर अग्रवर्ती भाग को काट लें और सबसे अधिक पीछे वाला क्षेत्र जो मोटर एक्सॉन से मुक्त है
    2. सुई जांच का प्रयोग करके ग्लिसरॉल ड्रॉप के अंत-कट भ्रूण को स्थानांतरित करें, इसे पृष्ठीय ओर ऊपर की तरफ खींचें और क्षेत्र में क्षैतिज रूप से रखें।
      नोट: जब भ्रूण को ग्लिसरॉल ड्रॉप से ​​बाहर निकाल दिया जाता है, तो भ्रूण के साथ जुड़े ग्लिसरॉल का थोड़ा सा चिपचिपा बनाता है।
    3. एक बहुत ही ठीक टंगस्टन सुई 13 का उपयोग करके पृष्ठीय मिडलाइन के साथ भ्रूण को काटो। भ्रूण के पीछे के अंत में एक छोटी सी कटौती करें और फिर पूर्वकाल की ओर पृष्ठीय मिडलाइन को कम करना जारी रखें; विपरीत दिशा में काटने भी ठीक है।
    4. सुई जांच का उपयोग करते हुए, मिलिलाइन-कट भ्रूण को ग्लिसरॉल ड्रॉप में ले जाएं, पृष्ठीय पक्ष को ऊपर रखें, और शरीर की दीवार से पेट को अलग करें जिससे कि प्रत्येक शरीर की दीवार को एक वायुमंडलीय (विकर्ण) दिशा में प्रकट कर दें (2.5 एक्स उद्देश्य)
      नोट: सुनिश्चित करें कि पृष्ठीय midline पूरी तरह से कट जाता है, जिसके परिणामस्वरूप बाएं और दाएं शरीर की दीवारों के बीच पूर्ण विखंडन हो सकता है।
    5. ध्यान से ग्लिसेरोल ड्रॉप से ​​मिडीलाइन कट भ्रूण को स्थानांतरित करें और फिर ठीक सुई जांच (2.5 एक्स उद्देश्य) का उपयोग करके ग्लास स्लाइड पर शरीर की दीवार के नीचे दो फ्लैप लगाएं।
    6. एक बहुत ही ठीक टंगस्टन सुई का उपयोग करके, विच्छेदित भ्रूण से आंतरिक अंगों को बाद में (5X उद्देश्य) धकेलने से हटा दें।
      नोट: वेबसाइट पर 5 और इसी प्रकार की विच्छेदन प्रक्रिया का अधिक विस्तृत विवरण पाया जा सकता है।
  4. बढ़ते जाने के लिए, साफ, विच्छेदित भ्रूण के 2-3% μL का 70% ग्लिसरॉल / पीबीएस समाधान जोड़ें, और एक सुई सुई जांच का उपयोग करके उन्हें एक नया ग्लास स्लाइड पर स्थानांतरित करें, जिसमें 70% ग्लिसरॉल / पीबीएस समाधान का 8 μL फैल गया है केंद्र (2.5 एक्स उद्देश्य)
  5. कवरलाप (18 मिमी x 18 मिमी) रखो। नियमित नाखून पॉलिश के साथ कवर्सलिप के किनारों को सील करें (या तोस्पष्ट या रंगीन ठीक है)।
  6. निर्माता के निर्देशों के मुताबिक विभेदकारी हस्तक्षेप विपरीत (डीआईसी) प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत उच्च संकल्प (20 एक्स, 40 एक्स, और 63 एक्स तेल-विसर्जन उद्देश्यों) पर छवियों को कैप्चर करें।
    नोट: विशेष रूप से आईएसएनबी मोटर एक्सॉनों के लिए बेहतर दृश्य और फ़िनोटीपिक लक्षण वर्णन, एक 63x तेल-विसर्जन उद्देश्य का उपयोग करके उत्पादित किया जा सकता है।

