Summary
אנו מתארים את המחשוף אנדוגני הכרומטית יחד עם רצף תפוקה גבוהה (ChEC-seq), chromatin immunoprecipitation (שבב) שיטה horogonal עבור מיפוי חלבון מחייב אתרים גנום רחב עם חלבונים היתוך microococcal nuclease (MNase).
Abstract
מיפוי רחב של גנום של אינטראקציות DNA- חלבון הוא קריטי להבנת רגולציה גנטית, שיפוץ הכרומטין, ותהליכים אחרים הכרומטין תושב. פורמלדהיד crosslinking ואחריו immunoprecipitation הכרומטין ותפוקה גבוהה רצף (X-CHIP-Seq) שימש כדי לקבל תובנות רבות ערך לתוך ביולוגיה הגנום. עם זאת, X-Chip-seq יש מגבלות בולטות הקשורות crosslinking ו sonication. NIP צ'יפ ימנע את החסרונות הללו על ידי השמטת crosslinking, אבל לעתים קרובות התוצאות התאוששות לקויה של חלבונים הקשורים הכרומטין. בנוסף, כל השיטות מבוססות שבב כפופות לשיקולי איכות נוגדנים. שיטות אנזימטיות למיפוי אינטראקציות דנ"א של חלבון, הכוללות היתוך של חלבון בעל עניין לאנזים המשנה-דנ"א, שימשו גם למיקוד אינטראקציות DNA-חלבון. לאחרונה שילבנו שיטה כזו, מחשוב אנדוגני הכרומטין (ChEC), עם רצף תפוקה גבוהה כמו CHEC-seq. ChEC-seq מסתמך על היתוך של הכרומטין- AssocIated חלבון של עניין micrococcal nuclease (MNase) כדי ליצור מחשוף DNA ממוקד בנוכחות סידן בתאים חיים. CHEC-seq אינו מבוסס על immunoprecipitation ולכן עוקף חששות פוטנציאליים עם crosslinking, sonication, solobilization הכרומטין, איכות נוגדנים תוך מתן מיפוי ברזולוציה גבוהה עם אותות רקע מינימלי. אנו מאמינים כי ChEC-seq יהיה עמית חזק ל- CHIP, ויספק אמצעי עצמאי שבאמצעותו יאמת את ממצאי ה- CHIP-seq ויגלה תובנות חדשות לגבי הרגולציה הגנומית.
Introduction
מיפוי של אתרי קשירה של גורמי שעתוק (TFs), remodelers הכרומטין, ושאר גורמים הקשורים הרגולציה הכרומטין הוא המפתח להבנת כל התהליכים מבוססי הכרומטין. בעוד הכרומטין immunoprecipitation ו-תפוקה גבוהה רצף (שבב- seq) גישות שימשו כדי לקבל תובנות חשובות רבות בביולוגיה הגנום, יש להם מגבלות בולטות. אנחנו לאחרונה הציג שיטה חלופית, כינה מחשוב אנדוגני הכרומטין תפוקה גבוהה רצף (CHEC-seq) 1 , כדי לעקוף את החסרונות.
שבב- seq מבוצע לרוב עם צעד פורמלין מראש crosslinking (X-CHIP-seq) כדי לשמר אינטראקציות DNA- חלבון. עם זאת, מספר מחקרים שנעשו לאחרונה הצביעו על כך ש- X-CHIP-seq לוכד אינטראקציות דנ"א חולפות או בלתי ספציפיות ל- DNA , 2 , 3 , 4 , 5 <Sup>, 6 , 7 , 8 , והוליד אתרי חיוב חיוביים כוזבים. בנוסף, sonication, נפוץ לשבר הכרומטין בניסויים X- שבב seq, מועדף מזמרה אזורים של הכרומטין פתוח, המוביל התאוששות מוטה של שברי אלה אזורים 9 , 10 . Sonication גם מניב תערובת הטרוגנית של אורכי שבר, בסופו של דבר הגבלת רזולוציה האתר מחייב, אם כי תוספת של צעד עיכול exonuclease יכול לשפר באופן משמעותי את ההחלטה 11 , 12 . שיטות צ'יפ מקוריות כגון אזורים כבושים של גנומים מזיקה מטוהרים באופן טבעי בכרומטין (ORGANIC) 13 אינם משתמשים ב- crosslinking וברומטית של כרומטין עם noclease microococcal (MNase), המקלים על הטיות אפשריות הקשורות עם crosslinking פורמלדהיד ו sonication. למרות זאת,מסיסותם של חלבונים רבים הקשורים בכרומטין בתנאים הקלים יחסית הנדרשים להפקת הכרומטין היא גרועה, דבר שעלול להוביל למגוון דינמי מופחת ו / או לתשלילי שווא 14 .
בעוד שחידושים שונים של שבב- seq משמשים בדרך כלל למיפוי גנומי רחב של אינטראקציות DNA-חלבון, מספר טכניקות מיפוי המבוססות על היתוך של חלבונים בעלי עניין באנזימים שונים לשינוי דנ"א יושמו גם הם. גישה אחת כזו היא DNA adenine methyltransferase זיהוי (Damid) 15 , שבו חלבון מחייב הכרומטין של עניין הוא התמזגו גנטית לסכר ואת היתוך זה בא לידי ביטוי בתאים או בבעלי חיים, וכתוצאה מכך מתילציה של רצפים GATC הפרוקסימלי לאתרים מחייב עבור החלבון. Damid הוא יתרון בכך שהוא אינו מסתמך על immunoprecipitation ולכן נמנע crosslinking, נוגדנים, או solubilization הכרומטין. זה מתבצע גם in vivo . למרות זאת, את הרזולוציה של Damid מוגבל סולם קילובז ואת פעילות methylating של חלבון היתוך דאם הוא מכונן. שיטה שנייה המבוססת על היתוך אנזימטי היא קריאה כרטיס 16q, אשר מעסיקה היתוך של גורם של עניין טרנספוזיס, בימוי אינטגרציה ספציפית לאתר של טרנספוזונים. כמו Damid, קורא כרטיס seq אינו מבוסס על immunoprecipitation ולכן יש יתרונות דומים, עם יתרון נוסף של רזולוציה מוגברת. עם זאת, קורא כרטיס- Seq עשוי להיות מוגבל על ידי רצף הטיות של transposases והוא גם סומך על נוכחות של אתרי הגבלה קרוב אתרי ההכנסה טרנספוסון.
