Summary
हम क्रोमेटिन के अंतर्जात दरार का वर्णन करते हैं जो उच्च-थ्रूपुट अनुक्रमण (सीईसी-सीईसी), एक क्रोमैटिन इम्युनोपेरेग्रेशन (चिप) -मोनोकोकल न्युकलेज़ (एमएनएस) संलयन प्रोटीन के साथ जीनोम चौड़ा प्रोपटीन बाध्यकारी साइटों के मानचित्रण के लिए वैकल्पिक विधि के साथ जुड़ा हुआ है।
Abstract
जीन विनियमन, क्रोमेटिन रीमॉडेलिंग, और अन्य क्रोमैटिन-निवासी प्रक्रियाओं को समझने के लिए प्रोटीन-डीएनए बातचीत का जीनोम-विस्तृत मैपिंग महत्वपूर्ण है। क्रोमेटिन इम्युनोपेरेजिशन और उच्च-थ्रूपुट अनुक्रमण (एक्स-चिप-सेक) के बाद फार्मलाडेडाइड क्रॉटलिंकिंग का उपयोग जीनोम जीव विज्ञान में कई महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि हासिल करने के लिए किया गया है। हालांकि, एक्स-चिप-सेक में उल्लेखनीय सीमाएं हैं जो क्रॉस्लिंकिंग और सोोनिकेशन से जुड़े हैं। स्थानीय चिप पारस्परिक संबंध को छोड़कर इन कमियों से बचा जाता है, लेकिन अक्सर क्रोमैटिन-बाध्य प्रोटीन की खराब वसूली में परिणाम होता है। इसके अलावा, सभी चिप आधारित तरीकों एंटीबॉडी गुणवत्ता विचारों के अधीन हैं। डीएनए संशोधित एंजाइम के लिए प्रोटीन-डीएनए इंटरैक्शन मैप करने के लिए एंजाइमेटिक विधियों, जिसमें ब्याज की एक प्रोटीन का मिश्रण शामिल है, प्रोटीन-डीएनए इंटरैक्शन को मैप करने के लिए भी इस्तेमाल किया गया है। हमने हाल ही में एक ऐसी विधि, क्रोमैटिन अंतर्जात दरार (सीईसी) को जोड़ दिया है, जिसमें सीईसी-सीईक के रूप में उच्च-थ्रुपुट अनुक्रमण शामिल हैं। सीईसी-सीईसी क्रोमेटिन-एशॉक के संलयन पर आधारित हैजीवित कोशिकाओं में कैल्शियम की उपस्थिति में लक्षित डीएनए दरार उत्पन्न करने के लिए माइक्रोकोकल न्युकेलेज (एमएनस) के लिए ब्याज की मीटेड प्रोटीन। सीईसी-सीईक इम्युनोपेरेग्रेशन पर आधारित नहीं है और इसलिए कम पृष्ठभूमि संकेत के साथ उच्च रिज़ॉल्यूशन मैपिंग प्रदान करते हुए क्रॉस-लिंकिंग, बायोमेसन, क्रोमैटिन सोल्यूबिलाइज़ेशन और एंटीबॉडी की गुणवत्ता के साथ संभावित चिंताओं को खारिज करता है। हम यह सोचते हैं कि चईईसी-सीईक चिप के लिए एक शक्तिशाली समकक्ष होगा, जो एक स्वतंत्र साधन प्रदान करता है जिससे दोनों को चिप-सेक निष्कर्षों को मान्य किया जा सकता है और जीनोमिक विनियमन में नई अंतर्दृष्टि मिल सकती है।
Introduction
प्रतिलेखन कारकों (टीएफएस), क्रोमेटिन रिमोडेलर्स और अन्य क्रोमैटिन-संबंधित नियामक कारकों की बाध्यकारी साइटें मैप करना सभी क्रोमेटिन-आधारित प्रक्रियाओं को समझने की कुंजी है। जबकि क्रोमैटिन इम्युनोपेरेजिशन और हाई-थ्रिप्ट अनुक्रमण (चिप-सेक) दृष्टिकोण का उपयोग जीनोम जीव विज्ञान में कई महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि हासिल करने के लिए किया गया है, लेकिन उनके पास उल्लेखनीय सीमाएं हैं। हमने हाल ही में एक वैकल्पिक पद्धति का परिचय दिया है, जिसे क्रोमेटिन अंतर्जात दरार और उच्च-थ्रूपुट अनुक्रमण (चिक्-सीईसी) 1 कहा जाता है , इन दोषों को दूर करने के लिए।
चिप-सीक को प्रोटीन-डीएनए इंटरैक्शन को संरक्षित करने के लिए प्रायः प्रारंभिक फॉर्मलाहाइड क्रॉटलिंकिंग चरण (एक्स-चिप-सेक) के साथ किया जाता है। हालांकि, कई हाल के अध्ययनों से संकेत मिलता है कि एक्स-चिप-सेक क्षणिक या गैर-विशिष्ट प्रोटीन-डीएनए बातचीत 2 , 3 , 4 , 5 <Sup>, 6 , 7 , 8 , झूठी सकारात्मक बाध्यकारी साइटों को जन्म दे रही है। इसके अलावा, X-Chip-seq प्रयोगों में आमतौर पर टुकड़े टुकड़े करने के लिए उपयोग किया जाने वाला सोनिक, खुले क्रोमेटिन के क्षेत्रों को प्राथमिकता देता है, इन क्षेत्रों 9 , 10 से टुकड़ों की पक्षपाती वसूली करता है। Sonication भी टुकड़े लंबाई का एक विषम मिश्रण पैदा करता है, अंततः बाध्यकारी साइट के प्रस्ताव को सीमित, हालांकि एक exonuclease पाचन कदम के अलावा संकल्प 11 , 12 में काफी सुधार कर सकते हैं। स्वाभाविक रूप से पृथक क्रोमेटिन (ऑरगानिक) से जीनोमों के कब्जे वाले क्षेत्रों जैसे स्थानीय चिंरान वाले क्षेत्र 13 , माइक्रोकोकल न्युकेलेज (एमएनसे) के साथ क्रॉस्लेंकिंकिंग और टुकड़ा क्रोमेटिन का उपयोग नहीं करते हैं, जो फॉर्मलाडहाइड क्रॉस्लिंकिंग और सोयनेशन से संबंधित संभावित पक्षपात को कम करते हैं। तथापि,देशी क्रोमैटाइन निष्कर्षण के लिए अपेक्षित अपेक्षाकृत हल्के परिस्थितियों में कई क्रोमैटिन-बाध्य प्रोटीनों की विलेयता खराब है, संभावित रूप से कम गतिशील श्रेणी और / या गलत नकारात्मक 14 की ओर अग्रसर है।