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Representative Results

तंत्रिका विकास के दौरान मोटर एक्सॉन और लक्ष्य की मांसपेशियों के बीच सटीक कनेक्शन विशिष्ट पसंद अंक पर चयनात्मक अक्षतंतु-अक्षतंतु के प्रतिकर्षण और लक्ष्य मान्यता पर निर्भर करते हैं। ड्रोसोफिला में , मोटर एक्सॉन के बीच चयनात्मक प्रतिकर्षण को भाग 1 और 2 सेमाफोरिन (सेमस) की संयुक्त कार्रवाई द्वारा नियंत्रित किया जाता है, जिसमें सेमा -1 ए, सेमा -2 ए और सेमा -2 बी 8 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 शामिल हैं। । इसलिए, सेमा -1 ए फ़ंक्शन का नुकसान अक्सर आईएसएनबी एक्सॉन की विफलता में विशिष्ट विकल्प बिंदुओं पर डिफैक्चुलेट करने का कारण बनता है, जिससे उन्हें असामान्य रूप से मोटी आकारिकी ( चित्रा 2 सी में तीक्ष्म) प्रदर्शित करने के कारण हो जाता है। Wildtype भ्रूण में, कम से कम 7 मोटर न्यूरॉन्स एक एक्स बनाने के लिए अपने एक्सॉन को फैलाव देते हैंएसएनबी तंत्रिका शाखा ( चित्रा 2 ए )। जब आईएसएनबी तंत्रिका शाखा एक विकल्प बिंदु तक पहुंचती है, जो मांसपेशियों 6 और 7 के बीच स्थित होती है, तो दो एसिंस मुख्य आईएसएनबी बंडल से चुनिंदा डिफैक्चुलेट और बाद में मांसपेशियों 6 और 7 ( चित्रा 2 बी ) को आवेशित करता है। अगले विकल्प बिंदु पर, जो कि मांसपेशियों 6, 13 और 30 के बीच स्थित है, एक और तीन मोटर ऐगंस चुनिंदा 13, 14, और 30 ( चित्रा 2 बी ) की मांसपेशियों को आवेशित करने के लिए डिफैक्चुलेट। शेष दो ऐशंस 12 मांसपेशियों के किनारे के निकट अंतिम पसंद बिंदु तक पहुंचने के लिए दांतों को बढ़ाते हैं, जिससे विपरीत दिशा में 12 चित्रा ( चित्रा 2 बी ) का इलाज किया जा सकता है। ये परिणाम स्पष्ट रूप से दिखाते हैं कि फ़्रेलाटेड तैयारी प्रोटोकॉल मोटर एफ़ॉन मार्गदर्शन के लिए आवश्यक जीन का अध्ययन करने के लिए एक उपयोगी उपकरण प्रदान करता है।

आकृति 1
ए ) देर से चरण -16 में जंगली फीरोज़ा भ्रूण, ए 7, ए 8, और ए 9 आईएसएन नसों (तीर) एक-दूसरे को छूने के लिए इकट्ठा होते हैं (एरोहेड)। पूर्वकाल छोड़ दिया गया है और उदर नीचे है स्केल बार = 15 माइक्रोन ( बी ) मध्य-चरण -16 जंगली प्रकार के भ्रूण में, ए 7 आईएसएन तंत्रिका ए 8 / ए 9 नसों (चौकोर ब्रैकेट) के साथ समानांतर में फैली हुई है। तीर ए 7, ए 8, और ए 9 आईएसएन तंत्रिकाओं से संकेत मिलता है। पूर्वकाल छोड़ दिया गया है और उदर नीचे है स्केल बार = 15 माइक्रोन ( सी ) फासीआई एंटीबॉडी के साथ दाग वाले स्टेज -16 जंगली भ्रूण के चित्रित तैयारी बाएं और दायें A6 आईएसएनबी नसों के प्रक्षेपण कुल्हाड़ियों (तीर) लगभग सीएनएस अनुदैर्ध्य axon fascicles (काला रेखा) के पीछे के अंत के साथ गठबंधन कर रहे हैं। उदर खंड A1-A7 शीर्ष पर लेबल किए जाते हैं। पूर्वकाल छोड़ दिया है स्केल बार = 15 माइक्रोन दलीलसे इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें

चित्र 2
चित्रा 2: जंगली प्रकार और सेमा -1 ए उत्परिवृत्त भ्रूण में मोटर एक्सॉन प्रक्षेपण पैटर्न। ( ए - सी ) फासीआई एंटीबॉडी के साथ दाग़ के देर से चरण -16 भ्रूण की तैनाती तैयारी पूर्वकाल छोड़ दिया गया है और उदर नीचे है प्रत्येक पैनल में दिखाए गए अक्षीय प्रक्षेपण पैटर्न दिखाए गए योजनाबद्ध आरेख स्केल बार = 15 माइक्रोन ( ए ) wildtype भ्रूण में, दो अनुक्रमिक पेट की गोलियां, ए 3 और ए 4 का उज्ज्वल मैदान तस्वीर। तीन द्विपक्षीय सममित अनुदैर्ध्य अक्षतंतु बंडलों सीएनएस में मौजूद हैं। आईएसएनबी, एसएनए, आईएसएन, और टीएन मोटर एक्सॉन के सामान्य इन्फॉर्मेशन पैटर्न को परिधि में बक्से और एक तीर से दर्शाया गया है। पार्श्व द्विध्रुवी डेंड्राइट न्यूरॉन (एलबीडी), जो एलारी की मांसपेशियों को दिमाग देते हैं, यह इंगित करता हैएरोहेड द्वारा एड योजनाबद्ध आरेख में, आईएसएनबी (भूरे रंग में), एसएनए (नीला में), आईएसएन (हरे रंग में), और टीएन (पीले) मोटर न्यूरॉन्स और उनके लक्ष्य की मांसपेशियों के तंत्रिका शाखाएं और सुरंगों के पैटर्न प्रस्तुत किए जाते हैं। सीएनएस में इन मोटर न्यूरॉन्स के सेल बॉडी पोजीशन भी अपने रंगों में दिखाए जाते हैं। ( बी ) wildtype भ्रूणों में, आईएसएनबी एक्सॉन प्लैंटेट्रेट्रेटल मांसपेशियों को प्रोजेक्ट करता है, जिन्हें गिने जाते हैं, और उन्हें विशिष्ट पसंद बिंदुओं (डीआईसी छवि में तीर) में रखा जाता है। ( सी ) सेमा -1 ए हानि समारोह के म्यूटेंट में, आईएसएनबी एक्सॉन अक्सर डीसीआई की छवि में 6 और 13 की मांसपेशियों के बीच एक दूसरे से डिफेस्कीक करने में विफल रहता है। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

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Discussion

मोटर एक्सॉन मार्गदर्शन दोषों का ब्योरा तेजी से और दाब-दागयुक्त भ्रूण की तैयार की गई तैयारी से बेहतर सटीकता के साथ लेजर स्कैनिंग की तुलना में फ्लोरोसेंटली लेबल वाले लोगों की कन्फोकल माइक्रोस्कोपी की तुलना में होता है। इसलिए, फिक्स्ड और 1 डी 4-स्टेन्ड भ्रूण की तैयार की गई तैयारी मार्गदर्शन क्यू अणुओं के कार्यात्मक लक्षण वर्णन के लिए सबसे उपयुक्त है। नेडियंस, स्लिट्स, सैकफोरिन (सेमस), एफ्रेंस और उनके संगीन रिसेप्टर्स सहित मार्गदर्शन संकेतों के चार प्रमुख वर्गों ने विकास, कृमि, मक्खी, और रीढ़ 20 के बीच भूमिकाओं को संरक्षित किया है। राउंडबाउट (रोबो) परिवार के अणुओं में जो स्लिट्स के रिसेप्टर्स के रूप में कार्य करते हैं, ड्रोसोफिला रोबो को पहले सीएनएस 6 , 21 में प्रतिकारक मार्गदर्शन समारोह में मध्यस्थता करने के लिए पहचाना गया था। सेमा मार्गदर्शन के अणुओं का एक बड़ा परिवार है जो पि्लेक्सिन युक्त रिसेप्टर कॉम्प्लेक्स 22 से जुड़ा है। सेम के अक्षतंतु के मार्गदर्शन कार्यपहली बार टिड्डी सीएनएस 14 में खोजी गई थी इसके बाद, क्लास 1 ट्रांसमैमब्रन सेफफोरिन सेमा -1 ए को बड़े पैमाने पर ड्रोसोफिला में देखा गया था। सेमा -1 ए, जो कि न केवल पीलेक्सिन ए के लिगेंड के रूप में कार्य करता है, बल्कि एक अज्ञात लिगेंड के लिए एक रिसेप्टर के रूप में भी कार्य करता है , भ्रूण तंत्रिकाय विकास 15 , 16 , 17 , 18 के दौरान विशिष्ट पसंद बिंदुओं पर अक्षतंतु-अक्षतंतु के प्रतिकर्षण में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है चित्रा 2 सी )

