Summary
Wir beschreiben die Chromatin-endogene Spaltung, gekoppelt mit der Hochdurchsatz-Sequenzierung (ChEC-seq), einer Chromatin-Immunopräzipitation (ChIP) -orthogonalen Methode zur Kartierung von Proteinbindungsstellen genomweit mit Mikrokokken-Nuklease (MNase) -Fusionsproteinen.
Abstract
Genom-weite Abbildung von Protein-DNA-Wechselwirkungen ist entscheidend für das Verständnis der Genregulation, des Chromatin-Remodelings und anderer Chromatin-residenten Prozesse. Die Formaldehydvernetzung, gefolgt von Chromatin-Immunpräzipitation und Hochdurchsatz-Sequenzierung (X-ChIP-Seq), wurde verwendet, um viele wertvolle Einblicke in die Genombiologie zu gewinnen. Allerdings hat X-ChIP-seq bemerkenswerte Einschränkungen im Zusammenhang mit Vernetzung und Beschallung. Native ChIP vermeidet diese Nachteile durch Weglassen der Vernetzung, führt aber oft zu einer schlechten Wiederherstellung von chromatingebundenen Proteinen. Darüber hinaus unterliegen alle ChIP-basierten Methoden Antikörperqualitätsüberlegungen. Enzymatische Methoden zur Abbildung von Protein-DNA-Wechselwirkungen, die die Fusion eines Proteins von Interesse für ein DNA-modifizierendes Enzym beinhalten, wurden ebenfalls verwendet, um Protein-DNA-Wechselwirkungen zuzuordnen. Wir haben vor kurzem eine solche Methode kombiniert, Chromatin endogene Spaltung (ChEC), mit High-Throughput-Sequenzierung als ChEC-seq. ChEC-seq beruht auf der Verschmelzung eines Chromatin-Assors(MNase), um eine zielgerichtete DNA-Spaltung in Gegenwart von Calcium in lebenden Zellen zu erzeugen. ChEC-seq basiert nicht auf Immunpräzipitation und umgibt damit potenzielle Bedenken bei der Vernetzung, Beschallung, Chromatin-Solubilisierung und Antikörperqualität bei gleichzeitiger hochauflösender Zuordnung mit minimalem Hintergrundsignal. Wir stellen uns vor, dass ChEC-seq ein mächtiges Gegenstück zu ChIP sein wird, das ein unabhängiges Mittel bietet, um sowohl ChIP-seq-Befunde zu validieren als auch neue Einblicke in die genomische Regulierung zu entdecken.
Introduction
Die Abbildung der Bindungsstellen von Transkriptionsfaktoren (TFs), Chromatin-Remodelern und anderen chromatin-assoziierten regulatorischen Faktoren ist der Schlüssel zum Verständnis aller chromatinbasierten Prozesse. Während Chromatin-Immunpräzipitation und High-Throughput-Sequenzierung (ChIP-seq) Ansätze verwendet wurden, um viele wichtige Einblicke in die Genom-Biologie zu gewinnen, haben sie bemerkenswerte Einschränkungen. Wir haben vor kurzem eine alternative Methode eingeführt, die als Chromatin-endogene Spaltung und High-Throughput-Sequenzierung (ChEC-seq) 1 bezeichnet wird, um diese Nachteile zu umgehen.
ChIP-seq wird am häufigsten mit einem anfänglichen Formaldehyd-Vernetzungsschritt (X-ChIP-seq) durchgeführt, um Protein-DNA-Wechselwirkungen zu erhalten. Eine Reihe neuerer Studien haben jedoch gezeigt, dass X-ChIP-seq transiente oder unspezifische Protein-DNA-Wechselwirkungen 2 , 3 , 4 , 5 <einfängtSup>, 6 , 7 , 8 , was zu falsch-positiven Bindungsstellen führt. Darüber hinaus schützt die Beschallung, die gewöhnlich verwendet wird, um Chromatin in X-ChIP-seq-Experimenten zu zersplittern, vorzugsweise Regionen von offenem Chromatin, was zu einer voreingenommenen Rückgewinnung von Fragmenten aus diesen Regionen 9 , 10 führt . Sonate liefert auch eine heterogene Mischung von Fragmentlängen, die letztlich die Bindungsstellenauflösung begrenzt, obwohl die Zugabe eines Exonuklease-Verdauungsschrittes die Auflösung 11 , 12 stark verbessern kann . Native ChIP-Verfahren wie besetzte Regionen von Genomen aus affinitätsgereinigtem natürlich isoliertem Chromatin (ORGANIC) 13 verwenden keine Vernetzung und Fragmentchromatin mit Mikrokokken-Nuklease (MNase), wodurch die mit der Formaldehydvernetzung und der Ultraschallbehandlung verbundenen potentiellen Biasen vermieden werden. Aber,Die Löslichkeit vieler chromatingebundener Proteine unter den relativ milden Bedingungen, die für die native Chromatinextraktion erforderlich sind, ist schlecht, was möglicherweise zu einem verminderten Dynamikbereich und / oder falschen Negativen führt 14 .