हालांकि चिप-सेक के विभिन्न पुनरावृत्तियों को प्रोटीन-डीएनए बातचीत के जीनोम-विस्तृत मैपिंग के लिए सबसे अधिक उपयोग किया जाता है, कई डीएनए संशोधित एंजाइमों के लिए ब्याज की प्रोटीन के संलयन के आधार पर कई मानचित्रण तकनीक भी लागू की गई हैं। ऐसा ही एक तरीका डीएनए एडेनिन मेथिलट्रांसफेरेज आइडेंटिफिकेशन (डीएएमआईडी) 15 है , जिसमें ब्याज की क्रोमेटिन बाध्यकारी प्रोटीन आनुवांशिक रूप से बांध से जुड़ा हुआ है और यह संलयन कोशिकाओं या जानवरों में व्यक्त किया जाता है, जिसके परिणामस्वरूप प्रोटीन के लिए बाध्यकारी साइटों के लिए जीएटीसी अनुक्रमों के मेथिलिकेशन का परिणाम होता है। DamID फायदेमंद है कि यह immunoprecipitation पर भरोसा नहीं करता है और इसलिए क्रॉस-लिंकिंग, एंटीबॉडी, या क्रोमैटिन solubilization से बचा जाता है। यह भी vivo में किया जाता है । तथापि, डीएमआईडीआईडी का संकल्प किलोबाबेस पैमाने तक सीमित है और बांध संलयन प्रोटीन की मेथिलिंग गतिविधि constitutive है। एंजाइमिक फ्यूजन पर आधारित एक दूसरा तरीका कार्डिंग-सीक 16 को कॉल करना है, जो ट्रांस्पोसन्स के साइट-विशिष्ट एकीकरण को निर्देशित करने, ट्रांसपोसेज़ में रुचि के एक कारक के संयोजन को नियोजित करता है। डीएमआईडी की तरह, कॉलिंग कार्ड-सीक इम्युनोपेरियग्ज पर आधारित नहीं है और इस प्रकार इसके समान फायदे हैं, बढ़े हुए संकल्प के अतिरिक्त लाभ के साथ। हालांकि, कॉलिंग कार्ड-सेक ट्रांसपोसस के अनुक्रम पूर्वाग्रहों द्वारा सीमित हो सकता है और ट्रांसस्पोज़न सम्मिलन साइटों के करीब प्रतिबंध साइटों की मौजूदगी पर भी निर्भर है।
लामेल्ली लैब में विकसित तीसरी एंजाइमेटिक फ्यूज़न विधि, क्रोमैटिन अंतर्जात दरार (सीईसी) 17 है । सीईसी में क्रोमेटिन से जुड़े प्रोटीन और एमएनज़ के बीच एक संलयन कोशिकाओं में व्यक्त होता है, और एमएनस को सक्रिय करने के लिए कैल्शियम के अतिरिक्त, डीएनए को टैग किए जाने के लिए बाध्यकारी साइटों से समीपित किया जाता हैकारक ( चित्रा 1 )। दक्षिणी छिद्रण के साथ संयोजन में क्रोमेटिन संरचना और प्रोटीन को खमीर 17 , 18 में कई अलग-अलग जगहों पर बाध्यकारी करने के लिए इस्तेमाल किया गया है और खमीर के साथ परमाणु ताकना घटकों के संपर्क की जांच के लिए कम-रिज़ॉल्यूशन माइक्रोएरे विश्लेषण के साथ जोड़ा गया है जीनोम 1 9 चैक डीआईएमआईडी और कॉलिंग कार्ड-सीक के समान लाभ प्रदान करता है, और इसकी संकल्प प्राइमर एक्सटेंशन 19 द्वारा विश्लेषण किए जाने पर लगभग एकल-आधार जोड़ी है। सीईसी भी नियंत्रणीय है: एमएनएस द्वारा मजबूत डीएनए दरार मिलिमरोल कैल्शियम के अतिरिक्त पर निर्भर करता है, यह सुनिश्चित करना कि एमएनज़ जीवित खमीर कोशिकाओं 20 में मनाया गया कम मुक्त कैल्शियम सांद्रता पर निष्क्रिय है।
पहले, हमने यह मान लिया था कि उच्च-थ्रूपुट अनुक्रमण (एसईसी-सीईसी) के साथ एसईसी के संयोजन में टीएफ बाइंडिंग साइट्स के उच्च-रिज़ॉल्यूशन नक्शे उपलब्ध होंगे। दरअसल, चीकजीईएनजी 1 के भर में उभरते हुए खमीर सामान्य विनियामक कारकों (जीआरएफ) एबीएफ 1, रैप 1, और रीब 1 के उच्च-रिज़ॉल्यूशन नक्शे तैयार किए गए। हमने सीईसी को सफलतापूर्वक मॉड्यूलर मध्यस्थ परिसर, एक संरक्षित, आवश्यक वैश्विक ट्रांसक्रिप्शनल कोएक्टिवेटर 21 में लागू किया है , जो सीईसी-एसईक की मेगाडलटन-आकार के कॉम्प्लेक्स के प्रयोज्यता को बढ़ाते हैं, जो सीधे डीएनए से संपर्क नहीं करते हैं और चिप- आधारित विधियां चिप-सेक परिणामों के स्वतंत्र सत्यापन के लिए और क्रोमेटिन-निवासी प्रक्रियाओं के नियमन में नई अंतर्दृष्टि का निर्माण करने के लिए दोनों प्रकार के एक शक्तिशाली विधि है। यहाँ, हम खमीर उभरते हुए इस पद्धति के कार्यान्वयन के लिए चरण-दर-चरण प्रोटोकॉल पेश करते हैं।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. खमीर तनाव का उत्पादन
- MNase के साथ टैग की गई रुचि के कारक को खमीर तनाव उत्पन्न करें।
- PCR विशिष्ट प्रतिक्रिया मिश्रण ( तालिका 2 ) और साइकिल चालन की स्थिति ( तालिका 3 ) का उपयोग करके वांछित वेक्टर ( तालिका 1 ) से MNase टैगिंग कैसेट को बढ़ाना। पीसीआर प्रतिक्रिया के 5 μL मिक्स करें और 1 μL 6X डीएनए लोड हो रहा है डाई। प्रत्येक पीसीआर विभाज्य को 0.8% agarose जेल पर 120 वी के लिए 40 मिनट पर चलाएं। अपेक्षित उत्पाद का आकार ~ 2.3 केबी है
- मानक लिथियम एसीटेट परिवर्तन 22 का उपयोग करके पसंद के तनाव में प्रवर्धित टैगिंग कैसेट को ट्रांसफ़ॉर्म करें और चयन करें।
- कॉलोनी पीसीआर के साथ टैगिंग कैसेट के सही एकीकरण की पुष्टि करें
- जांच के लिए कॉलोनियों की संख्या के लिए निर्दिष्ट प्रतिक्रिया मिश्रण ( तालिका 4 ) तैयार करें। आवश्यकतानुसार बर्फ पर रखें
- टेस होने के लिए प्रत्येक कॉलोनी का एक हिस्सा चुनेंएक बाँझ दन्तखुदनी या pipet टिप का उपयोग कर एक पीसीआर ट्यूब के नीचे टेड।
- 1 मिनट के लिए उच्च शक्ति पर उठाए गए कॉलोनियों को माइक्रोवेव
- प्रत्येक माइक्रोवेव कॉलोनी और पीपेट को 50 μL पीसीआर मिश्रण ( टेबल 4 ) में जोड़ें और मिश्रण करने के लिए ऊपर और नीचे करें। निर्दिष्ट साइकिल चालन शर्तों ( तालिका 5 ) का उपयोग कर पीसीआर करें।
- पीसीआर प्रतिक्रिया के 50 μL और प्रत्येक पीसीआर ट्यूब में 10 μL 6X डीएनए लोडिंग डाई सीधे मिलाएं। प्रत्येक नमूने के 10 μL 1% agarose जेल पर 120 वी के लिए 40 मिनट पर चलाएं। अपेक्षित उत्पाद का आकार ~ 700 बीपी है