שיטה שלישית היתוך אנזימטית, שפותחה במעבדה Laemmli, הוא chromatin אנדוגני מחשוף (CHEC) 17 . ב CHEC, היתוך בין חלבון הקשורים הכרומטין MNase מתבטא בתאים, ועל תוספת סידן כדי להפעיל MNase, DNA הוא ביקע הפרוקסימלי לאתרים מחייב עבור מתויגגורם ( איור 1 ). בשילוב עם דרום סופג, ChEC שימש לאפיין מבנה הכרומטין וחלבון מחייב במספר loci הפרט בשמרים 17 , 18 , ו כבר בשילוב עם ניתוח microarray ברזולוציה נמוכה כדי לחקור את האינטראקציה של רכיבים נקבובית גרעינית עם שמרים הגנום 19 . ChEC מציעה הטבות דומות כמו DUMID ו Calling כרטיס SEQ, ואת הפתרון שלה הוא כמעט בסיס בסיס זוג כאשר ניתח על ידי הרחבה פריימר 19 . ChEC הוא גם controllable: חצץ DNA חזק על ידי MNase תלוי תוספת של סידן millimolar, להבטיח כי MNase אינו פעיל בריכוז סידן חינם חינם שנצפה בתאים שמרים חיים 20 .
בעבר, אנו presulated כי שילוב של CHEC עם תפוקה גבוהה רצף (ChEC-seq) יספק מפות ברזולוציה גבוהה של אתרי הקישור TF. ואכן, ChEC-seq שנוצר מפות ברזולוציה גבוהה של שמרים ניצני כללי כללי הרגולציה (GRFs) Abf1, Rap1, ו Reb1 על פני הגנום 1 . יש לנו גם ליישם בהצלחה ChEC-seq אל המתווך מודולרי מודולרי, משומר, תמלול תמלילי גלובלי חיוני 21 , להרחיב את תחולתם של CHEC-seq כדי מתחמי בגודל megadalton שאינם ישירות ליצור קשר עם ה- DNA עשוי להיות קשה למפות על ידי שבב- שיטות מבוססות. CHEC-seq היא שיטה רבת עוצמה הן עבור אימות עצמאי של תוצאות שבב- seq ו הדור של תובנות חדשות לתוך הרגולציה של תושבי הכרומטין תהליכים. כאן, אנו מציגים פרוטוקול צעד אחר צעד ליישום שיטה זו בשמרים ניצני.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הדור של זנים שמרים
- צור זן שמרים הנושאת את גורם הריבית מתויג עם MNase.
- PCR להגביר את קלטת תיוג MNase מן הרצוי וקטור ( טבלה 1 ) באמצעות תערובת התגובה שצוין ( טבלה 2 ) ותנאי רכיבה ( טבלה 3 ). מערבבים 5 μL של התגובה PCR ו 1 μL של 6X DNA לטעון צבע. הפעל כל aliquot PCR על 0.8% agarose ג'ל ב 120 V במשך 40 דקות. גודל המוצר הצפוי הוא ~ 2.3 kb.
- להפוך את קלטת תיוג מוגבר לתוך זן של בחירה באמצעות שינוי סטנדרטי ליתיום אצטט 22 ולבצע הבחירה.
- אמת את האינטגרציה הנכונה של קלטת התיוג עם המושבה PCR.
- הכן את תערובת התגובה שצוין ( טבלה 4 ) עבור מספר המושבות להיות מוקרן. שמור על הקרח עד הצורך.
- בחר חלק מכל מושבה להיות tesTed לתוך החלק התחתון של צינור PCR באמצעות קיסם קיסרי או קצה pipet.
- מיקרוגל המושבות הרים ב כוח גבוה במשך 1 דקות.
- הוסף 50 μL של תערובת PCR ( טבלה 4 ) לכל מושבה microwaved ו pipet מעלה ומטה כדי לערבב. בצע את ה- PCR באמצעות תנאי האופניים שצוין ( טבלה 5 ).
- מערבבים את μL 50 של תגובה PCR ו 10 μL של 6X DNA לטעון צבע ישירות בצינור כל PCR. הפעל 10 μL של כל מדגם על ג'ל agarose 1% ב 120 V במשך 40 דקות. גודל המוצר הצפוי הוא ~ 700 bp.
הערה: אם תרצה, לאמת ביטוי מתאים של חלבון היתוך MNase באמצעות סופג המערבי. A ~ 20.6 קילודלטון שינוי המשקל המולקולרי של חלבון מתויג צפוי.
- יצירת זן MNase חינם על ידי שיבוט מבוסס הומולוגיה של היזם של הגן של עניין לתוך pGZ136 (טבלה 1) ואת השינוי ואת הבחירה כמו בשלב 1.1.2.
- אלטרנטיביVely, להרכיב את היזם של הגן של עניין ו 3xFLAG-MNase-SV40 NLS לתוך וקטור פלסמיד, להפוך ולבחור כמו בשלב 1.1.2, ולהגדיל את הלחץ במצב סלקטיבי המתאים לתחזוקה של הפלסמיד.
