Summary
Vi beskriver kromatin endogen klyvning kombinert med høy gjennomstrømningssekvensering (ChEC-seq), en kromatinimmunpresipitasjon (ChIP) -orthogonal metode for kartlegging av proteinbindingssteder som er genomspredte med mikrokocukleuklease (MNase) fusjonsproteiner.
Abstract
Genomfattende kartlegging av protein-DNA-interaksjoner er kritisk for forståelse av genregulering, kromatin-remodeling og andre kromatin-residente prosesser. Formaldehyd-tverrbinding etterfulgt av kromatinimmunutfelling og høy gjennomstrømningssekvensering (X-ChIP-seq) har blitt brukt til å få mange verdifulle innsikter i genombiologi. Imidlertid har X-ChIP-seq bemerkelsesverdige begrensninger knyttet til kryssbinding og sonikering. Native ChIP unngår disse ulempene ved å utelate kryssbinding, men resulterer ofte i dårlig gjenoppretting av kromatinbundne proteiner. I tillegg er alle ChIP-baserte metoder underlagt antistoffkvalitetshensyn. Enzymatiske metoder for kartlegging av protein-DNA-interaksjoner, som involverer fusjon av et protein av interesse for et DNA-modifiserende enzym, har også blitt brukt til å kartlegge protein-DNA-interaksjoner. Vi har nylig kombinert en slik metode, kromatin endogen spaltning (ChEC), med høy gjennomstrømningssekvensering som ChEC-seq. ChEC-seq er avhengig av fusjon av en kromatin-assocIat protein av interesse for mikrokocellnuklease (MNase) for å generere målrettet DNA-spaltning i nærvær av kalsium i levende celler. ChEC-seq er ikke basert på immunutfelling, og omgår så potensielle problemer med tverrbinding, sonikering, kromatinoppløseliggjøring og antistoffkvalitet samtidig som det gir kort oppløsning med minimalt bakgrunnssignal. Vi ser på at ChEC-seq vil være en kraftig motstykke til ChIP, og gir et selvstendig middel til å både validere ChIP-seq-funn og oppdage ny innsikt i genomisk regulering.
Introduction
Kartlegging av bindingssteder for transkripsjonsfaktorer (TFs), kromatinomformere og andre kromatinassosierte regulatoriske faktorer er nøkkelen til å forstå alle kromatinbaserte prosesser. Mens kromatinimmunpresipitasjon og høy gjennomstrømningssekvensering (ChIP-seq) tilnærminger har blitt brukt til å få mange viktige innsikt i genombiologi, har de bemerkelsesverdige begrensninger. Vi har nylig introdusert en alternativ metode, kalt kromatin endogen spaltning og høy gjennomstrømningssekvensering (ChEC-seq) 1 , for å omgå disse ulempene.
ChIP-seq utføres oftest med et innledende formaldehydforbindelsestrinn (X-ChIP-seq) for å bevare protein-DNA-interaksjoner. Imidlertid har en rekke nyere studier indikert at X-ChIP-seq fanger transient eller ikke-spesifikk protein-DNA-interaksjoner 2 , 3 , 4 , 5 <Sup>, 6 , 7 , 8 , som gir opphav til falske positive bindingssteder. I tillegg er sonikering, som vanligvis brukes til fragmentering av kromatin i X-ChIP-seq-eksperimenter, fortrinnsvis sakreområder av åpen kromatin, som fører til forspenet gjenvinning av fragmenter fra disse regionene 9 , 10 . Sonikering gir også en heterogen blanding av fragmentlengder, til slutt begrensende bindingsstedoppløsning, selv om tilsetningen av et eksonuklease-fordøyelsestrinn kan forbedre resolusjonen 11 , 12 i stor grad. Native ChIP-metoder som okkuperte regioner av genomer fra affinitetsrenset, naturlig isolert kromatin (ORGANISK) 13 bruker ikke tverrbinding og fragmentkromatin med mikrokocellnuklease (MNase), lindrer potensielle forstyrrelser assosiert med formaldehyd-tverrbinding og sonikering. Derimot,Løseligheten av mange kromatinbundne proteiner under de forholdsvis milde forhold som kreves for naturlig kromatinekstraksjon er dårlig, som potensielt fører til redusert dynamisk område og / eller falske negativer 14 .