नोट: यदि वांछित है, तो पश्चिमी ब्लॉटिंग के माध्यम से एमएनस फ्यूजन प्रोटीन की उपयुक्त अभिव्यक्ति की पुष्टि करें। टैग प्रोटीन के आणविक वजन में ~ 20.6 किलोोडलटन शिफ्ट की उम्मीद है।
- पीजीजी 136 (तालिका 1) में रुचि के जीन के प्रवर्तक की समरूपता आधारित क्लोनिंग द्वारा मुक्त एमएनज तनाव उत्पन्न करें और कदम 1.1.2 के रूप में परिवर्तन और चयन करें।
- alternatiवैसे, एक प्लाज्मिड वेक्टर में ब्याज के जीन के प्रमोटर और 3xFLAG-MNase-SV40 एनएलएस को इकट्ठा, चरण 1.1.2 के रूप में रूपांतरित करें और चयन करें, और प्लाज्मिड के रखरखाव के लिए उचित चयनात्मक हालत में तनाव बढ़ाना।
2. सीईसी
- एसईसी प्रयोग से पहले दिन के दोपहर / शाम में, एमएनएस टैग वाले फैक्टर को लेकर तनाव के एक कॉलोनी के साथ 3 एमएल खमीर-पेप्टोोन-डेक्सट्रोज़ (वाईपीडी) या उचित चयनात्मक माध्यम को टीका लगाना। इस संस्कृति को रातोंरात सेते हैं (180 आरपीएम मिलाते हुए, 30 डिग्री सेल्सियस)।
- चक के प्रयोग के दिन की सुबह, 600-एनएम (ओडी 600 ) 0.2 - 0.3 में ऑप्टिकल घनत्व के लिए रात भर की संस्कृति को 50 एमएल मध्यम में पतला। इस संस्कृति (180 आरपीएम मिलाते हुए, 30 डिग्री सेल्सियस) को जब तक यह 0.5-0.7 के ओडी 600 तक नहीं पहुंचता। जैसा कि संस्कृति उपयुक्त ओडी 600 तक पहुंचता है, गर्मी ब्लॉक या पानी के स्नान को 30 डिग्री सेल्सियस तक सेट करें और बफर ए एडिटिव्स ( ताBle 6)।
- प्रति संस्कृति के 5 एमएल बफर ए प्लस एडिटिंग ( तालिका 6 ) तैयार करें। प्रक्रिया के दौरान आरटी पर बफर ए रखें।
- इकट्ठा किए जाने वाले प्रत्येक समय बिंदु के लिए 90 μL स्टॉप सॉल्यूशन ( टेबल 7 ) और 10 μL 10% एसडीडी वाले माइक्रोफ़्यूज ट्यूबों को तैयार करें। प्रत्येक नए कारक के विश्लेषण के लिए, नमूने 0 एस, 30 एस, 1 मिनट, 2.5 मिनट, 5 मिनट और 10 मिनट में लें।
- एक 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब और 1 मिनट के लिए कमरे के तापमान (आरटी) पर 1500 XG और अपकेंद्रित्र में घुलनशील संस्कृति।
- अच्छी तरह से 1 एमएल बफर ए में कोशिकाओं को पुन: resuspend और एक microfuge ट्यूब को resuspended कोशिकाओं स्थानांतरण। गोली को एक माइक्रोफ्यूज में रीसेट किया गया कोशिकाएं 30 एस के लिए 1,500 एक्सजी और आरटी पर
- सतह पर तैरनेवाला महाप्राणित और ऊपर से नीचे pipetting द्वारा 1 एमएल बफर ए में कोशिकाओं को अच्छी तरह से resuspend। गोली को एक माइक्रोफ्यूज में रीसेट किया गया कोशिकाएं 30 एस के लिए 1,500 एक्सजी और आरटी पर इस चरण को एक बार दोहराएं।
- बफर ए 570 μL में कोशिकाओं को अच्छी तरह से रीसस्पेंड करें। 30 μL का 2% डिजीटीनिन जोड़ें(0.1% अंतिम एकाग्रता) कोशिकाओं के permeabilization की सुविधा के लिए, और मिश्रण करने के लिए पलटना
- 5 मिनट के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर गर्मी ब्लॉक या पानी के स्नान में कोशिकाओं को स्थिर करें
- कोशिकाओं के एक भी वितरण को सुनिश्चित करने के लिए पिपेट प्रतिक्रिया ऊपर और नीचे। एक माइक्रोफ्यूज ट्यूब में रोकने के समाधान और एसडीएस (चरण 2.4) और भंवर संक्षेप में मिश्रण करने के लिए एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में permeabilized कोशिकाओं के 100 μL विभाज्य निकालें।
- एमएनसी को सक्रिय करने और मिश्रण करने के लिए कई बार जल्दी या भंवर संक्षिप्त करने के लिए permeabilized कोशिकाओं के लिए 1 एम CaCl 2 (2 मिमी अंतिम एकाग्रता) के 1.1 μL जोड़ें। 30 डिग्री सेल्सियस पर मिश्रित प्रतिक्रिया तुरंत वापस करें और टाइमर शुरू करें।
- प्रत्येक समय को एकत्र करने के लिए, कोशिकाओं का एक भी वितरण सुनिश्चित करने के लिए प्रतिक्रिया ऊपर और नीचे pipet करें, फिर एक समाधान microfuge ट्यूब रोकने के लिए ट्यूब और एसडीएस और भंवर संक्षेप मिश्रण करने के लिए permeabilized कोशिकाओं के 100 μL विभाज्य निकालें। प्रत्येक नए कारक के विश्लेषण के लिए, 0 एस लें (कोई CaCl 2 जोड़ा नहीं), 30 एस, 1 मिनट, 2.5 मिनट, 5 मिनट और 10 मिनट का समय अंक।
नोट: एमएएनएस क्लेविज कैनेटीक्स को धीमा करने के लिए कम तापमान पर 30 डिग्री सेल्सियस पर डीएनए को तेजी से फैलाने वाले कारकों के साथ चईई प्रयोगों का प्रदर्शन किया जा सकता है। - एक बार सभी समय अंक इकट्ठा किए जाने के बाद, प्रत्येक नमूने के लिए 4 μL 20 मिलीग्राम / एमएल प्रोटीनेस कश्मीर जोड़ें, भंवर को संक्षेप में मिश्रण करें, और 30 मिनट के लिए 55 डिग्री सेल्सियस पर सेते रहें।
- क्लोरोफॉर्म के 200 μL जोड़ें: प्रत्येक नमूने के लिए आइसोअमॉल शराब, 5 मिनट के लिए एक माइक्रोफ्यूज में अधिकतम गति और आरटी पर मिक्स करने के लिए सख्ती से भंवर, और अपकेंद्रित।
- प्रत्येक जलीय चरण (~ 150 μL) को एक नई ट्यूब में हटा दें। 30 μg ग्लाइकोजन और 500 μL 100% इथेनॉल जोड़ें। सूख बर्फ पर मिश्रण करने के लिए भंवर, 10 मिनट या जब तक समाधान चिपचिपा नहीं होता है।
- गोली अधिकतम गति और 10 मिनट के लिए एक माइक्रोफ्यूज में 4 डिग्री सेल्सियस पर डीएनए उत्तेजित।