2. ChEC
- בצהריים / ערב של היום לפני הניסוי ChEC, לחסן 3 מ"ל שמרים- peptone-dextrose (YPD) או בינוני סלקטיבי המתאים עם מושבה אחת של זן הנושא את MNase- מתויג גורם. דגירה זו תרבות לילה (180 סל"ד רועד, 30 מעלות צלזיוס).
- בבוקר של יום הניסוי ChEC, לדלל את התרבות לילה לתוך 50 מ"ל של מדיום לצפיפות אופטית ב 600 ננומטר (OD 600 ) של 0.2-0.3. דגירה זו תרבות (180 סל"ד רועד, 30 מעלות צלזיוס) עד שהוא מגיע OD 600 של 0.5-0.7. כאשר התרבות מתקרב OD 600 מתאים, להגדיר בלוק חום או אמבט מים ל 30 מעלות צלזיוס ולהתחיל להפשיר המאגר תוספים ( Ta6).
- הכן 5 מ"ל של המאגר תוספים פלוס ( טבלה 6 ) לכל תרבות. שמור על המאגר ב RT במהלך ההליך.
- הכן צינורות microfuge המכיל 90 μL של פתרון להפסיק ( טבלה 7 ) ו 10 μL של 10% SDS עבור כל נקודת זמן כדי לאסוף. עבור כל גורם חדש ניתח, לקחת דוגמאות ב 0 s, 30 s, 1 דקות, 2.5 דקות, 5 דקות, ו 10 דקות.
- תרבות למזוג לתוך צינור חרוטי 50 מ"ל ו צנטריפוגות ב 1500 xg וטמפרטורת החדר (RT) במשך 1 דקות.
- תאים resuspend ביסודיות 1 מ"ל של מאגר A ולהעביר את התאים resuspended לצינור microfuge. גלולה resuspended תאים microfuge ב 1500 xg ו RT במשך 30 s.
- לשאוב supernatant ו resuspend ביסודיות תאים 1 מ"ל של הצפת על ידי pipetting למעלה ולמטה. גלולה resuspended תאים microfuge ב 1500 xg ו RT במשך 30 s. חזור על שלב זה פעם אחת.
- תאים resuspend ביסודיות μL 570 של מאגר א הוסף 30 μL של digitonin 2%(0.1% ריכוז סופי) כדי לאפשר permeabilization של התאים, וכן להפוך לערבב.
- תאים Permeabilize בלוק חום או אמבט מים ב 30 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
- Pipet התגובה למעלה ולמטה כדי להבטיח הפצה אפילו של תאים. הסר aliquot 100 μL של תאים permeabilized כמו שליטה שלילית לצינור microfuge המכיל פתרון להפסיק ו SDS (שלב 2.4) ו מערבולת בקצרה לערבב.
- הוסף 1.1 μL של 1 M CaCl 2 (2 מ"מ ריכוז סופי) לתאים permeabilized להפעיל MNase ולהפוך כמה פעמים במהירות או מערבולת בקצרה לערבב. מיד להחזיר את התגובה המעורבת ב 30 מעלות צלזיוס ולהתחיל טיימר.
- בכל נקודת זמן כדי לאסוף, pipet התגובה מעלה ומטה כדי להבטיח הפצה אפילו של תאים, ולאחר מכן להסיר aliquot 100 μL של תאים permeabilized לצינור microfuge המכיל פתרון לעצור SDS ו מערבולת בקצרה לערבב. עבור כל גורם חדש ניתח, לקחת 0 (לא הוסיף CaCl 2 ), 30 s, 1 דקות, 2.5 דקות, 5 דקות ו 10 דקות נקודות זמן.
הערה: ניסויים ChEC עם גורמים לדקלם במהירות DNA ב 30 מעלות צלזיוס יכול להתבצע בטמפרטורות נמוכות יותר להאט MNase מחשוף קינטיקה. - לאחר כל נקודות הזמן נאספו, להוסיף 4 μL של 20 מ"ג / מ"ל proteinase K לכל מדגם, מערבולת בקצרה לערבב, ו דגירה על 55 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
- הוסף 200 μL של 25: 24: 1 פנול: כלורופורם: אלכוהול isoamyl על כל מדגם, מערבולת במרץ לערבב, צנטריפוגה במהירות מקסימלית RT ב microfuge למשך 5 דקות.
- הסר כל שלב מימית (~ 150 μL) לצינור חדש. הוסף 30 מיקרוגרם של גליקוגן 500 μL של אתנול 100%. וורטקס במרץ לערבב ו להאיץ על קרח יבש במשך 10 דקות או עד הפתרון הוא צמיג.
- גלולה דנ"א זירז במהירות מקסימלית ו 4 מעלות צלזיוס microfuge למשך 10 דקות.
- Supernatants למזוג ולשטוף כדורי עם 1 מ"ל של אתנול RT 70%.
- מוריד אתנול, הסרת שאר על ידי הפיכת אדבק בעדינות בצינורות על מגבת נייר. דגימות ספין בקצרה באמצעות צנטריפוגה benchtop ולהשתמש פיפטה כדי להסיר אתנול שיורית, נזהר לא להפריע גלולה. אוויר יבש כדורי עבור ב RT במשך 5 דקות.
- בעוד כדורי ייבוש, לעשות תערובת אב resuspend כדורי מיובשים ב 29 μL של Tris, pH 8.0 + 1 μL של 10 מ"ג / מ"ל RNase כל אחד. Digest RNA ב 37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.
- מערבבים 1 μL של 6X DNA לטעון צבע עם 5 μL של כל מדגם ולהפעיל על ג'ל agarose 1.5% ב 120 V במשך 40 דקות.
