Dette arbeidet beskriver en standard immunhistokjemi metode for å visualisere motor neuron projeksjoner av sent stadium-16 Drosophila melanogaster embryoer. Det fileterte preparatet av faste embryoer farget med FasII antistoff gir et kraftig verktøy for å karakterisere de gener som kreves for motorisk aksonopplæring og målgjenkjenning under nevrale utvikling.
Etableringen av funksjonelle nevromuskulære kretser er avhengig av nøyaktige forbindelser mellom utviklende motoraxoner og målmuskler. Motorneuroner forlenker vekstkegler for å navigere langs bestemte veier ved å svare på et stort antall aksonveiledningsanvisninger som stammer fra det omgivende ekstracellulære miljøet. Vektkegle-målgjenkjenning spiller også en kritisk rolle i nevromuskulær spesifisitet. Dette arbeidet presenterer en standard immunhistokjemi protokoll for å visualisere motor neuron projeksjoner av sent stadium-16 Drosophila melanogaster embryoer. Denne protokollen inneholder noen få viktige trinn, inkludert en genotyping-prosedyre, for å sortere de ønskede mutantembryonene; En immunfremmende prosedyre for å merke embryoer med fasciclin II (FasII) antistoff; Og en disseksjonsprosedyre for å generere fileterte preparater fra faste embryoer. Motoraxonprojeksjoner og muskelmønstre i periferien er mye bedre visualisert i flate preparater av fileterte embryoer enn i whOle-mount embryoer. Derfor fyller det fileterte preparatet av faste embryoer som er farget med FasII-antistoff et kraftig verktøy for å karakterisere de gener som kreves for motorisk aksonoppfylling og målgjenkjenning, og det kan også brukes på både funksjonstabell og genetisk skjermforsterkning .
Nøyaktige og selektive forbindelser mellom motorakser og målmuskler under embryonisk utvikling er avgjørende for normal fremdrift i Drosophila larver. Den embryonale mønsteret på 30 muskelfibre i hver av bukhemisegmentene A2-A7 er etablert ved trinn 16 1 . De 36 motorneuronene som genereres i den ventrale nerve ledningen, strekker deres axoner i periferien til å innervate bestemte målmuskler 2 . Motoraksonbanevinding og målgjenkjenning kan visualiseres ved immunhistokjemi med et antistoff (musmonoklonalt antistoff 1D4) 3 , 4 . Flere bilder av motoraxonprojeksjonsmønstrene i wildtype-embryoer er tilgjengelige på nettet 5 . 1D4-antistoffet merker alle motoraxoner og tre langsgående aksonfasikaler på hver side av midterlinjen av det sentrale nervesystemet (CNS) 4 </sOpp> , 6 ( figur 1C og figur 2A ). Derfor gir immunhistokjemi med FasII antistoff et kraftig verktøy for å identifisere gener som kreves for nevromuskulær tilkobling for å demonstrere molekylære mekanismer som ligger bak motorisk aksonveiledning og målgjenkjenning.
I hver av de abdominale hemisegmentene A2-A7, motoriske aksonsprosjektet og selektivt fasciculerer i to hovednerven, er segmentnerven (SN) og den intersegmentelle nerven (ISN) 2 , 4 og en mindre nervegren, den transversale nerveen (TN ) 7 . SN-selektivt defasciculates for å gi opphav til to nervegrener kalt SNa og SNc, mens ISN deler seg i tre nervegrener kalt ISN, ISNb og ISNd 2 , 4 . Blant dem, ISN, ISNb og SNa motor axonProjeksjonsmønstre blir mest nøyaktig visualisert når sent stadium 16 embryoer farves med FasII antistoff og er filetert ( figur 1C og figur 2A ). ISN-motorneuronene forlenker deres aksoner til indre dorsale muskler 1, 2, 3, 4, 9, 10, 11, 18, 19 og 20 2 , 4 ( figur 2A ). ISNb-motorneuronene innerverer ventrolaterale muskler 6, 7, 12, 13, 14, 28 og 30 2 , 4 ( figur 2A og 2B). SNa-nervegrenen prosjekterer å innervate laterale muskler 5, 8, 21, 22, 23 og 24 2 , 4 ( figur 2A ). TN, som består av to motoraxoner, prosjekterer ipsilateralt langs segmentgrensen til innervate muskel 25 og gjør synapser med den laterale bipolære dendritiske nevronen (LBD) iPeriferien 7 ( figur 2A ). Disse målmuskulaturinnervasjonene krever ikke bare selektiv defaskulering av motoraxoner på bestemte valgpunkter, men også målrettet mot muskelgjenkjenning. I tillegg er det funnet noen formodede mesodermale guidepostceller som fungerer som mellommål i både ISN og SNa-veiene, men ikke langs ISNb-vei 4 . Dette kan tyde på at ISNb-motorisk aksonopplæring kan reguleres på en tydelig måte i forhold til ISN- og SNa-motor-aksonveiledning, og det indikerer også at perifer motorisk axon-veiledning gir en attraktiv eksperimentell modell for å studere differensialet eller konserverte roller i en enkelt veilednings-cue Molekyl 8 .