- घूमने वाले सतह पर तैरनेवाला और 1 एमएल आरटी 70% इथेनॉल के साथ छिलके को धो लें।
- डेंकेंट एथेनॉल, एक inverting द्वारा शेष हटानेधीरे धीरे एक कागज तौलिया पर ट्यूबों दोहन। संक्षेप में एक बेंचटॉप अपकेंद्रित्र का उपयोग करके नमूने स्पिन करें और अवशिष्ट ईथेनॉल को हटाने के लिए एक pipet का उपयोग करें, जो कि गोली को परेशान न करें। 5 मिनट के लिए आरटी पर वायु-सूखा छर्रों
- जबकि छरियां सूख रही हैं, तो 29 μL Tris, पीएच 8.0 + 1 μL 10 मिलीग्राम / एमएल आरएनस ए प्रत्येक में सूखे छर्रों को फिर से शुरू करने के लिए एक मास्टर मिक्स बनायें। डाइजेस्ट आरएनए में 37 डिग्री सेल्सियस 20 मिनट तक
- प्रत्येक नमूने के 5 μL के साथ 6x डीएनए लोडिंग डाई के 1 μL मिलाएं और 1.5% agarose जेल पर 120 वी के लिए 40 मिनट पर चलाएं।
3. आकार का चयन
नोट: आकार के चयन का लक्ष्य नमूना से जीनोमिक डीएनए के बहु-किलोबाज़ के टुकड़े को निकालना है, जो कि ~ 150 बीपी (लगभग nucleosomal डीएनए के आकार) या छोटे के टुकड़ों को समेकित और समृद्ध करना है। अनुक्रमण आंकड़ों में, न्यूक्लियोसोमल डीएनए (~ 150 बीपी) के आकार के आसपास एक उल्लेखनीय चोटी के साथ <400 बीपी समृद्ध और उप-न्यूक्लियोसोमल टुकड़े के एक शिखर या व्यापक वितरण हैं।
<ol>नोट: सीईसी-सीक डेटा का विश्लेषण एक जटिल प्रक्रिया है और इस आलेख के दायरे से परे है। डेटा विश्लेषण के बारे में विस्तृत जानकारी पिछले प्रकाशन 1 , 21 में पाई जा सकती है, और विश्लेषण के लिए उपयोग की जाने वाली कस्टम स्क्रिप्ट GitHub (https://github.com/zentnerlab/chec-seq) पर उपलब्ध हैं। होमेर 25 (http://homer.salk.edu) का उपयोग सीईसी-सीक डेटा के कमांड लाइन विश्लेषण के लिए भी किया जा सकता है।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
एक सफल चक प्रयोग के मामले में, agarose जेल वैद्युतकणसंचलन द्वारा डीएनए का विश्लेषण डीएनए विखंडन में समय-समय पर कैल्शियम-निर्भर वृद्धि प्रकट करेगा, जैसा कि गंध और डीएनए के अंतिम पचाने से संकेत मिलता है। कुछ मामलों में, विस्तारित पाचन के बाद पारंपरिक MNase पाचन के साथ देखा जाने वाला बैंड एक सीढ़ी पर देखा जाता है। रेब 1 के चेके विश्लेषण के लिए ऐसा मामला है, जो एक सामान्य नियामक कारक है जो न्यूक्लियोसोम-निहित क्षेत्रों (एनडीआर) ( चित्रा 2 ) को बांधता है। हमने पाया है, जीआरएफ के मामले में, विस्तारित पाचन तेजी से बाध्यकारी बंधन वाली साइटों पर संकेत के नुकसान की ओर जाता है 1 । आदर्श रूप से, जीनोमिक डीएनए बैंड के आकार में कमी के साथ एक नमूना जो रेब 1 चक के लिए 30 सेकंड और 1 मिनट के समय बिंदुओं जैसे उच्च-आणविक भार के प्रहार को प्रदर्शित करता है, संकेत के समय-निर्भर नुकसान से बचने के लिए अनुक्रमण के लिए उपयोग किया जाएगा ।
चित्रा 3 )। इसी प्रकार, हम एमएनएस के साथ मध्यस्थ सब्यूनिट मेडी 8 के संलयन द्वारा पर्याप्त डीएनए दरार को देखते हैं, लेकिन एमईडी 8 प्रमोटर द्वारा संचालित एमएनएसी के मुताबिक कैल्शियम अतिरिक्त ( चित्रा 3 ) के बाद 1 मिनट के बाद नहीं।
रिब 1 सीईसी-सीईसी डेटा की तुलना में चिप-सेक के लिए, हमने 1,991 रेब 1 चोटियों की सूची 13 ORGANIC द्वारा निर्धारित की है। ये चोटियां आकृति के मध्य भाग के आसपास 100 बीपी विंडो में प्रत्येक आधार स्थिति पर औसत टुकड़ा अंत गणना के साथ आकृति-केन्द्रित थीं। हम दरार में एक अस्थिरता को देखते हुए, अधिकांश टुकड़े के साथ आकृति के अपस्ट्रीम किनारे पर मैपिंग समाप्त होता है (चित्रा 4 )
चित्रा 1 : चीई-एसईसी विधि के योजनाबद्ध क्रोमेटिन से जुड़े प्रोटीन (सीएपी) -एमएनस फ्यूजन को खमीर कोशिकाओं में व्यक्त किया जाता है। प्रोटीन डीएनए से जुड़ा होता है लेकिन नाभिक में बहुत कम मुक्त कैल्शियम के कारण पृष्ठभूमि स्तर के ऊपर दरार उत्पन्न नहीं करता है। डिजीटीनिन और मिलिमरोल कैल्शियम के साथ कोशिकाओं के पारगम्यता पर, सीएपी-एमएनस जीनियम डीएनए को साफ करने के लिए बंधे हुए फ़्यूज़न, छोटे टुकड़े जारी करते हैं। ये टुकड़े तब शुद्ध, अनुक्रमित, और जीनोम में वापस मैप किए जाते हैं, टुकड़े की चोटियों को सीएपी-एमएनस संलयन के लिए बाध्यकारी साइटों के लिए समीपस्थ हो जाता है। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें
चित्रा 2 : रेब 1 सीईसी प्रयोग से डीएनए के एगारोस जेल वैद्युतकणसंचलन। प्रत्येक चैक समय बिंदु से डीएनए का 5 μL विभाज्य का आकार चयन से पहले 1.5% TAE-agarose जेल पर विश्लेषण किया गया था। यह Reb1-MNase संलयन द्वारा जीनोमिक डीएनए के प्रगतिशील पाचन को दर्शाता है। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें
चित्रा 3 : रीब 1-एमएनसे और नि: शुल्क एमएनस सीईसी-एसईक प्रयोगों के जीनोम ब्राउज़र स्नैपशॉट्स। रिब 1 के लिए टुकड़े के अंत सिग्नल के आईजीवी दृश्य और कैल्शियम एक्वायर्ड और मेड 8 के बाद फ्री एमएनस सीईसी-सीक 30 एस और फ्री एमएनस सीईसी-सीईसी 1 मिनट एफ़ एफ खमीर जीनोम के एक प्रतिनिधि सेगमेंट के साथ कै कैल्शियम के अलावा टुकड़ों की संख्या को विभाजित करके प्रत्येक मूल स्थान पर मैप किए गए टुकड़ों की कुल संख्या को विभाजित करके और मैसेज की कुल संख्या के आधार पर डेटासेट को सामान्यीकृत किया गया और मैसेज की कुल संख्या के आधार पर गुणा किया गया। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें
चित्रा 4 : Reb1-MNase- जारी टुकड़े के संवर्धन Reb1 जैविक साइटों के आसपास समाप्त होता है। 30 एस रेब 1 की औसत साजिश और फ्री मैनेज चे सीईसी-सीक टुकड़ा अंत सिग्नल 1,991 के आसपास ORBANIC 13 द्वारा निर्धारित रीब 1 प्रारूप चित्रा 3 में डेटा सामान्यीकृत थेLank "> कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें
| प्लाज्मिड | खमीर चयनकर्ता मार्कर | टिप्पणियाँ | Addgene प्लाज्मिड संख्या |
| pGZ108 | kanMX6 | 3xFLAG-MNase टैगिंग, 33 आइ लिंकर | 70,231 |
| pGZ109 | HIS3MX6 | 3xFLAG-MNase टैगिंग, 33 आइ लिंकर | 70,232 |
| pGZ110 | TRP1 | 3xFLAG-MNase टैगिंग, 33 आइ लिंकर | 70,233 |
| pGZ136 | URA3 | आरई 1 प्रमोटर के नियंत्रण में 3xFLAG-MNase-SV40 एनएलएस को व्यक्त करता है | 72,273 |
| pGZ173 | kanMX6 | एमएनसे टैगिंग, 8 ए लिंकर | 70,234 |
तालिका 1: चीई प्लास्मिड का विवरण सभी टैगिंग वैक्टर पीएफ 6 6 वैक्टर पर आधारित होते हैं और इसलिए आमतौर पर इस्तेमाल किए गए एफ 2 / आर 1 टैगिंग प्राइमर जोड़ी के साथ संगत हैं। टैगिंग कैसेट में इंगित लंबाई के एक लिंकर होते हैं, जो पश्चिमी ब्लॉटिंग (पीजीजेड 173 के मामले में, जहां लिंकर को 3xFLAG टैग को निकालने के लिए कम कर दिया गया है) की पहचान करने के लिए 3xFLAG मिलान का पता चलता है, एमएनएस की परिपक्व श्रृंखला (जेनबैंक पी 00644 , एए 83 - 231), और संकेतक चयनकर्ता मार्कर
| अभिकर्मक | आयतन | [अंतिम] |
| 5x पीसीआर बफर | 10 एमएल | 1x (2 मिमी एमजीसी 2 ) |
| 10 मिमी डीएनटीपी मिश्रण (2.5 एमएम प्रत्येक डीएनटीपी) | 1 एमएल | 200 मिमी (50 एमएम प्रत्येक डीएनटीपी) |
| 10 मिमी एफ 2 प्राइमर | 2.5 एमएल | 0.5 मिमी |
| 10 मिमी आर 1 पीRimer | 2.5 एमएल | 0.5 मिमी |
| PGZ108 / 109/110/172 (1-5 एनजी / एमएल) | 1 एमएल | |
| 2 यू / μL गर्म शुरुआत उच्च निष्ठा पोलीमरेज़ | 0.5 एमएल | 1 यू |
| डीडीएच 2 ओ | 32.5 एमएल |
तालिका 2: 3 एक्सएफएलजी-एमएनस टैगिंग कैसेट के पीसीआर प्रवर्धन के लिए प्रतिक्रिया मिश्रण। एफ 2 / आर 1 प्राइमर अनुक्रम http://yeastgfp.yeastgenome.org/yeastGFPOligoSequence.txt पर पाया जा सकता है।
| तापमान (डिग्री सेल्सियस) | पहर | साइकिल |
| 98 | 30 एस | 1 |
| 98 | 10 एस | 25 |
| 55 | 30 एस | 25 |
| 72 1 मिनट 15 एस | 25 | |
| 72 | 2 मिनट | 1 |
| 10 | सदैव | पकड़ |
तालिका 3: पीसीआर के लिए थर्मल सायकलिंग शर्तें 3 एक्सएफएलएजी-एमएनस टैगिंग कैसेट के प्रवर्धन ऊष्मायन तापमान और विस्तार समय को डीएनए पोलीमरेज़ के उपयोग के आधार पर समायोजित करने की आवश्यकता हो सकती है।
| अभिकर्मक | आयतन | [अंतिम] |
| 10x ताक बफर | 5 एमएल | 1x (1.5 मिमी एमजीसी 2 ) |
| 10 मिमी डीएनटीपी मिश्रण (2.5 एमएम प्रत्येक डीएनटीपी) | 1 एमएल | 200 मिमी (50 एमएम प्रत्येक डीएनटीपी) |
| 10 एमएम चेक प्राइमर | 1 एमएल | 0.2 मिमी |
| 10 मिमी एमएनसे-आर या नकारात्मक नियंत्रण प्राइमर | 1 एमएल | 0.2 मिमी |
| 5 यू / एमएल ताक पोलीमरेज़ | 0.5 एमएल | 2.5 यू |
| डीडीएच 2 ओ | 41.5 एमएल |
तालिका 4: कॉलोनी पीसीआर के लिए प्रतिक्रिया मिश्रण एमएनस टैगिंग की पुष्टि। प्राइमर की जाँच करें की जाँच करें http://yeastgfp.yeastgenome.org/yeastGFPOligoSequence.txt पर पाया जा सकता है। चेक प्राइमर को रिवर्स प्राइमर के साथ आगे प्राइमर के रूप में एमएनase (5'-टीटीजीटीजीसीएजीटीटीसीटीटीजीजीटीएसी -3) और एक रिवर्स प्राइमर ~ 500 आधार जोड़े (बीपी) के रूप में प्रयोग किया जाता है जो नकारात्मक नियंत्रण के रूप में संबंधित जीन की डाउनस्ट्रीम है।
| तापमान (डिग्री सेल्सियस) | पहर | साइकिल |
| 95 | 5 मिनट | 1 |
| 95 | 30 एस | 35 |
| 55 | 30 एस | 35 |
| 68 | 1 मिनट | 35 |
| 68 | 5 मिनट | 1 |
| 10 | सदैव | पकड़ |
तालिका 5: कॉलोनी पीसीआर के लिए थर्मल साइकलिंग शर्तें एमएनस टैगिंग की पुष्टि। ऊष्मायन तापमान और विस्तार समय को डीएनए पोलीमरेज़ के उपयोग के आधार पर समायोजित करने की आवश्यकता हो सकती है।
| अभिकर्मक | आयतन | [अंतिम] |
| 1 एम ट्रिस, पीएच 7.5 | 1.5 एमएल | 15 मिमी |
| 1 एम केएलएल | 8 एमएल | 80 मिमी |
| 0.2 एम ईजीटीए | 50 एमएल | 0.1 मिमी |
| डीडीएच 2 ओ | 100 भरेंएमएल |
तालिका 6: बफर ए के लिए नुस्खा। उपयोग करने से पहले, आधा प्रोटीज अवरोधक टैबलेट, 50 एमएल का 100 एमएम पीएमएसएफ (1 एमएम फाइनल), 5 एमएल 200 एमएम स्पामाइन (0.2 एमएम फाइनल) और 2.5 एमएल 1 एम शुक्राणु (0.5 मिमी अंतिम) प्रति 5 एमएल समाधान।
| अभिकर्मक | आयतन | [अंतिम] |