3. בחירת גודל
הערה: המטרה של בחירת גודל היא להסיר שברי multobase של DNA גנומי מן המדגם להיות רצף ולהעשיר שברי ~ 150 bp (בערך בגודל של DNA גרעיני) או קטן יותר. ב נתונים רצף, שברי <400 BP מועשרים, עם שיא ראוי לציון סביב בגודל של DNA נוקלאוזומלי (~ 150 BP) ו שיא או הפצה רחבה של שברי subnucleosalal.
<Ol>הערה: ניתוח נתונים ChEC-seq הוא הליך מורכב מעבר להיקף של מאמר זה. מידע מפורט על ניתוח נתונים ניתן למצוא בפרסומים קודמים 1 , 21 , ואת סקריפטים מותאמים אישית המשמשים לניתוח זמינים ב GitHub (https://github.com/zentnerlab/chec-seq). HOMER 25 (http://homer.salk.edu) יכול לשמש גם עבור ניתוח שורת הפקודה של נתונים ChEC-seq.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
במקרה של ניסוי מוצלח של ה- CHEC, אנליזה של דנ"א על-ידי אלקטרופורזה agarose ג'ל יגלה גידול תלוי סידן ב-שבר עודף DNA, כפי שצוין על ידי מריחה ו בסופו של דבר העיכול המלא של DNA גנומי. במקרים מסוימים, סולם של להקות דומות לזה שנראה עם עיכול MNase המסורתית הוא ציין לאחר העיכול המורחבת. זה המקרה של ניתוח CHEC של Reb1, גורם רגולציה כללי שקושר נוקלאוזום, מדולדל אזורים (NDRs) ( איור 2 ). מצאנו, במקרה של GRFs, העיכול המורחב מוביל לאובדן אות במהירות על אתרי מחורצים 1 . באופן אידיאלי, מדגם עם הפחתה בגודל של הלהקה DNA הגנומי המציג גבוהה משקל מולקולרי מריחה, כגון 30 שניות ו 1 דקות נקודות עבור Reb1 ChEC, ישמש רצף כדי למנוע אובדן זמן תלויי האות .
He.within-page = "1"> ויזואליזציה של קטע מסתיים מ הניסוי Reb1 ChEC-seq מגלה העשרה חזקה של Reb1 על רקע נגזר הן זן Reb1-MNase ללא סידן הוסיף זן MNase חינם לאחר משך שווה של חינם סידן טיפול (30) ( איור 3 ). כמו כן, אנו רואים מחיצות DNA משמעותי על ידי היתוך של המתווך יחידת משנה Med8 עם MNase, אבל לא MNase חינם מונע על ידי האמרגן MED8 , 1 דקות לאחר תוספת סידן ( איור 3 ).
כדי להשוות את נתוני ה- CHEC-Seq של Reb1 ל- CHIP-seq, השגנו רשימה של 1,991 פסגות Reb1 שנקבעו על ידי ORGANIC 13 . פסגות אלה היו מוטיב ממוקד עם ספירת בסוף קטע הממוצע בכל עמדה בסיס בחלון 100 BP סביב נקודת המוטיב. צפינו באסימטריה בולטת בחשוף, כשרוב החלקים מסתיים במיפוי אל הצד במעלה של המוטיב ( איור 4 ).
איור 1 : סכמטי של שיטת ה- CHEC-seq. כרומטין הקשורים חלבון (CAP) -Mase היתוך מתבטא תאים שמרים. החלבון נקשר לדנ"א אך אינו יוצר מחשוף מעל רמות הרקע בשל הסידן החופשי הנמוך ביותר בגרעין. עם permeabilization של תאים עם digitonin ו תוספת של סידן millimolar, FAPions CAP-MNase קשור הגנום לדקלם DNA, משחרר שברי קטן. שברים אלה הם מטוהרים מכן, רצף, ממופה חזרה לגנום, נותן פסגות של קצוות מסתיים הפרוקסימלי לאתרים מחייב עבור היתוך CAP-MNase. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
יחד .within-page = "1"> 
איור 2 : Agarose ג'ל אלקטרופורזה של DNA מ Reb1 ChEC ניסוי. 5 aliquot μL של ה- DNA מכל נקודת זמן ChEC ניתח על ג'ל 1.5% TAE-agarose לפני בחירת גודל. זה מראה עיכול פרוגרסיבי של DNA גנומי על ידי היתוך Reb1-MNase. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3 : גנום דפדפן Snapshots של Reb1-MNase ו MNase חינם MECase ניסויים. IGV תצוגות של האות בסוף קטע עבור Reb1 חינם MNase CHEC-seq 30 s לאחר תוספת סידן ו Med8 חינם MNase CHEC-seq 1 דקות af תוספת סידן לאורך קטע מייצג של הגנום שמרים. מערכי הנתונים מנורמל על ידי חלוקת מספר קצוות שברי הממופה לכל מיקום בסיס על ידי המספר הכולל של קצוות מסתיים ממופה והכפלת על ידי המספר הכולל של בסיסים ממופה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4 : העשרה של שברים שפורסמו על ידי Reb1-MNase מסתיימת סביב אתרים אורגניים של Reb1. חלקה ממוצעת של 30 s Reb1 ו MNase חינם ChEC-Seq קטע סוף האות סביב 1,991 מוטיבים Reb1 שנקבעו על ידי אורגני 13 . הנתונים מנורמל כמו באיור 3 . Lank "> אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
| פלסמיד | סמן לבחירה שמרים | הערות | מספר פלסמיד |
| PGZ108 | KanMX6 | 3xFLAG-MNase תיוג, 33 aa מקשר | 70231 |
| PGZ109 | HIS3MX6 | 3xFLAG-MNase תיוג, 33 aa מקשר | 70232 |
| PGZ110 | TRP1 | 3xFLAG-MNase תיוג, 33 aa מקשר | 70233 |
| PGZ136 | URA3 | מבטא 3xFLAG-MNase-SV40 NLS תחת שליטה של האמרגן REB1 | 72273 |
| PGZ173 | KanMX6 | תיוג MNase, 8 aa מקשר | 70234 |
Ithin-page = "1"> טבלה 1: פרטים על פלסמידים של ChEC. כל תיוג ווקטורים מבוססים על וקטורים pFA6a ולכן הם תואמים את F2 נפוץ F1 / R1 תיוג זוגות. קלטת התיוג מורכבת ממקשר באורך המצוין, אפיטופ 3xFLAG כדי להקל על איתור על ידי סופג המערבי (למעט במקרה של pGZ173, שם המקשר כבר מקוצר כדי להסיר את התג 3xFLAG), שרשרת בוגרת של MNase (GenBank P00644 , Aa 83 - 231), ואת סמן לבחירה הצביע.