Während verschiedene Iterationen von ChIP-seq am häufigsten für die genomweite Kartierung von Protein-DNA-Wechselwirkungen verwendet werden, wurden auch mehrere Mapping-Techniken, die auf der Fusion von Proteinen interessiert sind, die für verschiedene DNA-modifizierende Enzyme von Interesse sind, implementiert. Ein solcher Ansatz ist die DNA-Adenin-Methyltransferase-Identifizierung (DamID) 15 , wobei ein interessantes chromatinbindendes Protein genetisch an Dam verdünnt ist und diese Fusion in Zellen oder Tieren exprimiert wird, was zu einer Methylierung von GATC-Sequenzen proximal zu Bindungsstellen für das Protein führt. DamID ist insofern vorteilhaft, als sie sich nicht auf Immunpräzipitation beruft und so Vernetzungsmittel, Antikörper oder Chromatin-Solubilisierung vermeidet. Es wird auch in vivo durchgeführt. aberIst die Auflösung von DamID auf die Kilobase-Skala beschränkt und die Methylierungsaktivität des Dam-Fusionsproteins ist konstitutiv. Eine zweite Methode, die auf einer enzymatischen Fusion basiert, ist die Calling Card-Seq 16 , die eine Fusion von einem Faktor von Interesse für eine Transposase einsetzt und die ortsspezifische Integration von Transposonen leitet. Wie DamID, Calling Card-Seq ist nicht auf Immunpräzipitation basiert und hat somit ähnliche Vorteile, mit dem zusätzlichen Vorteil einer erhöhten Auflösung. Jedoch kann Calling Card-seq durch Sequenzvorspannungen von Transposasen begrenzt werden und ist auch auf das Vorhandensein von Restriktionsstellen in der Nähe von Transposon-Insertionsstellen angewiesen.
Eine dritte enzymatische Fusionsmethode, die im Laemmli-Labor entwickelt wurde, ist die Chromatin-endogene Spaltung (ChEC) 17 . In ChEC wird eine Fusion zwischen einem Chromatin-assoziierten Protein und MNase in Zellen exprimiert, und bei der Calciumzugabe zur Aktivierung von MNase wird die DNA proximal zu den Bindungsstellen für die markierten markiertFaktor ( Abbildung 1 ). In Verbindung mit dem Southern-Blotting wurde ChEC verwendet, um die Chromatinstruktur und die Proteinbindung an einer Anzahl von einzelnen Loci in Hefe 17 , 18 zu charakterisieren, und wurde mit einer niederauflösenden Mikroarrayanalyse kombiniert, um die Wechselwirkung von Kernporenkomponenten mit der Hefe zu untersuchen Genom 19 ChEC bietet Vorteile wie DamID und Calling Card-seq, und seine Auflösung ist fast ein-Basis-Paar, wenn durch die Primer-Erweiterung 19 analysiert. ChEC ist auch kontrollierbar: Die robuste DNA-Spaltung durch MNase hängt von der Zugabe von millimolarem Calcium ab, wobei sichergestellt wird, dass MNase bei den niedrigen freien Calciumkonzentrationen, die in lebenden Hefezellen beobachtet werden, inaktiv ist.
Bisher haben wir postuliert, dass die Kombination von ChEC mit High-Throughput-Sequenzierung (ChEC-seq) hochauflösende Karten von TF-Bindungsstellen bereitstellen würde. In der Tat, ChEC-seq erzeugte hochauflösende Karten der angehenden Hefe allgemeine regulatorische Faktoren (GRFs) Abf1, Rap1 und Reb1 über das Genom 1 . Wir haben auch ChEC-seq auf den modularen Mediator-Komplex angewendet, einen konservierten, essentiellen globalen Transkriptions-Coaktivator 21 , der die Anwendbarkeit von ChEC-seq auf Megadalton-Komplexe erweitert, die nicht direkt mit DNA in Berührung kommen und durch ChIP- Basierte Methoden. ChEC-seq ist eine leistungsstarke Methode sowohl für die unabhängige Validierung von ChIP-seq-Ergebnissen als auch für die Erstellung neuer Einblicke in die Regulierung von Chromatin-residenten Prozessen. Hier stellen wir ein Schritt-für-Schritt-Protokoll für die Umsetzung dieser Methode in knospende Hefe vor.
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Protocol
1. Erzeugung von Hefe-Stämmen
- Generieren Sie einen Hefe-Stamm mit dem Faktor von Interesse mit MNase getaggt.
- PCR amplifizieren die MNase-Tagging-Kassette aus dem gewünschten Vektor ( Tabelle 1 ) unter Verwendung des spezifizierten Reaktionsgemisches ( Tabelle 2 ) und der Zyklusbedingungen ( Tabelle 3 ). Mischen Sie 5 μl der PCR-Reaktion und 1 μl 6X DNA-Beladungsfarbstoff. Führen Sie jedes PCR-Aliquot auf einem 0,8% Agarosegel bei 120 V für 40 min. Die erwartete Produktgröße beträgt ~ 2,3 kb.
- Verwandeln Sie die verstärkte Markierungskassette mit der Standard-Lithiumacetattransformation 22 in die Dehnung der Wahl und führen Sie die Auswahl durch.
- Überprüfen Sie die korrekte Integration der Tagging-Kassette mit der Kolonie-PCR.
- Bereiten Sie das angegebene Reaktionsgemisch ( Tabelle 4 ) für die Anzahl der zu untersuchenden Kolonien vor. Halten Sie auf Eis, bis nötig.
- Wählen Sie einen Teil jeder Kolonie, um tes zu seinIn den Boden eines PCR-Röhrchens mit einem sterilen Zahnstocher oder Pipettenspitze.
- Mikrowelle die gepflückten Kolonien bei hoher Leistung für 1 min.
- Füge 50 μl PCR-Mischung ( Tabelle 4 ) zu jeder mikrowellengewundenen Kolonie hinzu und pipet auf und ab, um zu mischen. Durchführen der PCR unter Verwendung der angegebenen Zyklusbedingungen ( Tabelle 5 ).
- Mischen Sie die 50 & mgr; l PCR-Reaktion und 10 & mgr; l 6X DNA-Beladungsfarbstoff direkt in jedem PCR-Röhrchen. Führen Sie 10 & mgr; l jeder Probe auf einem 1% Agarosegel bei 120 V für 40 min. Die erwartete Produktgröße beträgt ~ 700 bp.
HINWEIS: Wenn gewünscht, vergewissern Sie sich die entsprechende Expression des MNase-Fusionsproteins über Western-Blotting. Eine ~ 20,6 Kilodalton-Verschiebung im Molekulargewicht des markierten Proteins wird erwartet.