| 5 एम NaCl | 8 एमएल | 400 मिमी |
| 0.5 एम EDTA | 4 एमएल | 20 मिमी |
| 0.2 एम ईजीटीए | 2 एमएल | 4 मिमी |
| डीडीएच 2 ओ | 100 एमएल भरें |
तालिका 7: 2x स्टॉप सोल्यूशन के लिए नुस्खा। 90 μL स्टो का मिश्रण करेंप्रत्येक समय बिंदु के लिए माइक्रोफ्यूज ट्यूब में 10 μL 10% एसडीएस के साथ पी समाधान (चरण 2.4 देखें)।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
हमने दिखाया है कि चक क्रोमेटिन पर विभिन्न प्रकार के खमीर प्रोटीन को मैप कर सकता है, और यह अनुमान लगाया जा सकता है कि ये खनिजों में टीएफ और अन्य क्रोमैटिन बाध्यकारी कारकों के विभिन्न परिवारों पर मोटे तौर पर लागू होंगे। सीईसी-एसईसी फायदेमंद है क्योंकि इसमें क्रॉस-लिंकिंग, क्रोमैटिन सोल्यूबिलाइज़ेशन या एंटीबॉडीज की ज़रूरत नहीं है। इस प्रकार, सीईसी एक्स-चिप-सेक में संभावित रूप से मौजूद कलाकृतियों से बचा जाता है, जैसे कि हाइपर-चिप्पबल आर्टिफैक्ट 3 , 4 , और मूल चिप, जैसे अधूरे प्रोटीन solubilization 14 के कारण गलत नकारात्मक। सभी एंजाइमेटिक संलयन विधियों के साथ-साथ, सीईसी-सीक का प्रमुख दोष, संलयन प्रोटीन की आवश्यकता है। यह खमीर उगाने में जल्दी से प्राप्त किया जा सकता है, लेकिन मेटाजोन में अधिक श्रमसाध्य है। सीईसी-सीईसी की एक और सीमा यह है कि इसे लागू नहीं किया जा सकता है- हिस्टोन संशोधनों की रूपरेखा के लिए है हालांकि, एक संशोधन-बाध्यकारी डोमेन को एमएनस में जोड़ा जा सकता है और व्यक्त किया जा सकता है, जिससे एच सक्षम हैएसईसी-एसईसी के साथ इस्तोन संशोधन मेपिंग इस नस में, एपेटो-टैग हिस्टोइन संशोधन-बाध्यकारी डोमेन का उपयोग कर चिप-सेक का उपयोग हिस्टोइन संशोधन 26 के जीनोम-विस्तृत पैटर्न को मैप करने के लिए किया गया है।
सीईसी-एसईसी परिणामों की विशिष्टता स्थापित करने में एक नि: शुल्क एमएनज़ नियंत्रण का उपयोग करना महत्वपूर्ण है। नि: शुल्क MNase तनाव ब्याज की जीन के लिए अंतर्जात प्रमोटर के नियंत्रण में 3xFLAG और एक simian वायरस 40 परमाणु स्थानीयकरण संकेत (एसवी 40 एनएलएस) के साथ टैग एमएनसे भालू। यह अवधारणात्मक रूप से डीएमआईडी के अध्ययन में इस्तेमाल किए गए अनुपयुक्त बांध नियंत्रण के समान है 27 और क्रोमेटिन पहुंच के कारण अदम्य दरार के लिए नियंत्रण। टीएफ चेल-सीईसी के लिए एक नि: शुल्क एमएनase नियंत्रण के तौर पर, हमने आरयू 1 प्रमोटर द्वारा संचालित 3 एक्सएफएलएजी-एमएनस-एसवी 40 एनएलएस को एकीकृत किया है । मध्यस्थ चैक-सीक के लिए, हमने एमईडी 8 प्रमोटर के नियंत्रण में 3xFLAG-MNase-SV40 एनएलएस को एक गैर-एकीकृत प्लास्मी में व्यक्त कियाडी सदिश चुनिंदा माध्यम 21 में बनाए रखा दोनों मामलों में, मुफ्त MNase द्वारा बहुत कम दरार देखा गया था। इस प्रकार, एक एकल नियंत्रण तनाव जिसमें 3xFLAG-MNase-SV40 एनएलएस एक अपेक्षाकृत मजबूत प्रमोटर द्वारा संचालित होता है, अधिकांश प्रयोगों के लिए उपयुक्त होना चाहिए।
सीईसी प्रयोग की योजना बनाते समय, ब्याज की प्रोटीन की संरचनात्मक विचार महत्वपूर्ण हो सकता है। उदाहरण के लिए, हमने पाया कि रिबे 1 के सी-टर्मिनस में एमएनसे को जोड़ने से रेब 1 प्रस्तुतियों के आसपास एक असममित दरार पैटर्न दिया गया, जबकि एन-टर्मिनल एमएनसे के साथ रीब 1 की अभिव्यक्ति ने एक सममित दरार पैटर्न 1 दिया । हम रेब 1 की संरचना के लिए इन अलग-अलग दरार पैटर्न का विशेषता देते हैं। Reb1 का डीएनए बाध्यकारी डोमेन अपने सी टर्मिनस पर स्थित है; इस प्रकार, सी टर्मिनस संरचित और डीएनए के करीब है, MNase की गति की सीमा को सीमित करता है और केवल सी टर्मिनल क्लेविज को अनुमति देता है। इसके विपरीत, एपीएफ 1 का सी टर्मिनस अपेक्षाकृत असंरचित है और इस प्रकार यह बढ़ने के लिए कार्य कर सकता हैएमएएनज़ की पहुंच, एबीएफ 1 बाध्यकारी साइटों के दोनों किनारों पर दरार की अनुमति। रैपी 1 के मामले में, एक अन्य खमीर जीआरएफ ने पाया कि सी-टर्मिनस और एमएनस के बीच 33 से 8 एए के बीच लिंकर को छोटा करने से काफी मुश्किलें कम हो सकती हैं, संभवतः रैप 1 के सी-टर्मिनल हिस्से की प्रस्तावित दूरी के कारण डीएनए 28 बड़े परिसरों में मौजूद प्रोटीनों की बाध्यता को मैप करने का प्रयास करते समय इस तरह के संरचनात्मक विचार भी महत्वपूर्ण होने की संभावना है। 21 साल के खमीर जीनोम के लिए बंधक मध्यस्थ के हमारे सीईसी-सैक विश्लेषण के लिए, हमने उपनियुक्तों का चयन किया था जिनके सी-टर्मिनी संरचनात्मक रूप से परिसर के भीतर दफन किये जाने की बजाय संरचनात्मक रूप से सामने आने की भविष्यवाणी की गई थी। एमएनस से जुड़े तीन उप-वर्गों में से, एक ने डीएनए को मजबूत नहीं किया, जिससे यह संकेत मिलता है कि या तो डीरी बाध्यकारी कारकों या डीएनए बाध्यकारी अन्य कारकों के साथ बातचीत डीएनए दरार को कम कर देती है।