| מֵגִיב | כֶּרֶך | [סופי] |
| חיץ 5x PCR | 10 מ"ל | 1x (2 מ"מ MgCl 2 ) |
| 10 mM dNTP לערבב (2.5 מ"מ כל dNTP) | 1 מ"ל | 200 מ"מ (50 מ"מ כל dNTP) |
| 10 מ"מ פריימר F2 | 2.5 מ"ל | 0.5 מ"מ |
| 10 מ"מ R1 עמ 'Rimer | 2.5 מ"ל | 0.5 מ"מ |
| PGZ108 / 109/110/172 (1-5 ng / mL) | 1 מ"ל | |
| 2 U / μL להתחיל חם פולימרז נאמנות גבוהה | 0.5 מ"ל | / Wrote |
| DDH 2 O | 32.5 מ"ל |
טבלה 2: תגובה תערובת עבור הגברה PCR של קלטות 3xFLAG-MNase תיוג. F2 / R1 רצפים תחל ניתן למצוא בכתובת http://yeastgfp.yeastgenome.org/yeastGFPOligoSequence.txt.
| טמפרטורה (° C) | זְמַן | מחזורים |
| 98 | 30 שניות | 1 |
| 98 | 10 s | 25 |
| 55 | 30 s | 25 |
| 72 1 דקות 15 s | 25 | |
| 72 | 2 דקות | 1 |
| 10 | לָנֶצַח | לְהַחזִיק |
טבלה 3: תנאי רכיבה תרמיים עבור הגברה PCR של קלטות תיוג 3xFLAG-MNase. הטמפרטורה הדגירה זמן ההארכה ייתכן שיהיה צורך להתאים על בסיס פולימראז DNA בשימוש.
| מֵגִיב | כֶּרֶך | [סופי] |
| חיץ 10x Taq | 5 מ"ל | 1x (1.5 מ"מ MgCl 2 ) |
| 10 mM dNTP לערבב (2.5 מ"מ כל dNTP) | 1 מ"ל | 200 מ"מ (50 מ"מ כל dNTP) |
| 10 מ"מ בדוק פריימר | 1 מ"ל | 0.2 מ"מ |
| 10 מ"מ MNase-R או פריימר שליטה שלילית | 1 מ"ל | 0.2 מ"מ |
| 5 U / מ"ל פולימרז Taq | 0.5 מ"ל | 2.5 U |
| DDH 2 O | 41.5 מ"ל |
טבלה 4: תערובת התגובה המושבה PCR אישור תיוג MNase. בדוק רצפים תחל ניתן למצוא בכתובת http://yeastgfp.yeastgenome.org/yeastGFPOligoSequence.txt. פריימר הסימון משמש כפריימר קדימה יחד עם פריימר הפוך בתוך MNase (5'-TTGTGCAGCTTCTTGGTAC-3 ') ופריימר הפוך ~ 500 זוגות (bp) במורד הזרם של הגן המתאים כבקרה שלילית.
| טמפרטורה (° C) | זְמַן | מחזורים |
| 95 | 5 דקות | 1 |
| 95 | 30 s | 35 |
| 55 | 30 s | 35 |
| 68 | דקה 1 | 35 |
| 68 | 5 דקות | 1 |
| 10 | לָנֶצַח | לְהַחזִיק |
טבלה 5: תנאי רכיבה תרמית עבור המושבה PCR אישור תיוג MNase. הטמפרטורה הדגירה זמן ההארכה ייתכן שיהיה צורך להתאים על בסיס פולימראז DNA בשימוש.
| מֵגִיב | כֶּרֶך | [סופי] |
| 1 M Tris, pH 7.5 | 1.5 מ"ל | 15 מ"מ |
| 1 M KCl | 8 מ"ל | 80 מ"מ |
| 0.2 M EGTA | 50 מ"ל | 0.1 מ"מ |
| DDH 2 O | מלאו עד 100מ"ל |
טבלה 6: מתכון למאגר א לפני השימוש, להוסיף מחצית מעכב מעכב פרוטאז, 50 μL של 100 מ"מ PMSF (1 מ"מ הסופי), 5 μL של 200 מ"מ spermine (0.2 מ"מ הסופי), ו 2.5 μL של 1 M Spermidine (0.5 מ"מ הסופי) לכל 5 מ"ל של פתרון.