वर्तमान प्रोटोकॉल के साथ कुछ सामान्य समस्या निवारण चरण हो सकते हैं। सबसे पहले, चरण 3. 9 -3.13 में, भ्रूण को कम दक्षता के साथ विचलित किया जा सकता है यदि मेथनॉल डिवेटेलिनिज़ेशन प्रक्रिया में कई या बहुत-छोटे भ्रूण का उपयोग किया जाता है। इस मामले में, चरण 3.5 में डिवेटेलिनाइजेशन के लिए निश्चित भ्रूण के 40-80 μL की एक बिस्तर मात्रा का उपयोग करने की सिफारिश की गई है। दूसरा, स्टी मेंपीएस 3.9-3.13, मेथानॉल या अपूर्ण हेपटेन हटाने के लंबे एक्सपोजर के मामले में कमजोर एक्स-गैल धुंधला हो सकता है, चूंकि मेथनॉल का प्रयोग एक स्थिरीकरण के रूप में किया जाता है β-Gal गतिविधि को नष्ट कर देता है इस मामले में, यह सबसे अच्छा है कि चरण 3. 9 -3.13 में मेथनॉल का उपयोग कर devitellinization प्रक्रिया जितनी जल्दी संभव हो जाती है। इसके अलावा, शेष हेप्टेन मेथनॉल में घुलनशील होकर धुंधला हो सकता है; इसलिए, 3.11-3.13 के चरण में जितना संभव हो उतना मेथनॉल हटाने के लिए सबसे अच्छा है।

मोटर अक्षतंतु पथपथन और लक्ष्य मान्यता में शामिल उपन्यास जीनों की पहचान करने के लिए मौजूदा फाईलटेड तैयारी प्रोटोकॉल को हानि समारोह और लाभ-आनुवंशिक स्क्रीन पर लागू किया जा सकता है। हालांकि, इस प्रोटोकॉल का एक नुकसान यह है कि फिलाइड तैयारी तैयार करने के लिए निश्चित भ्रूण काटना करने में काफी समय लगता है। इस समस्या से मुकाबला करने के लिए, axonal अनुमानों के phenotypic लक्षण वर्णन की निगरानी में किया जा सकता है 1d4-stained embहालांकि, इस विधि परिधि में अक्षीय अनुमानों के कम-रिज़ॉल्यूशन विज़ुअलाइज़ेशन प्रदान करती है। फिर भी, पूरे माउंट तैयारी प्रोटोकॉल ने एंजोन मार्गदर्शन जीन स्क्रीनिंग के लिए एक कुशल दृष्टिकोण साबित कर दिया है। फ्लोरोसेंटली लेबल वाले भ्रूण के लाइव विच्छेदन का उपयोग करते हुए एक वैकल्पिक प्रोटोकॉल हाल ही में व्यवस्थित स्क्रीनिंग 11 के लिए विकसित किया गया था। लाइव विच्छेदन प्रोटोकॉल फेनोटाइपिक विश्लेषण के लिए अपेक्षाकृत तेजी से तैयारी के लिए अनुमति देता है 11 हालांकि, इस प्रोटोकॉल चरण 17 11 की शुरुआत से पुराने भ्रूण के लिए पर्याप्त नहीं है