हमने पाया कि सीईसी-सीक खमीर जीआरएफ एबीएफ 1, रैप 1, और रिब के लिए 4-12 बार अधिक चोटियों का पता लगाता हैजब 1 9 1 9 में सभी समय बिंदुओं को 1 इन साइटों को एमएनएस क्लेविज कैनेटीक्स के आधार पर दो वर्गों में विभाजित किया जा सकता है। खमीर जीआरएफ के सीईसी डेटा का विश्लेषण बाध्यकारी साइटों के दो अस्थायी रूप से अलग वर्गों का पता चला है। पहले, जिसे 'फास्ट' कहा जाता है, कैल्शियम के अतिरिक्त होने के बाद अधिक से अधिक क्लेक्शन <1 मिनट प्रदर्शित करता है और आम तौर पर ज्ञात आम सहमति प्रस्तुतियों के लिए मजबूत मैचों में होता है। दूसरा, 'धीमा' कहा जाता है, दरार के प्रशंसनीय स्तर तक पहुंचने में कई मिनट लगते हैं और आकृति के मैच समाप्त हो जाते हैं। साइटों के दोनों वर्ग, औसत, चुप डेटासेट्स में बाध्य करने के लिए समृद्ध थे, हालांकि उन चीप अध्ययनों में उन्हें आवश्यक रूप से चोटियों के रूप में नहीं बुलाया गया था। एक निश्चित कारक के लिए साइटों की अधिकांश धीमी साइटों थे हम अनुमान लगाते हैं कि तेजी से साइटें उच्च आत्मीयता प्रतिलेखन कारक बाध्यकारी साइटों का प्रतिनिधित्व करती हैं, जबकि धीमी गति से साइटें स्थानीय रूप से बाध्यकारी साइट स्कैनिंग के दौरान नमूने में दर्शाती हैं। ओबएमएनएस क्लेविज के कैनेटीक्स द्वारा अलग-अलग बाध्यकारी साइटों का सेवारेशन कई चिप-सिक डेटासेट्स में अवलोकन को समझा सकता है कि एक अच्छी तरह से स्थापित डीएनए बाध्यकारी विशिष्टता के साथ एक विशेष कारक के लिए बड़ी संख्या में चोटियों में आम सहमति 29 : ज्यादातर चिप प्रोटोकॉल में 10-15 मिनट के लिए किए गए फॉर्मलाडहाइड क्रॉटलिंकिंग, बार-बार जीनोम के साथ एक कारक के क्षणिक या अवसरवादी बातचीत को पकड़ सकता है, जिसके कारण संकेत की मुद्रास्फीति हो सकती है। दरअसल, चिप-एक्सो और लाइव सेल इमेजिंग की तुलना यह बताती है कि यह मामला 2 है । विशेष रूप से, हमने मध्यस्थ एसईसी-सीईसी संकेतों में ऐसे नाटकीय समय-आश्रित कमी का पालन नहीं किया, जिसमें मध्यस्थ एसईसी-सीईसी संकेत 30 से 20 मिनट तक अपेक्षाकृत स्थिर रहा। इन टिप्पणियों को देखते हुए, हम उच्च-आत्मविश्वास बंधन स्थल को पुनर्प्राप्त करने के लिए शॉर्ट-डेक्लियर एसईसी-सीईक की सिफारिश करते हैं।
हम आशा करते हैं कि सीईसी-सीक गैर-खमीर के लिए अनुकूलित किया जा सकता हैसिस्टम। अनस्टिम्यूलेटेड स्तनधारी कोशिकाओं में मुक्त कैल्शियम की एकाग्रता 50-300 एनएम 30 , 32 है , जो कुशल एमएनस सक्रियण के लिए सीमा से नीचे है। मेटाजोन सिस्टम में सीईसी-सीक की स्थापना के लिए सीमित कदम इस प्रकार संलयन प्रोटीन की पीढ़ी है, जो कि खमीर कोशिकाओं की तुलना में मेटाजोन में अधिक श्रमसाध्य रहता है। हालांकि, मेटाजोन जीन के अंतर्जात टैगिंग को सीआरआईएसपीआर-आधारित जीनोम इंजीनियरिंग 33 के आगमन से काफी मदद मिल रही है, और इसलिए यह सीमा आसानी से बढ़ी जानी चाहिए। वैकल्पिक रूप से, एमएनसे फ्यूजन प्रोटीन को प्लास्मिड से कम स्तर पर व्यक्त किया जा सकता है। यह दृष्टिकोण ड्रोसोफिला 34 , 35 और मानव 36 कोशिकाओं में बांध के लिए काफी सफल रहा है और इस प्रकार मेटाजोन कोशिकाओं में चेको-सीक की भी सुविधा हो सकती है।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है।
Acknowledgments
हम म्यूस्टाफा सालेह और जे ट्रागेन्स को पांडुलिपि के महत्वपूर्ण पढ़ने और स्टीव हेन और स्टीवेन हेनिकोफ का धन्यवाद करते हैं, जो एसईसी-सीक के विकास के दौरान और मध्यस्थ परिसर के लिए आवेदन के दौरान सहयोग और सहयोग के लिए धन्यवाद करते हैं। एसजी एनआईएच अनुदान द्वारा समर्थित है R01GM053451 और R01GM075114 और जीईजेड इंडियाना विश्वविद्यालय स्टार्टअप फंड द्वारा समर्थित है।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| dNTPs | NEB | N0447 | |
| Q5 high-fidelity DNA polymerase | NEB | M0491L | Other high-fidelity DNA polymerases, such as Phusion, may be used for cassette amplification. |
| TrackIt 1 Kb Plus DNA ladder | ThermoFisher Scientific | 10488085 | |
| Taq DNA polymerase | NEB | M0273L | |
| cOmplete Mini EDTA-free protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | 11836170001 | It is important that an EDTA-free protease inhibitor mix is used, so as not to inhibit MNase cleavage by chelation of Ca2+. |
| PMSF | ACROS Organics | AC215740010 | |
| Digitonin, High Purity | EMD Millipore | 300410-250MG | Make a 2% stock by dissolving 20 mg digitonin in 1 mL DMSO with vigorous vortexing. |
| Proteinase K, 20 mg/mL | Invitrogen | 25530049 | |
| RNase A, 10 mg/mL | ThermoFisher Scientific | EN0531 | |
| Ampure XP beads | Beckman Coulter | A63880 | Ampure-like beads can be generated using a published protocol (ref 24). |
| MagneSphere magnetic rack | Promega | Z5342 |
References
- Zentner, G. E., Kasinathan, S., Xin, B., Rohs, R., Henikoff, S. ChEC-seq kinetics discriminates transcription factor binding sites by DNA sequence and shape in vivo. Nat Commun. 6, 8733 (2015).