| מֵגִיב | כֶּרֶך | [סופי] |
| 5 M NaCl | 8 מ"ל | 400 מ"מ |
| 0.5 M EDTA | 4 מ"ל | 20 מ"מ |
| 0.2 M EGTA | 2 מ"ל | 4 מ"מ |
| DDH 2 O | מלאו עד 100 מ"ל |
טבלה 7: מתכון לפתרון עצירת 2x. שלב 90 μL של סטוP עם 10 μL של SDS 10% בצינור microfuge עבור כל נקודת זמן להילקח (ראה שלב 2.4).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הראינו כי ChEC יכול למפות שיעורים שונים של חלבונים שמרים על הכרומטין, ולצפות כי יהיה זה ישים באופן רחב על משפחות שונות של TFs אחרים הכרומטין מחייב גורמים בשמרים. CHEC-seq הוא יתרון בכך שהוא אינו דורש crosslinking, solobilization הכרומטין, או נוגדנים. לפיכך, ChEC נמנע חפצים עשויים להיות נוכח X- שבב- seq, כגון חפץ היפר ChIPable 3 , 4 , ו CHIP יליד, כגון שליליות שווא בשל solobilization חלבון שלם 14 . החיסרון העיקרי של CHEC-seq, כמו עם כל שיטות היתוך אנזימטית, היא הדרישה חלבון היתוך. זה יכול להיות מושגת במהירות נביטה שמרים, אבל הוא יותר מייגע metazoans. מגבלה נוספת של CHEC-seq היא כי זה לא יכול להיות מיושם כמו הוא עבור פרופיל של שינויים היסטון. עם זאת, ניתן להתאים את תחום החיבור לשינוי ל- MNase ולהביע, לאפשר hאיזון שינוי מיפוי עם CHEC-seq. ברוח זו, שבב- seq באמצעות epitope- מתויג היסטון שינוי תחומים מחייב שימש למפות דפוסי רחב הגנום של שינוי היסטון 26 .
השימוש בשליטה MNase חופשי חשוב בהקמת הספציפיות של תוצאות ChEC-seq. זן MNase חופשי נושאת MNase מתויג עם 3xFLAG ו וירוס סימיאן 40 לוקליזציה גרעיני האות (SV40 NLS) תחת שליטתו של האמרגן אנדוגני עבור הגן של עניין. היא דומה באופן קונספטואלי לבקרת הסכר הבלתי מנוצלת ששימשה במחקרים של DMID 27 ובקרות לחיתוך לא ספציפי בשל נגישות הכרומטין. כמו שליטה MNase חינם עבור TF CHEC-seq, שילבנו 3xFLAG-MNase-SV40 NLS מונע על ידי מקדם REB1 ב loca ura3 1 . עבור המתווך ChEC-seq, הבנו 3xFLAG-MNase-SV40 NLS תחת שליטה של האמרגן MED8 ב פלזמה שאינה משולבתוקטור מתוחזק בינוני סלקטיבי 21 . בשני המקרים, מעט מאוד מחשוף על ידי MNase חינם נצפתה. לפיכך, זן שליטה יחיד שבו 3xFLAG-MNase-SV40 NLS מונע על ידי מקדם חזקים יחסית צריך להיות מתאים עבור רוב הניסויים.
כאשר מתכננים ניסוי ChEC, שיקול מבניים של חלבון של עניין עשוי להיות חשוב. לדוגמה, מצאנו כי צירוף MNase אל C- הטרמינל של Reb1 נתן תבנית מחשוף אסימטרי סביב מוטיבים Reb1, בעוד הביטוי של Reb1 עם N- מסוף MNase נתן דפוס מחשוף סימטרי 1 . אנו מייחסים דפוסים שונים אלה מחשוף למבנה של Reb1. דנה מחייב את התחום של Reb1 ממוקם ב C- מסוף; לפיכך, ה- C- הטרמינל הוא מובנה וקרוב DNA, הגבלת טווח התנועה של MNase ורק המאפשר C- המחשוף מסוף. לעומת זאת, הטרמינל C של Abf1 הוא בלתי מובנה יחסית ולכן יכול לפעול להגדלהלהגיע MNase, המאפשרים מחשוף משני צידי אתרי הכריכה Abf1. במקרה של Rap1, עוד שמרים GRF, מצאנו כי קיצור המקשר בין C- מסוף MNase בין 33 ל 8 aa היה מספיק כדי להפחית באופן חמור מחשוף, אולי בשל המרחק המוצע של החלק C- מסוף של Rap1 מ דנ"א 28 . שיקול מבני כזה עשוי להיות חשוב גם כאשר ינסו למפות את הכריכה של חלבונים הנמצאים במכלול גדול. עבור ניתוח CHEC-seq של המתווך מחייב את הגנום שמרים 21 , בחרנו יחידות משנה אשר C- Termini נבחנו מבנית להיות חשופים, ולא נקבר בתוך המתחם. מתוך שלוש היחידות המתמזגות ל- MNase, אחת מהן לא הדביקה את הדנ"א בצורה חזקה, דבר המצביע על כך שאילוצים סטריים, או אינטראקציות עם גורמים אחרים המחייבים דנ"א, הפחיתו את מחשוף הדנ"א.