Mens forskjellige iterasjoner av ChIP-seq er mest brukte for genomgående kartlegging av protein-DNA-interaksjoner, har også flere kartleggingsteknikker basert på fusjon av proteiner av interesse for forskjellige DNA-modifiserende enzymer blitt implementert. En slik tilnærming er DNA-adeninmetyltransferaseidentifikasjon (DamID) 15 , hvor et kromatinbindende protein av interesse er genetisk fusjonert til Dam, og denne fusjon uttrykkes i celler eller dyr, hvilket resulterer i metylering av GATC-sekvenser nærliggende for bindingssteder for proteinet. DamID er fordelaktig ved at den ikke stole på immunutfelling, og unngår således kryssbinding, antistoffer eller kromatinsolubilisering. Det utføres også in vivo . derimot, Er oppløsningen av DamID begrenset til kilobaseskalaen og metyleringsaktiviteten til Dam-fusjonsproteinet er konstitutiv. En andre metode basert på enzymatisk fusjon er Calling Card-seq 16 , som benytter fusjon av en faktor av interesse for en transposase, som dirigerer stedspesifikk integrering av transposoner. Som DamID er Calling Card-seq ikke basert på immunutfelling, og har dermed lignende fordeler, med den ekstra fordelen av økt oppløsning. Imidlertid kan Calling Card-seq være begrenset av sekvensbiaser av transposaser og er også avhengig av nærvær av restriksjonssteder nær transposoninnføringssteder.
En tredje enzymatisk fusjonsmetode, utviklet i Laemmli lab, er kromatin endogen spaltning (ChEC) 17 . I ChEC uttrykkes en fusjon mellom et kromatinassosiert protein og MNase i celler, og ved kalsiumtilsetning for å aktivere MNase spaltes DNA proksimalt til bindingssteder for merketFaktor ( figur 1 ). I forbindelse med Southern Blotting har ChEC blitt brukt til å karakterisere kromatinstruktur og proteinbinding ved et antall individuelle loci i gjær 17 , 18 , og har blitt kombinert med lavoppløselig mikroarrayanalyse for å undersøke samspillet mellom nukleære pore-komponenter med gjæren Genom 19 . ChEC tilbyr fordeler som ligner på DamID og Calling Card-seq, og oppløsningen er nesten single-base pair når den analyseres av primer forlengelse 19 . ChEC er også kontrollerbar: Robust DNA-spaltning ved MNase avhenger av tilsetning av millimolar kalsium, slik at MNase er inaktiv ved lave, lave kalsiumkonsentrasjoner observert i levende gjærceller 20 .
Tidligere postulerte vi at kombinere ChEC med høy gjennomstrømningssekvensering (ChEC-seq) ville gi kart med høy oppløsning på TF-bindingssteder. Faktisk, ChEC-seq genererte kart med høy oppløsning av de spirende gjær generelle regulatoriske faktorene (GRF) Abf1, Rap1 og Reb1 over genomet 1 . Vi har også brukt ChEC-seq med suksess på det modulære Mediator-komplekset, en konservert, essensiell global transkriptionell coaktivator 21 , som utvider bruken av ChEC-seq til megadalton-størrelse-komplekser som ikke direkte kontakter DNA og kan være vanskelig å kartlegge ved ChIP- Baserte metoder. ChEC-seq er en kraftig metode både for uavhengig validering av ChIP-seq-resultater og generering av ny innsikt i reguleringen av kromatin-residente prosesser. Her presenterer vi en trinnvis protokoll for implementering av denne metoden i spirende gjær.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Generering av gjærstammer
- Generer en gjærstamme som bærer faktoren av interesse merket med MNase.