- Chen, J., et al. Single-Molecule Dynamics of Enhanceosome Assembly in Embryonic Stem Cells. Cell. 156 (6), 1274-1285 (2014).
- Teytelman, L., Thurtle, D. M., Rine, J., van Oudenaarden, A. Highly expressed loci are vulnerable to misleading ChIP localization of multiple unrelated proteins. Proc Natl Acad Sci USA. 110 (46), 18602-18607 (2013).
- Park, D., Lee, Y., Bhupindersingh, G., Iyer, V. R. Widespread Misinterpretable ChIP-seq Bias in Yeast. PLoS ONE. 8 (12), 83506 (2013).
- Jain, D., Baldi, S., Zabel, A., Straub, T., Becker, P. B. Active promoters give rise to false positive 'Phantom Peaks' in ChIP-seq experiments. Nucleic Acids Res. , (2015).
- Krebs, W., et al. Optimization of transcription factor binding map accuracy utilizing knockout-mouse models. Nucleic Acids Res. 42 (21), 13051-13060 (2014).
- Paul, E., Zhu, Z. I., Landsman, D., Morse, R. H. Genome-Wide Association of Mediator and RNA Polymerase II in Wild-Type and Mediator Mutant Yeast. Mol Cell Biol. 35 (1), 331-342 (2015).
- Worsley Hunt, R., Wasserman, W. W. Non-targeted transcription factors motifs are a systemic component of ChIP-seq datasets. Genome Biol. 15 (7), 412 (2014).
- Vega, V. B., Cheung, E., Palanisamy, N., Sung, W. -K. Inherent Signals in Sequencing-Based Chromatin-ImmunoPrecipitation Control Libraries. PLoS ONE. 4 (4), 5241 (2009).
- Teytelman, L., et al. Impact of Chromatin Structures on DNA Processing for Genomic Analyses. PLoS ONE. 4 (8), 6700 (2009).
- Rhee, H. S., Pugh, B. F. Comprehensive Genome-wide Protein-DNA Interactions Detected at Single-Nucleotide Resolution. Cell. 147 (6), 1408-1419 (2011).
- He, Q., Johnston, J., Zeitlinger, J. ChIP-nexus enables improved detection of in vivo transcription factor binding footprints. Nat Biotech. 33 (4), 395-401 (2015).
- Kasinathan, S., Orsi, G. A., Zentner, G. E., Ahmad, K., Henikoff, S. High-resolution mapping of transcription factor binding sites on native chromatin. Nat Methods. 11 (2), 203-209 (2014).
- Skene, P. J., Hernandez, A. E., Groudine, M., Henikoff, S. The nucleosomal barrier to promoter escape by RNA polymerase II is overcome by the chromatin remodeler Chd1. eLife. 3, 02042 (2014).
- Aughey, G. N., Southall, T. D. Dam it's good! DamID profiling of protein-DNA interactions. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 5 (1), 25-37 (2016).
- Wang, H., Mayhew, D., Chen, X., Johnston, M., Mitra, R. D. Calling Cards enable multiplexed identification of the genomic targets of DNA-binding proteins. Genome Res. 21 (5), 748-755 (2011).
- Schmid, M., Durussel, T., Laemmli, U. K. ChIC and ChEC: Genomic Mapping of Chromatin Proteins. Mol Cell. 16 (1), 147-157 (2004).
- Merz, K., et al. Actively transcribed rRNA genes in S. cerevisiae are organized in a specialized chromatin associated with the high-mobility group protein Hmo1 and are largely devoid of histone molecules. Genes Dev. 22 (9), 1190-1204 (2008).
- Schmid, M., et al. Nup-PI: The Nucleopore-Promoter Interaction of Genes in Yeast. Mol Cell. 21 (3), 379-391 (2006).
- Dunn, T., Gable, K., Beeler, T. Regulation of cellular Ca2+ by yeast vacuoles. J Biol Chem. 269 (10), 7273-7278 (1994).
- Grünberg, S., Henikoff, S., Hahn, S., Zentner, G. E. Mediator binding to UASs is broadly uncoupled from transcription and cooperative with TFIID recruitment to promoters. The EMBO Journal. 35 (22), 2435-2446 (2016).
- Gietz, R. D., Schiestl, R. H. High-efficiency yeast transformation using the LiAc/SS carrier DNA/PEG method. Nat. Protocols. 2 (1), 31-34 (2007).
- Rohland, N., Reich, D. Cost-effective, high-throughput DNA sequencing libraries for multiplexed target capture. Genome Res. 22 (5), 939-946 (2012).
- Orsi, G. A., Kasinathan, S., Zentner, G. E., Henikoff, S., Ahmad, K. Mapping regulatory factors by immunoprecipitation from native chromatin. Current protocols in molecular biology. Ausubel, F. M., et al. 110, 21-25 (2015).
- Heinz, S., et al. Simple Combinations of Lineage-Determining Transcription Factors Prime cis-Regulatory Elements Required for Macrophage and B Cell Identities. Mol Cell. 38 (4), 576-589 (2010).
- Kungulovski, G., et al. Application of histone modification-specific interaction domains as an alternative to antibodies. Genome Res. 24 (11), 1842-1853 (2014).
- Vogel, M. J., Peric-Hupkes, D., van Steensel, B. Detection of in vivo protein-DNA interactions using DamID in mammalian cells. Nat. Protocols. 2 (6), 1467-1478 (2007).
- Feeser, E. A., Wolberger, C. Structural and Functional Studies of the Rap1 C-Terminus Reveal Novel Separation-of-Function Mutants. J Mol Biol. 380 (3), 520-531 (2008).
- Neph, S., et al. An expansive human regulatory lexicon encoded in transcription factor footprints. Nature. 489 (7414), 83-90 (2012).
- Mountjoy, K. G., Kong, P. L., Taylor, J. A., Willard, D. H., Wilkison, W. O. Melanocortin receptor-mediated mobilization of intracellular free calcium in HEK293 cells. Physiol Genomics. 5 (1), 11-19 (2001).
- Seurin, D., Lombet, A., Babajko, S., Godeau, F., Ricort, J. -M. Insulin-Like Growth Factor Binding Proteins Increase Intracellular Calcium Levels in Two Different Cell Lines. PLoS ONE. 8 (3), e59323 (2013).
- Grienberger, C., Konnerth, A. Imaging Calcium in Neurons. Neuron. 73 (5), 862-885 (2012).
- Sander, J. D., Joung, J. K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nat Biotech. 32 (4), 347-355 (2014).
- Filion, G. J., et al. Systematic Protein Location Mapping Reveals Five Principal Chromatin Types in Drosophila Cells. Cell. 143 (2), 212-224 (2010).
- van Bemmel, J. G., et al. A Network Model of the Molecular Organization of Chromatin in Drosophila. Mol Cell. 49 (4), 759-771 (2013).
- Izzo, A., et al. The Genomic Landscape of the Somatic Linker Histone Subtypes H1.1 to H1.5 in Human Cells. Cell Rep. 3 (6), 2142-2154 (2013).