מצאנו כי CHEC-seq מזהה 4-12 פעמים פסגות יותר עבור שמרים GRFs Abf1, Rap1, ר1 מאשר צ 'יפס שונים גישות כאשר כל נקודות הזמן נחשבו יחד 1 . אתרים אלה יכול להיות מחולק לשני סוגים המבוססים על קינטיקה mNase מחשוף. ניתוח נתונים CHEC-seq עבור שמרים GRFs חשף שני סוגים שונים של אתרים מחייב 1 . הראשון, המכונה "מהיר", הציג מחשוף מקסימלי <1 דקות לאחר תוספת סידן בדרך כלל המכיל התאמות חזקות מוטיבים קונצנזוס ידוע. השני, המכונה "איטי", לקח כמה דקות כדי להגיע רמות ניכר של מחשוף ו היו מדולדלים של מוטיבים התאמות. שני הכיתות של האתרים היו, בממוצע, מועשר עבור מחייב במערכי שבב, אם כי הם לא בהכרח נקראים פסגות במחקרים אלה צ'יפ. רוב האתרים עבור גורם נתון היו אתרים איטיים. אנו משערים כי אתרים מהירים הם מייצגים של זיקה גבוהה זיקה גורם מחייב אתרים, בעוד אתרים איטיים מייצגים לוקלי transiently שנדגמו במהלך סריקת האתר מחייב. האובServation של שני סוגים של אתרי מחייב מופרדים על ידי הקינטיקה של מחשוף MNase עשוי להסביר את התצפית ב datasets שבב רבים שבב כי מספר גדול של פסגות עבור גורם נתון עם קביעה מבוססת היטב DNA מחייב אינם מכילים מוטיב קונצנזוס 29 : פורמלדהיד crosslinking, מבוצע במשך 10-15 דקות ברוב פרוטוקולי שבב, יכול שוב ושוב ללכוד אינטראקציות חולף או אופורטוניסטי של גורם עם הגנום, המוביל האינפלציה של האות. ואכן, השוואה של צ'יפ אקסו והדמיה תא חי עולה כי זה המקרה 2 . יש לציין כי לא ראינו ירידה דרמטית בזמן תלויית אותות של מתווך CHEC-seq 21 , עם אות מגשר CHEC-seq קבוע יחסית מ -30 שניות ל -20 דקות. בהתחשב בתצפיות אלה, אנו ממליצים לבצע קצר ChEC-Seq משך להתאושש גבוהה אמון אתרים מחייבים.
אנו צופים כי CHEC-seq יכול להיות מותאם שאינם שמריםמערכות. הריכוז של סידן חופשי בתאים יונקים unstimulated הוא 50-300 ננומטר 30 , 32 , הרבה מתחת לסף עבור הפעלה יעילה MNase. הצעד המגביל להקמת CHEC-Seq במערכות מטאזאוניות הוא אפוא הדור של חלבונים היתוך, אשר נשאר הרבה יותר מייגע מטאזית מאשר תאים שמרים. עם זאת, תיוג אנדוגני של גנים מטאזואנים הוקל מאוד על ידי הופעתה של הנדסה גנומית מבוסס CRISPR 33 , ולכן הגבלה זו צריכה להיות overmonted בקלות. לחלופין, חלבונים היתוך MNase יכול לבוא לידי ביטוי ברמות נמוכות מ פלסמידים. גישה זו הייתה מוצלחת למדי עבור Damid ב תסיסנית 34 , 35 ו 36 תאים אנושיים ולכן עשוי גם להקל על CHEC-seq בתאי metazoan.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
אנו מודים למוסטפה סאלח ולג'יי טוריגני על קריאה ביקורתית של כתב היד וסטיבן האן וסטיבן הניקוף על הדרכה ותמיכה במהלך הפיתוח של CHEC-seq ויישומה למתווך המתווך. SG נתמך על ידי מענקים NIH R01GM053451 ו R01GM075114 ו GEZ נתמך על ידי קרנות ההפעלה של אוניברסיטת אינדיאנה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| dNTPs | NEB | N0447 | |
| Q5 high-fidelity DNA polymerase | NEB | M0491L | Other high-fidelity DNA polymerases, such as Phusion, may be used for cassette amplification. |
| TrackIt 1 Kb Plus DNA ladder | ThermoFisher Scientific | 10488085 | |
| Taq DNA polymerase | NEB | M0273L | |
| cOmplete Mini EDTA-free protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | 11836170001 | It is important that an EDTA-free protease inhibitor mix is used, so as not to inhibit MNase cleavage by chelation of Ca2+. |
| PMSF | ACROS Organics | AC215740010 | |
| Digitonin, High Purity | EMD Millipore | 300410-250MG | Make a 2% stock by dissolving 20 mg digitonin in 1 mL DMSO with vigorous vortexing. |
| Proteinase K, 20 mg/mL | Invitrogen | 25530049 | |
| RNase A, 10 mg/mL | ThermoFisher Scientific | EN0531 | |
| Ampure XP beads | Beckman Coulter | A63880 | Ampure-like beads can be generated using a published protocol (ref 24). |
| MagneSphere magnetic rack | Promega | Z5342 |
References
- Zentner, G. E., Kasinathan, S., Xin, B., Rohs, R., Henikoff, S. ChEC-seq kinetics discriminates transcription factor binding sites by DNA sequence and shape in vivo. Nat Commun. 6, 8733 (2015).
- Chen, J., et al. Single-Molecule Dynamics of Enhanceosome Assembly in Embryonic Stem Cells. Cell. 156 (6), 1274-1285 (2014).
- Teytelman, L., Thurtle, D. M., Rine, J., van Oudenaarden, A. Highly expressed loci are vulnerable to misleading ChIP localization of multiple unrelated proteins. Proc Natl Acad Sci USA. 110 (46), 18602-18607 (2013).
- Park, D., Lee, Y., Bhupindersingh, G., Iyer, V. R. Widespread Misinterpretable ChIP-seq Bias in Yeast. PLoS ONE. 8 (12), 83506 (2013).
- Jain, D., Baldi, S., Zabel, A., Straub, T., Becker, P. B. Active promoters give rise to false positive 'Phantom Peaks' in ChIP-seq experiments. Nucleic Acids Res. , (2015).
- Krebs, W., et al. Optimization of transcription factor binding map accuracy utilizing knockout-mouse models. Nucleic Acids Res. 42 (21), 13051-13060 (2014).
- Paul, E., Zhu, Z. I., Landsman, D., Morse, R. H. Genome-Wide Association of Mediator and RNA Polymerase II in Wild-Type and Mediator Mutant Yeast. Mol Cell Biol. 35 (1), 331-342 (2015).