- PCR amplifiser MNase-merkekassetten fra den ønskede vektoren ( tabell 1 ) ved å bruke den spesifiserte reaksjonsblandingen ( tabell 2 ) og syklusbetingelsene ( tabell 3 ). Bland 5 μL av PCR-reaksjonen og 1 μl 6X DNA-fargestoff. Kjør hver PCR-alikvot på en 0,8% agarosegel ved 120 V i 40 minutter. Den forventede produktstørrelsen er ~ 2,3 kb.
- Transformér den forsterkede merkekassetten til valgfri stamme ved å bruke standard litiumacetat-transformasjon 22 og utfør valg.
- Bekreft korrekt integrasjon av merkekassetten med koloni-PCR.
- Forbered den angitte reaksjonsblandingen ( tabell 4 ) for antall kolonier som skal screenes. Hold på is til behov.
- Velg en del av hver koloni som tesTed inn i bunnen av et PCR-rør ved hjelp av en steril tannpirke eller pipettespiss.
- Mikrobølgeovn de valgte koloniene ved høy effekt i 1 min.
- Tilsett 50 μl PCR-blanding ( tabell 4 ) til hver mikrobølget koloni og pipett opp og ned for å blande. Utfør PCR ved bruk av spesifiserte syklusforhold ( Tabell 5 ).
- Bland 50 μl PCR-reaksjonen og 10 μl 6X DNA-fargestoff direkte i hvert PCR-rør. Kjør 10 μl av hver prøve på en 1% agarosegel ved 120 V i 40 minutter. Den forventede produktstørrelsen er ~ 700 bp.
MERK: Hvis ønskelig, bekreft passende uttrykk for MNase-fusjonsproteinet via western blotting. Et ~ 20,6 kilodaltonforskyvning i molekylvekten til det merkede protein forventes.
- Generer en fri MNase-stamme ved homologi-basert kloning av promotoren av genet av interesse for pGZ136 (tabell 1) og transformasjon og seleksjon som i trinn 1.1.2.
- AlternatiVely, samle promotoren av genet av interesse og 3xFLAG-MNase-SV40 NLS i en plasmidvektor, transformer og velg som i trinn 1.1.2, og dyrk stammen i den passende selektive tilstanden for vedlikehold av plasmidet.
2. ChEC
- På ettermiddagen / kvelden dagen før ChEC-eksperimentet, inokulerer 3 ml gjærpepton-dextrose (YPD) eller passende selektivt medium med en enkelt koloni av stammen som bærer MNase-merket faktor. Inkubér denne kulturen over natten (180 RPM risting, 30 ° C).
- På morgenen på dagen for ChEC-eksperimentet fortynnes den overnatte kulturen i 50 ml medium til en optisk tetthet ved 600 nm (OD 600 ) på 0,2-0,3. Inkubér denne kulturen (180 RPM shaking, 30 ° C) til den når en OD 600 på 0,5-0,7. Når kulturen nærmer seg riktig OD 600 , sett varmeblokke eller vannbad til 30 ° C og begynn å tine buffer A tilsetningsstoffer ( TaBle 6).
- Forbered 5 ml Buffer A pluss tilsetningsstoffer ( tabell 6 ) per kultur. Hold buffer A ved RT under prosedyren.
- Forbered mikrofuge rør som inneholder 90 μL stoppløsning ( Tabell 7 ) og 10 μl 10% SDS for hvert tidspunkt som skal samles. For hver ny faktor som analyseres, ta prøver på 0 s, 30 s, 1 min, 2,5 min, 5 min og 10 min.
- Dekanter kulturen i et 50 ml konisk rør og sentrifuger ved 1500 xg og romtemperatur (RT) i 1 min.
- Resuspender celler grundig i 1 ml buffer A og overfør de resuspenderte celler til et mikrofugerør. Pellet resuspendert celler i en mikrofuge ved 1500 xg og RT i 30 s.