- Generieren Sie einen freien MNase-Stamm durch Homologie-basierte Klonierung des Promotors des Gens von Interesse in pGZ136 (Tabelle 1) und Transformation und Selektion wie in Schritt 1.1.2.
- AlternatiUm den Promotor des Gens von Interesse und 3xFLAG-MNase-SV40 NLS in einen Plasmidvektor zu versetzen, zu transformieren und wie in Schritt 1.1.2 auszuwählen und den Stamm in der geeigneten selektiven Bedingung für die Aufrechterhaltung des Plasmids zu wachsen.
2. ChEC
- Am Nachmittag / Abend des Tages vor dem ChEC-Experiment inokulieren 3 ml Hefe-Pepton-Dextrose (YPD) oder ein geeignetes selektives Medium mit einer einzigen Kolonie des Stammes, der den MNase-markierten Faktor trägt. Inkubieren Sie diese Kultur über Nacht (180 RPM Schütteln, 30 ° C).
- Am Morgen des Tages des ChEC-Experiments verdünnen Sie die Übernachtkultur in 50 ml Medium auf eine optische Dichte bei 600 nm (OD 600 ) von 0,2 - 0,3. Inkubieren Sie diese Kultur (180 RPM Schütteln, 30 ° C), bis sie eine OD 600 von 0,5-0,7 erreicht. Wenn sich die Kultur der entsprechenden OD 600 nähert, setzen Sie den Wärmeblock oder das Wasserbad auf 30 ° C und beginnen mit dem Auftauen von Puffer A-Additiven ( Ta6).
- 5 ml Puffer A plus Additive ( Tabelle 6 ) pro Kultur vorbereiten. Halten Sie den Puffer A bei RT während des Vorgangs.
- Bereiten Sie Mikrofugenröhrchen vor, die 90 μl Stopplösung ( Tabelle 7 ) und 10 μl 10% SDS für jeden zu sammelnden Zeitpunkt enthalten. Für jeden neuen Faktor analysiert, nehmen Sie Proben bei 0 s, 30 s, 1 min, 2,5 min, 5 min und 10 min.
- Dekantische Kultur in ein 50 ml konisches Röhrchen geben und bei 1.500 xg und Raumtemperatur (RT) für 1 min zentrifugieren.
- Die Zellen in 1 ml Puffer A sorgfältig resuspendieren und die resuspendierten Zellen in ein Mikrozentrifugenröhrchen überführen. Pellet resuspendierte Zellen in einer Mikrofuge bei 1.500 xg und RT für 30 s.
- Absaugen des Überstandes und sorgfältige Resuspendierung der Zellen in 1 ml Puffer A durch Pipettieren auf und ab. Pellet resuspendierte Zellen in einer Mikrofuge bei 1.500 xg und RT für 30 s. Wiederholen Sie diesen Schritt einmal.
- Die Zellen in 570 μl Puffer A sorgfältig resuspendieren. 30 μl 2% Digitonin geben(0,1% Endkonzentration), um die Permeabilisierung der Zellen zu erleichtern und zu mischen.
- Permeabilisieren von Zellen in Hitzeblock oder Wasserbad bei 30 ° C für 5 min.
- Pipet die Reaktion auf und ab, um eine gleichmäßige Verteilung der Zellen zu gewährleisten. Entfernen Sie ein 100 & mgr; l Aliquot von permeabilisierten Zellen als Negativkontrolle zu einem Mikrofugenröhrchen, der Stopplösung und SDS enthält (Schritt 2.4) und vortexen, um kurz zu mischen.
- Füge 1,1 μl 1 M CaCl 2 (2 mM Endkonzentration) zu permeabilisierten Zellen hinzu, um MNase zu aktivieren und mehrmals schnell umzukehren oder kurz zu mischen. Sofort die gemischte Reaktion bei 30 ° C zurückgeben und einen Timer starten.
- Zu jedem Zeitpunkt, der gesammelt werden soll, pipettieren Sie die Reaktion nach oben und unten, um eine gleichmäßige Verteilung der Zellen zu gewährleisten, und entfernen Sie dann ein 100 & mgr; l Aliquot von permeabilisierten Zellen zu einem Mikrofugenröhrchen, der Stopplösung und SDS enthält, und kurz vor dem Mischen vorwischen. Für jeden neuen Faktor analysiert, nehmen Sie 0 s (kein CaCl 2 hinzugefügt), 30 s, 1 min, 2,5 min, 5 min und 10 min zeitpunkte.
HINWEIS: ChEC-Experimente mit Faktoren, die schnell DNA bei 30 ° C spalten, können bei niedrigeren Temperaturen durchgeführt werden, um die MNase-Spaltkinetik zu verlangsamen. - Sobald alle Zeitpunkte gesammelt wurden, fügen Sie 4 μl 20 mg / ml Proteinase K zu jeder Probe hinzu, werden vor kurzem zu mischen und bei 55 ° C für 30 min inkubieren.
- 200 μl 25: 24: 1 Phenol: Chloroform: Isoamylalkohol zu jeder Probe geben, kräftig mischen und mit maximaler Geschwindigkeit und RT in einer Mikrofuge 5 min zentrifugieren.
- Entfernen Sie jede wässrige Phase (~ 150 μL) in ein neues Röhrchen. Fügen Sie 30 μg Glykogen und 500 μl 100% Ethanol hinzu. Vortex kräftig zum Mischen und Ausfällen auf Trockeneis für 10 min oder bis die Lösung viskos ist.
- Pellet präzipitierte DNA mit maximaler Geschwindigkeit und 4 ° C in einer Mikrofuge für 10 min.
- Dekantierte Überstände und Waschpellets mit 1 ml RT 70% Ethanol.
- Dekantisches Ethanol, Entfernen des Restes durch Invertieren einesIch schlage die Röhren auf ein Papiertuch. Die Proben mit einer Tischzentrifuge kurzspülen und eine Pipette verwenden, um restliches Ethanol zu entfernen, wobei darauf geachtet wird, dass das Pellet nicht gestört wird. Lufttrockenpellets bei RT für 5 min.