वर्णित तैयारी प्रोटोकॉल का वर्णन यहां विभिन्न एंटीबॉडी के साथ प्रोटीन अभिव्यक्ति पैटर्न की जांच करने के लिए किया जा सकता है। इसके अलावा, विकास के विभिन्न चरणों में ड्रोसोफिला भ्रूण पर भी यह प्रोटोकॉल लागू किया जा सकता है।

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Disclosures

लेखक घोषित करता है कि उनके पास कोई प्रतियोगी वित्तीय हित नहीं है

Acknowledgments

मैं एलेक्स एल। कोलोडकीन का शुक्रिया अदा करता हूं, जैसा कि मैंने अपनी प्रयोगशाला में यह चित्रित तैयारी प्रोटोकॉल सीखा है। तकनीकी सहायता के लिए मैं यंग जी हाँग का भी धन्यवाद करता हूं। यह अध्ययन एनआरएफ-2013 आर 1 ए 1 ए 4 ए 101011329 (एसजे) द्वारा समर्थित था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A7906
Triton X-100 Sigma-Aldrich X100 t-Octylphenoxypolyethoxyethanol
16% Paraformaldehyde Solution Ted Pella 18505
Sodium Chloride Sigma-Aldrich S5886
Potassium Chloride Sigma-Aldrich P5405
Sodium Phosphate Dibasic Sigma-Aldrich 30435
Sodium Phosphate Monobasic Sigma-Aldrich 71500
X-Gal Substrate US Biological X1000 X-Gal (5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-b-D-galactoside galactopyranoside)
Dimethyl Sulfxide Sigma-Aldrich D4540
Magnesium Chloride Sigma-Aldrich M8266
Potassium hexacyanoferrate(II) trihydrate Sigma-Aldrich P9387
Potassium hexacyanoferrate(III) Sigma-Aldrich 244023
Hydrogen Peroxide Sigma-Aldrich 216763
3,3'-diaminobenzidine Tetrahydrochloride Sigma-Aldrich D5905
Agar US Biological A0930
Sucrose Fisher Scientific S5-3
Tegosept (Methy 4-Hydroxybenzoate) Sigma-Aldrich H5501
Culture Dish (60 mm) Corning 430166
Tricon Beaker Simport B700-100 This is used to make a plastic beaker cage for embryo collection.
Yeast Societe Industrielle Lesaffre Saf Instant Yeast Red
Cotton Swab (Wooden Single Tip Cotton PK100) VWR 14220-263
Eppendorf Tube (1.5 ml) Sarstedt #72.690
Bleach The Clorox Company Clorox
Heptane Sigma-Aldrich 246654
Methanol J.T. Baker UN1230
Normal Goat Serum Life Technologies 16210-064
Anti-FasciculinII Antibody Developmental Studies Hybridoma Bank 1D4 anti-Fasciclin II
Goat Anti-mouse-HRP Antibody Jackson Immunoresearch 115-006-068 AffiniPure F(ab')2 Fragment Goat Anti-Mouse IgG+IgM (H+L)
(min X Hu, Bov, Hrs Sr Prot
Glycerol Sigma-Aldrich G9012
Slide Glass Duran Group 235501403
Coverslip Duran Group 235503104 18 x 18 mm
1 ml Syringe Becton Dickinson Medical(s) 301321
Tungsten Needle Ted Pella #27-11 Tungsten Wire, ø0.13mm/6.1m (ø.005"/20 ft.)
Nutator (Mini twister) Korean Science KO.VS-96TWS Alternatively, BD Clay Adams Brand Nutator (BD 421125)

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References

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न्यूरोसाइंस अंक 124 मोटर न्यूरॉन एक्सॉन गाइडेंस ड्रोसोफिला इम्युनोस्टेनेनिंग एम्ब्रोनिक डेवलपमेंट फासिसिलिन द्वितीय
भ्रूण मोटर न्यूरॉन्स के एक्सोनल प्रोजेक्शन पैटर्न का विज़ुअलाइज़ेशन<em&gt; ड्रोसोफिला</em
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Jeong, S. Visualization of the Axonal Projection Pattern of Embryonic Motor Neurons in Drosophila. J. Vis. Exp. (124), e55830, doi:10.3791/55830 (2017).

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