- Aspirer supernatant og grundig resuspender celler i 1 ml Buffer A ved pipettering opp og ned. Pellet resuspendert celler i en mikrofuge ved 1500 xg og RT i 30 s. Gjenta dette trinnet en gang.
- Resuspender celler grundig i 570 μl buffer A. Tilsett 30 μL 2% digitonin(0,1% endelig konsentrasjon) for å lette permeabilisering av cellene og invertere for å blande.
- Permeabiliser celler i varmeblokk eller vannbad ved 30 ° C i 5 minutter.
- Pipett reaksjonen opp og ned for å sikre jevn fordeling av celler. Fjern en 100 μl alikvot av permeabiliserte celler som en negativ kontroll til en mikrofugerør som inneholder stoppløsning og SDS (trinn 2.4) og hvirvel kort for å blande.
- Tilsett 1,1 μL av 1 M CaCl2 (2 mM sluttkonsentrasjon) til permeabiliserte celler for å aktivere MNase og omkjøl flere ganger raskt eller virvel kort for å blande. Returner straks den blandede reaksjonen ved 30 ° C og start en timer.
- På hvert tidspunkt som skal samles, pipetter reaksjonen opp og ned for å sikre en jevn fordeling av celler, og deretter fjerne en 100 μl alikvot av permeabiliserte celler til et mikrofiberrør som inneholder stoppløsning og SDS og virvel kort for å blande. For hver ny faktor analysert, ta 0 s (ingen CaCl 2 tilsatt), 30 s, 1 min, 2,5 min, 5 min og 10 min tidspunkter.
MERK: ChEC-eksperimenter med faktorer som raskt spalter DNA ved 30 ° C, kan utføres ved lavere temperaturer for langsom MNase spaltningskinetikk. - Når alle tidspunkter er samlet, tilsettes 4 μL 20 mg / ml proteinase K til hver prøve, virvelformes kort for å blande og inkuberes ved 55 ° C i 30 minutter.
- Tilsett 200 μL 25: 24: 1 fenol: kloroform: isoamylalkohol til hver prøve, vortex kraftig å blande, og sentrifuger med maksimal hastighet og RT i en mikrofuge i 5 minutter.
- Fjern hver vandig fase (~ 150 μL) til et nytt rør. Tilsett 30 μg glykogen og 500 μl 100% etanol. Vortex kraftig å blande og utfelle på tøris i 10 minutter eller til løsningen er viskøs.
- Pelletfeltet DNA ved maksimal hastighet og 4 ° C i en mikrofuge i 10 minutter.
- Dekanter supernatanter og vask pellets med 1 ml RT 70% etanol.
- Dekanter etanol, fjern resten ved å vende enD forsiktig tappe på rørene på et papirhåndkle. Spinn prøver kort ved hjelp av en benchtop-sentrifuge og bruk en pipette for å fjerne resterende etanol, pass på at du ikke forstyrrer pelleten. Luft-tørre pellets til RT i 5 min.
- Mens pellets tørker, lage en mesterblanding for å resuspendere tørkede pellets i 29 μl Tris, pH 8,0 + 1 μL 10 mg / ml RNase A hver. Digest RNA ved 37 ° C i 20 minutter.
- Bland 1 μl 6X DNA-fargestoff med 5 μl av hver prøve og løp på en 1,5% agarosegel ved 120 V i 40 minutter.
3. Størrelsesvalg
MERK: Målet med størrelsesvalg er å fjerne multi-kilobase fragmenter av genomisk DNA fra prøven som skal sekvenseres og berike fragmenter på ~ 150 bp (omtrent størrelsen på nukleosomalt DNA) eller mindre. I sekvenseringsdata er fragmenter <400 bp beriket, med en merkbar topp rundt størrelsen på nukleosomalt DNA (~ 150 bp) og en topp eller bred fordeling av subnucleosomale fragmenter.