- Während die Pellets trocknen, machen Sie eine Mastermischung, um die getrockneten Pellets in 29 & mgr; l Tris, pH 8,0 + 1 & mgr; l von 10 mg / ml RNase A, erneut zu resuspendieren. Digit RNA bei 37 ° C für 20 min.
- Mischen Sie 1 & mgr; l 6X DNA-Beladungsfarbstoff mit 5 & mgr; l jeder Probe und laufen auf einem 1,5% Agarosegel bei 120 V für 40 min.
3. Größenauswahl
ANMERKUNG: Das Ziel der Größenauswahl besteht darin, Multi-Kilobase-Fragmente von genomischer DNA aus der zu sequenzierenden Probe zu entfernen und Fragmente von ~ 150 bp (etwa die Größe der nukleosomalen DNA) oder kleiner zu bereichern. Bei Sequenzierungsdaten werden Fragmente <400 bp angereichert, mit einem bemerkenswerten Peak um die Größe der nukleosomalen DNA (~ 150 bp) und einer Peak- oder breiten Verteilung von subnukleosomalen Fragmenten.
<Ol>HINWEIS: Die Analyse von ChEC-seq Daten ist ein komplexes Verfahren und über den Rahmen dieses Artikels hinaus. Detaillierte Informationen zur Datenanalyse finden Sie in den vorherigen Publikationen 1 , 21 und die für die Analyse verwendeten benutzerdefinierten Skripte sind auf GitHub (https://github.com/zentnerlab/chec-seq) verfügbar. HOMER 25 (http://homer.salk.edu) kann auch für die Befehlszeilenanalyse von ChEC-seq-Daten verwendet werden.
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Representative Results
Im Falle eines erfolgreichen ChEC-Experiments zeigt die Analyse von DNA durch Agarose-Gelelektrophorese eine Calcium-abhängige Zunahme der DNA-Fragmentierung über die Zeit, wie durch Verschmieren und eventuelle vollständige Verdauung der genomischen DNA angezeigt wird. In einigen Fällen wird eine Leiter von Bändern ähnlich wie bei einer traditionellen MNase-Verdauung nach längerer Verdauung beobachtet. Dies ist der Fall für die ChEC-Analyse von Reb1, einem allgemeinen regulatorischen Faktor, der Nukleosomen-abgereicherte Regionen (NDRs) bindet (Abbildung 2 ). Wir haben festgestellt, dass im Falle von GRFs eine erweiterte Verdauung zu einem Signalverlust an schnell gespaltenen Bindungsstellen führt 1 . Idealerweise wird eine Probe mit einer Verringerung der Größe des genomischen DNA-Bandes, die ein hochmolekulares Verschmieren zeigt, wie die 30 s und 1 min Zeitpunkte für Reb1 ChEC, zur Sequenzierung verwendet, um zeitabhängigen Signalverlust zu vermeiden .
3 ). In ähnlicher Weise beobachten wir eine wesentliche DNA-Spaltung durch eine Fusion der Mediator-Untereinheit Med8 mit MNase, aber nicht freie MNase, die durch den MED8- Promotor angetrieben wird , 1 min nach Calciumzugabe (Abbildung 3 ).
Um Reb1 ChEC-seq-Daten mit ChIP-seq zu vergleichen, erhielten wir eine Liste von 1.991 Reb1-Peaks, die von ORGANIC 13 bestimmt wurden . Diese Peaks wurden mit der durchschnittlichen Fragmentendzählung an jeder Basisposition in einem 100 bp-Fenster um den Motiv-Mittelpunkt motiviert. Wir beobachteten eine auffallende Asymmetrie in der Spaltung, wobei die Mehrheit der Fragmentenden auf die stromaufwärtige Seite des Motivs (Abbildung 4 ).
Abbildung 1 : Schematische Darstellung der ChEC-seq-Methode. Eine Chromatin-assoziierte Protein- (CAP) -MNase-Fusion wird in Hefezellen exprimiert. Das Protein bindet an DNA, erzeugt aber keine Spaltung über den Hintergrundniveaus aufgrund des sehr niedrigen freien Kalziums im Zellkern. Bei der Permeabilisierung von Zellen mit Digitonin und Zugabe von millimolarem Calcium, CAP-MNase-Fusionen, die an das Genom gebunden sind, spalten DNA, wobei kleine Fragmente freigesetzt werden. Diese Fragmente werden dann gereinigt, sequenziert und dem Genom zugeordnet, wobei Peaks von Fragmentenden proximal zu Bindungsstellen für die CAP-MNase-Fusion gegeben werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2 : Agarose-Gel-Elektrophorese von DNA aus einem Reb1-ChEC-Experiment. Ein 5 & mgr; l Aliquot der DNA von jedem ChEC-Zeitpunkt wurde auf einem 1,5% TAE-Agarosegel vor der Größenauswahl analysiert. Dies zeigt die fortschreitende Verdauung der genomischen DNA durch die Reb1-MNase-Fusion. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3 : Genom-Browser-Schnappschüsse von Reb1-MNase und Free MNase ChEC-seq Experimente. IGV-Ansichten des Fragment-Endsignals für Reb1 und freies MNase ChEC-seq 30 s nach Calciumzugabe und Med8 und freiem MNase ChEC-seq 1 min af Ter Calciumzugabe entlang eines repräsentativen Segments des Hefegenoms. Die Datensätze wurden normalisiert, indem die Anzahl der Fragmentenden, die auf jede Basisposition abgebildet wurden, durch die Gesamtzahl der Fragmentenden, die abgebildet wurden, und die Multiplikation mit der Gesamtzahl der abgebildeten Basen dividiert wurde. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4 : Anreicherung von Reb1-MNase-freigesetztem Fragment endet um Reb1 ORGANIC Sites. Durchschnittliche Handlung von 30 s Reb1 und freiem MNase ChEC-seq Fragment-Endsignal um 1.991 Reb1-Motive bestimmt durch ORGANIC 13 . Die Daten wurden wie in Abbildung 3 normalisiert.Lank "> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
| Plasmid | Hefe wählbare Markierung | Notizen | Addgen-Plasmid-Zahl |
| PGZ108 | KanMX6 | 3xFLAG-MNase tagging, 33 aa linker | 70231 |
| PGZ109 | HIS3MX6 | 3xFLAG-MNase tagging, 33 aa linker | 70232 |
| PGZ110 | TRP1 | 3xFLAG-MNase tagging, 33 aa linker | 70233 |
| PGZ136 | URA3 | Drückt 3xFLAG-MNase-SV40 NLS unter der Kontrolle des REB1-Promotors aus | 72273 |
| PGZ173 | KanMX6 | MNase-Tagging, 8 aa Linker | 70234 |
Tabelle 1: Details von ChEC Plasmiden. Alle Markierungsvektoren basieren auf pFA6a-Vektoren und sind daher mit den gängigen F2 / R1-Markierungs-Primerpaaren kompatibel. Die Tagging-Kassette besteht aus einem Linker der angegebenen Länge, einem 3xFLAG-Epitop, um die Erkennung durch Western-Blotting zu erleichtern (außer im Fall von pGZ173, wo der Linker verkürzt wurde, um das 3xFLAG-Tag zu entfernen), die reife Kette von MNase (GenBank P00644 , Aa 83 - 231) und die angegebene markierbare Markierung.