Dette arbeidet presenterer en standard metode for å visualisere de aksonale projeksjonsmønstrene av embryonale motorneuroner i Drosophila . De beskrevne protokollene inkluderer hvordan man dissekerer faste fostre farget med 1D4 aNtibody og behandlet i 3,3'-diaminobenzidin (DAB) for fileterte preparater. En kritisk fordel ved de flate preparatene av faste embryoer er den bedre visualiseringen av de aksonale fremspringene og muskelmønstrene i periferien. Videre viser dette arbeidet også hvordan man genotype faste embryoer for å sortere de ønskede mutantembryonene ved hjelp av LacZ-farvemetoden.
Detaljer om motorisk aksonstyringsfeil blir scoret raskere og med bedre nøyaktighet ved den fileterte fremstilling av DAB-farget embryoer enn ved laserskanning av konfokal mikroskopi av fluorescensmerkede. Derfor er det fileterte preparatet av faste og 1D4-fargede embryoer best egnet for funksjonell karakterisering av veiledningsøkemolekyler. Fire hovedklasser av veiledningsanvisninger, inkludert netrins, Slits, semaforiner (Semas) og ephrins, og deres kognitive reseptorer har evolusjonært bevart roller over ormer, f…
The authors have nothing to disclose.
Jeg takker Alex L. Kolodkin, da jeg lærte denne fileterte forberedelsesprotokollen i sitt laboratorium. Jeg takker også Young Gi Hong for teknisk assistanse. Denne studien ble støttet av NRF-2013R1A1A4A01011329 (SJ).
Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | t-Octylphenoxypolyethoxyethanol |
16% Paraformaldehyde Solution | Ted Pella | 18505 | |
Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S5886 | |
Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P5405 | |
Sodium Phosphate Dibasic | Sigma-Aldrich | 30435 | |
Sodium Phosphate Monobasic | Sigma-Aldrich | 71500 | |
X-Gal Substrate | US Biological | X1000 | X-Gal (5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-b-D-galactoside galactopyranoside) |
Dimethyl Sulfxide | Sigma-Aldrich | D4540 | |
Magnesium Chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
Potassium hexacyanoferrate(II) trihydrate | Sigma-Aldrich | P9387 | |
Potassium hexacyanoferrate(III) | Sigma-Aldrich | 244023 | |
Hydrogen Peroxide | Sigma-Aldrich | 216763 | |
3,3'-diaminobenzidine Tetrahydrochloride | Sigma-Aldrich | D5905 | |
Agar | US Biological | A0930 | |
Sucrose | Fisher Scientific | S5-3 | |
Tegosept (Methy 4-Hydroxybenzoate) | Sigma-Aldrich | H5501 | |
Culture Dish (60 mm) | Corning | 430166 | |
Tricon Beaker | Simport | B700-100 | This is used to make a plastic beaker cage for embryo collection. |
Yeast | Societe Industrielle Lesaffre | Saf Instant Yeast Red | |
Cotton Swab (Wooden Single Tip Cotton PK100) | VWR | 14220-263 | |
Eppendorf Tube (1.5 ml) | Sarstedt | #72.690 | |
Bleach | The Clorox Company | Clorox | |
Heptane | Sigma-Aldrich | 246654 | |
Methanol | J.T. Baker | UN1230 | |
Normal Goat Serum | Life Technologies | 16210-064 | |
Anti-FasciculinII Antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | 1D4 anti-Fasciclin II | |
Goat Anti-mouse-HRP Antibody | Jackson Immunoresearch | 115-006-068 | AffiniPure F(ab')2 Fragment Goat Anti-Mouse IgG+IgM (H+L) (min X Hu, Bov, Hrs Sr Prot |
Glycerol | Sigma-Aldrich | G9012 | |
Slide Glass | Duran Group | 235501403 | |
Coverslip | Duran Group | 235503104 | 18 x 18 mm |
1 ml Syringe | Becton Dickinson Medical(s) | 301321 | |
Tungsten Needle | Ted Pella | #27-11 | Tungsten Wire, ø0.13mm/6.1m (ø.005"/20 ft.) |
Nutator (Mini twister) | Korean Science | KO.VS-96TWS | Alternatively, BD Clay Adams Brand Nutator (BD 421125) |