<ol>MERK: Analyse av ChEC-seq-data er en kompleks prosedyre og utover omfanget av denne artikkelen. Detaljert informasjon om dataanalyse finner du i tidligere publikasjoner 1 , 21 , og de tilpassede skriptene som brukes for analyse, er tilgjengelige på GitHub (https://github.com/zentnerlab/chec-seq). HOMER 25 (http://homer.salk.edu) kan også brukes til kommandolinjeanalyse av ChEC-seq-data.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I tilfelle av et vellykket ChEC-eksperiment vil analyse av DNA ved agarosegelelektroforese avsløre en kalsiumavhengig økning i DNA-fragmentering over tid, som indikert ved smøring og eventuelt fullstendig fordøyelse av genomisk DNA. I noen tilfeller observeres en stige av bånd som ligner den som er sett med en tradisjonell MNase-fordøyelse etter utvidet fordøyelse. Dette er tilfelle for ChEC analyse av Reb1, en generell regulatorisk faktor som binder nukleosomutarmede regioner (NDR) ( Figur 2 ). Vi har funnet, i tilfelle av GRFs, utvidet fordøyelse fører til tap av signal på raskt spaltede bindingssteder 1 . Ideelt sett vil et prøve med en reduksjon i størrelsen på det genomiske DNA-båndet som viser høymolekylær smearing, så som 30 s og 1 min tidspunkter for Reb1 ChEC, bli brukt for sekvensering for å unngå tidsavhengig tap av signal .
figur 3 ). På samme måte observerer vi betydelig DNA-spaltning ved en fusjon av mediator-underenheten Med8 med MNase, men ikke fri MNase drevet av MED8-promoteren , 1 min etter kalsiumtilsetning ( figur 3 ).
For å sammenligne Reb1 ChEC-seq data til ChIP-seq, oppnådde vi en liste over 1,991 Reb1 topper bestemt av ORGANIC 13 . Disse toppene var motifokusert med gjennomsnittlig fragmentendeltall ved hver basisposisjon i et 100 bp vindu rundt motivets midtpunkt. Vi observert en slående asymmetri i spaltning, med flertallet av fragmenter slutter kartlegging til oppstrømsiden av motivet (Figur 4 ).
Figur 1 : Skjematisk av ChEC-seq-metoden. En kromatinassosiert protein (CAP) -MNase-fusjon uttrykkes i gjærceller. Proteinet binder seg til DNA, men genererer ikke spaltning over bakgrunnsnivåer på grunn av det svært lave frie kalsium i kjernen. Ved permeabilisering av celler med digitonin og tilsetning av millimolar kalsium bundet CAP-MNase-fusjoner til genom-spalt DNA, som frigjør små fragmenter. Disse fragmentene renses deretter, sekvenseres og mappes tilbake til genomet, hvilket gir topper av fragmentendene nært til bindingssteder for CAP-MNase-fusjonen. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2 : Agarose gelelektroforese av DNA fra et Reb1 ChEC-eksperiment. En 5 μl alikvot av DNA fra hvert ChEC-tidspunkt ble analysert på en 1,5% TAE-agarosegel før størrelsesvalg. Dette viser progressiv fordøyelse av genomisk DNA ved Reb1-MNase-fusjonen. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3 : Snapshots av genombrowser av Reb1-MNase og gratis MNase ChEC-seq-eksperimenter. IGV-syn på fragment-endesignal for Reb1 og fri MNase ChEC-seq 30 s etter kalsiumtilsetning og Med8 og fri MNase ChEC-seq 1 min av Ter kalsium tilsetning langs et representativt segment av gjærgenomet. Datasettene ble normalisert ved å dividere antall fragmentendenser som er kartlagt til hver basisposisjon ved totalt antall fragmentendene kartlagt og multiplisere med det totale antall baser som er kartlagt. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4 : Berikning av Reb1-MNase-utgitt fragmenter Ender rundt Reb1 ORGANISKE nettsteder. Gjennomsnittlig tomt på 30 s Reb1 og gratis MNase ChEC-seq-fragment sluttignal rundt 1,991 Reb1 motiver bestemt av ORGANIC 13 . Data ble normalisert som i figur 3 .Lank "> Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| plasmid | Gjærvalgbar markør | Merknader | Addgen-plasmidnummer |
| pGZ108 | kanMX6 | 3xFLAG-MNase-merking, 33 aa linker | 70231 |
| pGZ109 | HIS3MX6 | 3xFLAG-MNase-merking, 33 aa linker | 70232 |
| pGZ110 | TRP1 | 3xFLAG-MNase-merking, 33 aa linker | 70233 |
| pGZ136 | URA3 | Expresserer 3xFLAG-MNase-SV40 NLS under kontroll av REB1-promotoren | 72273 |
| pGZ173 | kanMX6 | MNase tagging, 8 aa linker | 70234 |
Tabell 1: Detaljer om ChEC Plasmider. Alle merkingsvektorer er basert på pFA6a vektorer og er så kompatible med de brukte F2 / R1-merkingsprimerparene. Merkekassetten består av en linker av den angitte lengde, en 3xFLAG-epitop for å lette deteksjon ved western blotting (unntatt i tilfelle av pGZ173, hvor linkeren er blitt forkortet for å fjerne 3xFLAG-taggen), den modne kjeden av MNase (GenBank P00644 , Aa 83 - 231), og den angitte valgbare markør.
| reagens | Volum | [Endelig] |
| 5x PCR buffer | 10 ml | 1 x (2 mM MgCl2) |
| 10 mM dNTP-blanding (2,5 mM hver dNTP) | 1 ml | 200 mM (50 mM hver dNTP) |
| 10 mM F2 primer | 2,5 ml | 0,5 mM |
| 10 mM R1 pRimer | 2,5 ml | 0,5 mM |
| PGZ108 / 109/110/172 (1-5 ng / ml) | 1 ml | |
| 2 U / μL hot start high-fidelity polymerase | 0,5 ml | 1 U |
| DdH20 | 32,5 ml |
Tabell 2: Reaksjonsblanding for PCR-amplifisering av 3xFLAG-MNase-merkekassetter. F2 / R1-primer-sekvenser kan bli funnet på http://yeastgfp.yeastgenome.org/yeastGFPOligoSequence.txt.
| Temperatur (° C) | Tid | Cycles |
| 98 | 30 s | 1 |
| 98 | 10 s | 25 |
| 55 | 30 s | 25 |
| 72 1 min 15 s | 25 | |
| 72 | 2 min | 1 |
| 10 | For alltid | Holde |
Tabell 3: Termiske syklingsbetingelser for PCR-amplifisering av 3xFLAG-MNase-merkekassetter. Inkubasjonstemperatur og forlengelsestid kan måtte justeres basert på den anvendte DNA-polymerase.
| reagens | Volum | [Endelig] |
| 10 x Taq buffer | 5 ml | 1x (1,5 mM MgCl2) |
| 10 mM dNTP-blanding (2,5 mM hver dNTP) | 1 ml | 200 mM (50 mM hver dNTP) |
| 10 mM Kontroller primer | 1 ml | 0,2 mM |
| 10 mM MNase-R eller negativ kontrollprimer | 1 ml | 0,2 mM |
| 5 U / ml Taq-polymerase | 0,5 ml | 2,5 U |
| DdH20 | 41,5 ml |
Tabell 4: Reaksjonsblanding for koloni-PCR-bekreftelse av MNase-merking. Kontroller primersekvenser finnes på http://yeastgfp.yeastgenome.org/yeastGFPOligoSequence.txt. Kontrollprimeren blir brukt som den fremre primer sammen med en revers primer i MNase (5'-TTGTGCAGCTTCTTGGTAC-3 ') og en revers primer ~ 500 basepar (bp) nedstrøms for det respektive gen som en negativ kontroll.