| Reagens | Volumen | [Finale] |
| 5x PCR-Puffer | 10 ml | 1x (2 mM MgCl & sub2 ; ) |
| 10 mM dNTP-Mischung (2,5 mM pro dNTP) | 1 mL | 200 mM (50 mM pro dNTP) |
| 10 mM F2 Grundierung | 2,5 ml | 0,5 mM |
| 10 mM R1 pRimer | 2,5 ml | 0,5 mM |
| PGZ108 / 109/110/172 (1-5 ng / ml) | 1 mL | |
| 2 U / & mgr; l Heißstart-Hochwertige Polymerase | 0,5 ml | 1 U |
| DdH 2 O | 32,5 ml |
Tabelle 2: Reaktionsmischung zur PCR-Verstärkung von 3xFLAG-MNase Tagging-Kassetten. F2 / R1-Primer-Sequenzen finden Sie unter http://yeastgfp.yeastgenome.org/yeastGFPOligoSequence.txt.
| Temperatur (° C) | Zeit | Fahrräder |
| 98 | 30 s | 1 |
| 98 | 10 s | 25 |
| 55 | 30 s | 25 |
| 72 1 min 15 s | 25 | |
| 72 | 2 Minuten | 1 |
| 10 | Für immer | Halt |
Tabelle 3: Thermische Zyklusbedingungen für die PCR-Verstärkung von 3xFLAG-MNase-Tagging-Kassetten. Die Inkubationstemperatur und die Verlängerungszeit können auf der Basis der verwendeten DNA-Polymerase angepasst werden.
| Reagens | Volumen | [Finale] |
| 10x Taq Puffer | 5 ml | 1x (1,5 mM MgCl & sub2 ; ) |
| 10 mM dNTP-Mischung (2,5 mM pro dNTP) | 1 mL | 200 mM (50 mM pro dNTP) |
| 10 mM Prüfen Sie den Primer | 1 mL | 0,2 mM |
| 10 mM MNase-R oder negativem Kontrollprimer | 1 mL | 0,2 mM |
| 5 U / ml Taq-Polymerase | 0,5 ml | 2,5 U |
| DdH 2 O | 41,5 ml |
Tabelle 4: Reaktionsgemisch für Kolonie-PCR-Bestätigung von MNase-Tagging. Prüfen Sie die Primer-Sequenzen finden Sie unter http://yeastgfp.yeastgenome.org/yeastGFPOligoSequence.txt. Der Kontrollprimer wird zusammen mit einem Reverse-Primer innerhalb von MNase (5'-TTGTGCAGCTTCTTGGTAC-3 ') und einem Reverse-Primer ~ 500 Basenpaare (bp) stromabwärts des jeweiligen Gens als Negativkontrolle verwendet.
| Temperatur (° C) | Zeit | Fahrräder |
| 95 | 5 Minuten | 1 |
| 95 | 30 s | 35 |
| 55 | 30 s | 35 |
| 68 | 1 Minute | 35 |
| 68 | 5 Minuten | 1 |
| 10 | Für immer | Halt |
Tabelle 5: Thermische Zyklusbedingungen für die Kolonie-PCR-Bestätigung von MNase-Tagging. Die Inkubationstemperatur und die Verlängerungszeit können auf der Basis der verwendeten DNA-Polymerase angepasst werden.
| Reagens | Volumen | [Finale] |
| 1 M Tris, pH 7,5 | 1,5 ml | 15 mM |
| 1 M KCl | 8 ml | 80 mM |
| 0,2 M EGTA | 50 mL | 0,1 mM |
| DdH 2 O | Fülle bis 100ML |
Tabelle 6: Rezept für Puffer A. Vor der Verwendung wird die Hälfte einer Protease-Inhibitor-Tablette, 50 & mgr; l 100 mM PMSF (1 mM endgültig), 5 & mgr; l 200 mM Spermin (0,2 mM endgültig) und 2,5 & mgr; l 1 M zugegeben Spermidin (0,5 mM endgültig) pro 5 ml Lösung.
| Reagens | Volumen | [Finale] |
| 5 M NaCl | 8 ml | 400 mM |
| 0,5 M EDTA | 4 ml | 20 mM |
| 0,2 M EGTA | 2 ml | 4 mM |
| DdH 2 O | Füllung auf 100 ml |
Tabelle 7: Rezept für 2x Stopplösung. Kombinieren Sie 90 μl stoP-Lösung mit 10 μl 10% SDS in einem Mikrofugenröhrchen für jeden zu entnehmenden Zeitpunkt (siehe Schritt 2.4).