- Worsley Hunt, R., Wasserman, W. W. Non-targeted transcription factors motifs are a systemic component of ChIP-seq datasets. Genome Biol. 15 (7), 412 (2014).
- Vega, V. B., Cheung, E., Palanisamy, N., Sung, W. -K. Inherent Signals in Sequencing-Based Chromatin-ImmunoPrecipitation Control Libraries. PLoS ONE. 4 (4), 5241 (2009).
- Teytelman, L., et al. Impact of Chromatin Structures on DNA Processing for Genomic Analyses. PLoS ONE. 4 (8), 6700 (2009).
- Rhee, H. S., Pugh, B. F. Comprehensive Genome-wide Protein-DNA Interactions Detected at Single-Nucleotide Resolution. Cell. 147 (6), 1408-1419 (2011).
- He, Q., Johnston, J., Zeitlinger, J. ChIP-nexus enables improved detection of in vivo transcription factor binding footprints. Nat Biotech. 33 (4), 395-401 (2015).
- Kasinathan, S., Orsi, G. A., Zentner, G. E., Ahmad, K., Henikoff, S. High-resolution mapping of transcription factor binding sites on native chromatin. Nat Methods. 11 (2), 203-209 (2014).
- Skene, P. J., Hernandez, A. E., Groudine, M., Henikoff, S. The nucleosomal barrier to promoter escape by RNA polymerase II is overcome by the chromatin remodeler Chd1. eLife. 3, 02042 (2014).
- Aughey, G. N., Southall, T. D. Dam it's good! DamID profiling of protein-DNA interactions. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 5 (1), 25-37 (2016).
- Wang, H., Mayhew, D., Chen, X., Johnston, M., Mitra, R. D. Calling Cards enable multiplexed identification of the genomic targets of DNA-binding proteins. Genome Res. 21 (5), 748-755 (2011).
- Schmid, M., Durussel, T., Laemmli, U. K. ChIC and ChEC: Genomic Mapping of Chromatin Proteins. Mol Cell. 16 (1), 147-157 (2004).
- Merz, K., et al. Actively transcribed rRNA genes in S. cerevisiae are organized in a specialized chromatin associated with the high-mobility group protein Hmo1 and are largely devoid of histone molecules. Genes Dev. 22 (9), 1190-1204 (2008).
- Schmid, M., et al. Nup-PI: The Nucleopore-Promoter Interaction of Genes in Yeast. Mol Cell. 21 (3), 379-391 (2006).
- Dunn, T., Gable, K., Beeler, T. Regulation of cellular Ca2+ by yeast vacuoles. J Biol Chem. 269 (10), 7273-7278 (1994).
- Grünberg, S., Henikoff, S., Hahn, S., Zentner, G. E. Mediator binding to UASs is broadly uncoupled from transcription and cooperative with TFIID recruitment to promoters. The EMBO Journal. 35 (22), 2435-2446 (2016).
- Gietz, R. D., Schiestl, R. H. High-efficiency yeast transformation using the LiAc/SS carrier DNA/PEG method. Nat. Protocols. 2 (1), 31-34 (2007).
- Rohland, N., Reich, D. Cost-effective, high-throughput DNA sequencing libraries for multiplexed target capture. Genome Res. 22 (5), 939-946 (2012).
- Orsi, G. A., Kasinathan, S., Zentner, G. E., Henikoff, S., Ahmad, K. Mapping regulatory factors by immunoprecipitation from native chromatin. Current protocols in molecular biology. Ausubel, F. M., et al. 110, 21-25 (2015).
- Heinz, S., et al. Simple Combinations of Lineage-Determining Transcription Factors Prime cis-Regulatory Elements Required for Macrophage and B Cell Identities. Mol Cell. 38 (4), 576-589 (2010).
- Kungulovski, G., et al. Application of histone modification-specific interaction domains as an alternative to antibodies. Genome Res. 24 (11), 1842-1853 (2014).
- Vogel, M. J., Peric-Hupkes, D., van Steensel, B. Detection of in vivo protein-DNA interactions using DamID in mammalian cells. Nat. Protocols. 2 (6), 1467-1478 (2007).
- Feeser, E. A., Wolberger, C. Structural and Functional Studies of the Rap1 C-Terminus Reveal Novel Separation-of-Function Mutants. J Mol Biol. 380 (3), 520-531 (2008).
- Neph, S., et al. An expansive human regulatory lexicon encoded in transcription factor footprints. Nature. 489 (7414), 83-90 (2012).
- Mountjoy, K. G., Kong, P. L., Taylor, J. A., Willard, D. H., Wilkison, W. O. Melanocortin receptor-mediated mobilization of intracellular free calcium in HEK293 cells. Physiol Genomics. 5 (1), 11-19 (2001).
- Seurin, D., Lombet, A., Babajko, S., Godeau, F., Ricort, J. -M. Insulin-Like Growth Factor Binding Proteins Increase Intracellular Calcium Levels in Two Different Cell Lines. PLoS ONE. 8 (3), e59323 (2013).
- Grienberger, C., Konnerth, A. Imaging Calcium in Neurons. Neuron. 73 (5), 862-885 (2012).
- Sander, J. D., Joung, J. K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nat Biotech. 32 (4), 347-355 (2014).
- Filion, G. J., et al. Systematic Protein Location Mapping Reveals Five Principal Chromatin Types in Drosophila Cells. Cell. 143 (2), 212-224 (2010).
- van Bemmel, J. G., et al. A Network Model of the Molecular Organization of Chromatin in Drosophila. Mol Cell. 49 (4), 759-771 (2013).
- Izzo, A., et al. The Genomic Landscape of the Somatic Linker Histone Subtypes H1.1 to H1.5 in Human Cells. Cell Rep. 3 (6), 2142-2154 (2013).