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Discussion
Wir haben gezeigt, dass ChEC verschiedene Klassen von Hefeproteinen auf Chromatin abbilden kann und antizipieren, dass es breit auf verschiedene Familien von TFs und anderen chromatinbindenden Faktoren in Hefe anwendbar sein wird. ChEC-seq ist insofern vorteilhaft, als es keine Vernetzung, Chromatin-Solubilisierung oder Antikörper erfordert. So vermeidet ChEC Artefakte, die potentiell in X-ChIP-seq vorhanden sind, wie das hyper-ChIPable Artefakt 3 , 4 und native ChIP, wie falsche Negative aufgrund unvollständiger Protein-Solubilisierung 14 . Der Hauptnachteil von ChEC-seq, wie bei allen enzymatischen Fusionsverfahren, ist die Voraussetzung für ein Fusionsprotein. Dies kann schnell in knospender Hefe erreicht werden, ist aber mühsamer in metazoans. Eine weitere Einschränkung von ChEC-seq ist, dass es nicht implementiert werden kann, wie für die Profilierung von Histon-Modifikationen. Jedoch könnte eine modifizierungsbindende Domäne mit MNase fusioniert und exprimiert werden, wodurch h ermöglicht wirdIst-Modifikations-Mapping mit ChEC-seq. In dieser Richtung wurde ChIP-seq unter Verwendung von Epitop-markierten Histon-Modifikations-bindenden Domänen verwendet, um genomweite Muster der Histon-Modifikation zuzuordnen 26 .
Die Verwendung einer freien MNase-Steuerung ist wichtig, um die Spezifität der ChEC-seq-Ergebnisse festzulegen. Der freie MNase-Stamm trägt MNase, markiert mit 3xFLAG und einem simianen Virus 40 nuklearen Lokalisierungssignal (SV40 NLS) unter der Kontrolle des endogenen Promotors für das Gen von Interesse. Es ist konzeptionell ähnlich wie die unfundierte Dam-Kontrolle in DamID-Studien 27 und Kontrollen für unspezifische Spaltung durch Chromatin Zugänglichkeit verwendet. Als freie MNase-Steuerung für TF ChEC-seq integrierten wir 3xFLAG-MNase-SV40 NLS, angetrieben vom REB1- Promotor am ura3 locus 1 . Für Mediator ChEC-seq exprimierten wir 3xFLAG-MNase-SV40 NLS unter der Kontrolle des MED8- Promotors in einem nicht-integrierenden PlasmiD-Vektor in selektivem Medium gehalten 21 In beiden Fällen wurde eine sehr geringe Spaltung durch freie MNase beobachtet. Somit sollte ein einzelner Kontrollstamm, bei dem 3xFLAG-MNase-SV40 NLS durch einen relativ robusten Promotor getrieben wird, für die meisten Experimente geeignet sein.
Bei der Planung eines ChEC-Experiments kann die strukturelle Berücksichtigung des Proteins von Interesse wichtig sein. Zum Beispiel fanden wir, dass das Anfügen von MNase an den C-Terminus von Reb1 ein asymmetrisches Spaltungsmuster um Reb1-Motive ergab, während die Expression von Reb1 mit N-terminaler MNase ein symmetrisches Spaltungsmuster 1 ergab. Wir schreiben diese verschiedenen Spaltungsmuster der Struktur von Reb1 zu. Die DNA-Bindungsdomäne von Reb1 befindet sich an ihrem C-Terminus; Somit ist der C-Terminus strukturiert und nahe an DNA, was den Bewegungsbereich von MNase begrenzt und nur eine C-terminale Spaltung ermöglicht. Im Gegensatz dazu ist der C-Terminus von Abf1 relativ unstrukturiert und kann somit dazu beitragen, zu erhöhenReichweite von MNase, die eine Spaltung auf beiden Seiten der Abf1-Bindungsstellen ermöglicht. Im Falle von Rap1, einer anderen Hefe GRF, fanden wir, dass die Verkürzung des Linkers zwischen dem C-Terminus und der MNase von 33 bis 8 aa ausreichend war, um die Spaltung stark zu reduzieren, vielleicht aufgrund des vorgeschlagenen Abstands des C-terminalen Teils von Rap1 aus DNA 28 Eine solche strukturelle Betrachtung ist auch wahrscheinlich, wenn man versucht, die Bindung von in großen Komplexen vorhandenen Proteinen abzubilden. Für unsere ChEC-seq-Analyse der Mediator-Bindung an das Hefegenom 21 haben wir Untereinheiten ausgewählt, deren C-Termini strukturell vorhergesagt wurden, um nicht exponiert zu werden, anstatt innerhalb des Komplexes zu begraben. Von den drei Untereinheiten, die mit MNase fusioniert wurden, hielt man die DNA nicht robust, was darauf hindeutet, dass entweder sterische Zwänge oder Wechselwirkungen mit anderen DNA-Bindungsfaktoren die DNA-Spaltung abschwächen.
Wir fanden, dass ChEC-seq 4-12 mal mehr Peaks für die Hefe GRFs Abf1, Rap1 und Reb erkennt1 als verschiedene ChIP-Ansätze, wenn alle Zeitpunkte zusammen betrachtet wurden 1 . Diese Seiten könnten in zwei Klassen unterteilt werden, die auf der MNase-Spaltkinetik basieren. Die Analyse von ChEC-seq-Daten für Hefe-GRFs zeigte zwei zeitlich unterschiedliche Klassen von Bindungsstellen 1 . Die erste, "schnell", zeigte eine maximale Spaltung <1 min nach Kalziumzugabe und enthält in der Regel robuste Übereinstimmungen mit bekannten Konsensusmotiven. Die zweite, als "langsam" bezeichnet, dauerte einige Minuten, um spürbare Spaltniveaus zu erreichen und waren von Motivspielen erschöpft. Beide Klassen von Websites wurden im Durchschnitt für die Bindung in ChIP-Datensätzen angereichert, obwohl sie nicht unbedingt als Peaks in diesen ChIP-Studien bezeichnet wurden. Die Mehrheit der Standorte für einen bestimmten Faktor waren langsame Standorte. Wir spekulieren, dass schnelle Standorte repräsentativ für hochaffine Transkriptionsfaktor-Bindungsstellen sind, während langsame Stellen Loci darstellen, die vorübergehend während der Bindungsort-Abtastung abgetastet wurden. Das obDie Bereitstellung von zwei Klassen von Bindungsstellen, die durch die Kinetik der MNase-Spaltung getrennt sind, kann die Beobachtung in vielen ChIP-seq-Datensätzen erklären, dass eine große Anzahl von Peaks für einen gegebenen Faktor mit einer gut etablierten DNA-Bindungsspezifität kein Konsensmotiv enthält 29 : Formaldehyd-Vernetzung, die für 10-15 Minuten in den meisten ChIP-Protokollen durchgeführt wird, kann wiederholt vorübergehende oder opportunistische Wechselwirkungen eines Faktors mit dem Genom erfassen, was zu Inflation des Signals führt. In der Tat, der Vergleich von ChIP-exo und Live-Zell-Bildgebung deutet darauf hin, dass dies der Fall 2 ist . Bemerkenswerterweise haben wir eine so dramatische zeitabhängige Abnahme der Mediator-ChEC-seq-Signale 21 nicht beobachtet, wobei das Mediator-ChEC-seq-Signal von 30 s bis 20 min relativ konstant ist. Angesichts dieser Beobachtungen empfehlen wir die Durchführung von kurzfristigen ChEC-seq zur Wiederherstellung von Vertrauensbindungsstellen.
Wir erwarten, dass ChEC-seq an Nicht-Hefe angepasst werden kannSysteme Die Konzentration an freiem Calcium in nicht stimulierten Säugetierzellen beträgt 50-300 nM 30 , 32 , weit unterhalb der Schwelle für eine effiziente MNase-Aktivierung. Der limitierende Schritt zur Etablierung von ChEC-seq in metazoan-Systemen ist somit die Erzeugung von Fusionsproteinen, die in Metazoan als Hefezellen weitaus aufwendiger bleibt. Allerdings wurde die endogene Markierung von Metazoan-Genen durch das Aufkommen der CRISPR-basierten Genomtechnik 33 erheblich erleichtert, so dass diese Einschränkung leicht überwunden werden sollte. Alternativ könnten MNase-Fusionsproteine in niedrigen Mengen aus Plasmiden exprimiert werden. Dieser Ansatz war für DamID in Drosophila 34 , 35 und menschlichen 36 Zellen sehr erfolgreich und konnte daher auch ChEC-seq in Metazoan-Zellen erleichtern.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Wir danken Moustafa Saleh und Jay Tourigny für die kritische Lektüre des Manuskripts und Steven Hahn und Steven Henikoff für Mentoring und Unterstützung bei der Entwicklung von ChEC-seq und deren Anwendung beim Mediator-Komplex. SG wird unterstützt von NIH Zuschüsse R01GM053451 und R01GM075114 und GEZ wird von Indiana University Startup Fonds unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| dNTPs | NEB | N0447 | |
| Q5 high-fidelity DNA polymerase | NEB | M0491L | Other high-fidelity DNA polymerases, such as Phusion, may be used for cassette amplification. |
| TrackIt 1 Kb Plus DNA ladder | ThermoFisher Scientific | 10488085 | |
| Taq DNA polymerase | NEB | M0273L | |
| cOmplete Mini EDTA-free protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | 11836170001 | It is important that an EDTA-free protease inhibitor mix is used, so as not to inhibit MNase cleavage by chelation of Ca2+. |
| PMSF | ACROS Organics | AC215740010 | |
| Digitonin, High Purity | EMD Millipore | 300410-250MG | Make a 2% stock by dissolving 20 mg digitonin in 1 mL DMSO with vigorous vortexing. |
| Proteinase K, 20 mg/mL | Invitrogen | 25530049 | |
| RNase A, 10 mg/mL | ThermoFisher Scientific | EN0531 | |
| Ampure XP beads | Beckman Coulter | A63880 | Ampure-like beads can be generated using a published protocol (ref 24). |
| MagneSphere magnetic rack | Promega | Z5342 |
References
- Zentner, G. E., Kasinathan, S., Xin, B., Rohs, R., Henikoff, S. ChEC-seq kinetics discriminates transcription factor binding sites by DNA sequence and shape in vivo. Nat Commun. 6, 8733 (2015).
- Chen, J., et al. Single-Molecule Dynamics of Enhanceosome Assembly in Embryonic Stem Cells. Cell. 156 (6), 1274-1285 (2014).
- Teytelman, L., Thurtle, D. M., Rine, J., van Oudenaarden, A. Highly expressed loci are vulnerable to misleading ChIP localization of multiple unrelated proteins. Proc Natl Acad Sci USA. 110 (46), 18602-18607 (2013).
- Park, D., Lee, Y., Bhupindersingh, G., Iyer, V. R. Widespread Misinterpretable ChIP-seq Bias in Yeast. PLoS ONE. 8 (12), 83506 (2013).
- Jain, D., Baldi, S., Zabel, A., Straub, T., Becker, P. B. Active promoters give rise to false positive 'Phantom Peaks' in ChIP-seq experiments. Nucleic Acids Res. , (2015).
- Krebs, W., et al. Optimization of transcription factor binding map accuracy utilizing knockout-mouse models. Nucleic Acids Res. 42 (21), 13051-13060 (2014).
- Paul, E., Zhu, Z. I., Landsman, D., Morse, R. H. Genome-Wide Association of Mediator and RNA Polymerase II in Wild-Type and Mediator Mutant Yeast. Mol Cell Biol. 35 (1), 331-342 (2015).
- Worsley Hunt, R., Wasserman, W. W. Non-targeted transcription factors motifs are a systemic component of ChIP-seq datasets. Genome Biol. 15 (7), 412 (2014).
- Vega, V. B., Cheung, E., Palanisamy, N., Sung, W. -K. Inherent Signals in Sequencing-Based Chromatin-ImmunoPrecipitation Control Libraries. PLoS ONE. 4 (4), 5241 (2009).
- Teytelman, L., et al. Impact of Chromatin Structures on DNA Processing for Genomic Analyses. PLoS ONE. 4 (8), 6700 (2009).
- Rhee, H. S., Pugh, B. F. Comprehensive Genome-wide Protein-DNA Interactions Detected at Single-Nucleotide Resolution. Cell. 147 (6), 1408-1419 (2011).
- He, Q., Johnston, J., Zeitlinger, J. ChIP-nexus enables improved detection of in vivo transcription factor binding footprints. Nat Biotech. 33 (4), 395-401 (2015).
- Kasinathan, S., Orsi, G. A., Zentner, G. E., Ahmad, K., Henikoff, S. High-resolution mapping of transcription factor binding sites on native chromatin. Nat Methods. 11 (2), 203-209 (2014).
- Skene, P. J., Hernandez, A. E., Groudine, M., Henikoff, S. The nucleosomal barrier to promoter escape by RNA polymerase II is overcome by the chromatin remodeler Chd1. eLife. 3, 02042 (2014).
- Aughey, G. N., Southall, T. D. Dam it's good! DamID profiling of protein-DNA interactions. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 5 (1), 25-37 (2016).
- Wang, H., Mayhew, D., Chen, X., Johnston, M., Mitra, R. D. Calling Cards enable multiplexed identification of the genomic targets of DNA-binding proteins. Genome Res. 21 (5), 748-755 (2011).
- Schmid, M., Durussel, T., Laemmli, U. K. ChIC and ChEC: Genomic Mapping of Chromatin Proteins. Mol Cell. 16 (1), 147-157 (2004).
- Merz, K., et al. Actively transcribed rRNA genes in S. cerevisiae are organized in a specialized chromatin associated with the high-mobility group protein Hmo1 and are largely devoid of histone molecules. Genes Dev. 22 (9), 1190-1204 (2008).
- Schmid, M., et al. Nup-PI: The Nucleopore-Promoter Interaction of Genes in Yeast. Mol Cell. 21 (3), 379-391 (2006).
- Dunn, T., Gable, K., Beeler, T. Regulation of cellular Ca2+ by yeast vacuoles. J Biol Chem. 269 (10), 7273-7278 (1994).
- Grünberg, S., Henikoff, S., Hahn, S., Zentner, G. E. Mediator binding to UASs is broadly uncoupled from transcription and cooperative with TFIID recruitment to promoters. The EMBO Journal. 35 (22), 2435-2446 (2016).
- Gietz, R. D., Schiestl, R. H. High-efficiency yeast transformation using the LiAc/SS carrier DNA/PEG method. Nat. Protocols. 2 (1), 31-34 (2007).
- Rohland, N., Reich, D. Cost-effective, high-throughput DNA sequencing libraries for multiplexed target capture. Genome Res. 22 (5), 939-946 (2012).
- Orsi, G. A., Kasinathan, S., Zentner, G. E., Henikoff, S., Ahmad, K. Mapping regulatory factors by immunoprecipitation from native chromatin. Current protocols in molecular biology. Ausubel, F. M., et al. 110, 21-25 (2015).
- Heinz, S., et al. Simple Combinations of Lineage-Determining Transcription Factors Prime cis-Regulatory Elements Required for Macrophage and B Cell Identities. Mol Cell. 38 (4), 576-589 (2010).
- Kungulovski, G., et al. Application of histone modification-specific interaction domains as an alternative to antibodies. Genome Res. 24 (11), 1842-1853 (2014).
- Vogel, M. J., Peric-Hupkes, D., van Steensel, B. Detection of in vivo protein-DNA interactions using DamID in mammalian cells. Nat. Protocols. 2 (6), 1467-1478 (2007).
- Feeser, E. A., Wolberger, C. Structural and Functional Studies of the Rap1 C-Terminus Reveal Novel Separation-of-Function Mutants. J Mol Biol. 380 (3), 520-531 (2008).
- Neph, S., et al. An expansive human regulatory lexicon encoded in transcription factor footprints. Nature. 489 (7414), 83-90 (2012).
- Mountjoy, K. G., Kong, P. L., Taylor, J. A., Willard, D. H., Wilkison, W. O. Melanocortin receptor-mediated mobilization of intracellular free calcium in HEK293 cells. Physiol Genomics. 5 (1), 11-19 (2001).
- Seurin, D., Lombet, A., Babajko, S., Godeau, F., Ricort, J. -M. Insulin-Like Growth Factor Binding Proteins Increase Intracellular Calcium Levels in Two Different Cell Lines. PLoS ONE. 8 (3), e59323 (2013).
- Grienberger, C., Konnerth, A. Imaging Calcium in Neurons. Neuron. 73 (5), 862-885 (2012).
- Sander, J. D., Joung, J. K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nat Biotech. 32 (4), 347-355 (2014).
- Filion, G. J., et al. Systematic Protein Location Mapping Reveals Five Principal Chromatin Types in Drosophila Cells. Cell. 143 (2), 212-224 (2010).
- van Bemmel, J. G., et al. A Network Model of the Molecular Organization of Chromatin in Drosophila. Mol Cell. 49 (4), 759-771 (2013).
- Izzo, A., et al. The Genomic Landscape of the Somatic Linker Histone Subtypes H1.1 to H1.5 in Human Cells. Cell Rep. 3 (6), 2142-2154 (2013).