| Temperatur (° C) | Tid | Cycles |
| 95 | 5 min | 1 |
| 95 | 30 s | 35 |
| 55 | 30 s | 35 |
| 68 | 1 minutt | 35 |
| 68 | 5 min | 1 |
| 10 | For alltid | Holde |
Tabell 5: Termiske syklingsbetingelser for kolon-PCR-bekreftelse av MNase-merking. Inkubasjonstemperatur og forlengelsestid kan måtte justeres basert på den anvendte DNA-polymerase.
| reagens | Volum | [Endelig] |
| 1 M Tris, pH 7,5 | 1,5 ml | 15 mM |
| 1 M KCl | 8 ml | 80 mM |
| 0,2 M EGTA | 50 ml | 0,1 mM |
| DdH20 | Fyll til 100ml |
Tabell 6: Oppskrift for buffer A. Før bruk, tilsett halvparten av en proteasehemmertablett, 50 μl 100 mM PMSF (1 mM slutt), 5 ul 200 mM spermin (0,2 mM slutt) og 2,5 μl 1 M Spermidin (0,5 mM slutt) per 5 ml oppløsning.
| reagens | Volum | [Endelig] |
| 5 M NaCl | 8 ml | 400 mM |
| 0,5 M EDTA | 4 ml | 20 mM |
| 0,2 M EGTA | 2 ml | 4 mM |
| DdH20 | Fyll til 100 ml |
Tabell 7: Oppskrift på 2x stoppløsning. Kombinere 90 μL stoP-løsning med 10 μl 10% SDS i et mikrofugerør for hvert tidspunkt som skal tas (se trinn 2.4).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi har vist at ChEC kan kartlegge ulike klasser av gjærproteiner på kromatin, og forutse at den vil være bredt anvendelig for forskjellige familier av TF og andre kromatinbindende faktorer i gjær. ChEC-seq er fordelaktig ved at den ikke krever tverrbinding, kromatinsolubilisering eller antistoffer. Således unngår ChEC artefakter som er potensielt tilstede i X-ChIP-seq, slik som hyper-ChIPable artefact 3 , 4 og native ChIP, slik som falske negativer på grunn av ufullstendig proteinoppløseliggjøring 14 . Den største ulempen ved ChEC-seq, som med alle enzymatiske fusjonsmetoder, er kravet til et fusjonsprotein. Dette kan oppnås raskt i spirende gjær, men er mer arbeidskrevende i metazoaner. En annen begrensning av ChEC-seq er at den ikke kan implementeres som er for profilering av histon-modifikasjoner. Et modifikasjonsbindende domene kan imidlertid fusjoneres til MNase og uttrykkes, slik at hIstone modifikasjon kartlegging med ChEC-seq. I denne vene har ChIP-seq ved hjelp av epitop-merkede histon-modifikasjonsbindende domener blitt brukt til å kartlegge genom-brede mønstre av histon-modifikasjon 26 .
Bruken av en fri MNase-kontroll er viktig for å fastslå spesifisiteten av ChEC-seq-resultatene. Den frie MNase-stammen bærer MNase merket med 3xFLAG og et simianvirus 40 nukleært lokaliseringssignal (SV40 NLS) under kontroll av den endogene promotor for det gen som er interessert. Det er konseptuelt lik den ufylte Dam-kontrollen som brukes i DamID-studier 27 og kontrollerer for uspecifik spaltning på grunn av chromatin tilgjengelighet. Som en gratis MNase-kontroll for TF ChEC-seq integrerte vi 3xFLAG-MNase-SV40 NLS drevet av REB1-promotoren på ura3- locus 1 . For Mediator ChEC-seq uttrykte vi 3xFLAG-MNase-SV40 NLS under kontroll av MED8-promotoren i en ikke-integrerende plasmaD vektor opprettholdt i selektivt medium 21 . I begge tilfeller ble det observert svært liten spaltning ved fri MNase. Således bør en enkelt kontrollstamme hvor 3xFLAG-MNase-SV40 NLS drives av en relativt robust promotor være hensiktsmessig for de fleste eksperimenter.
Når du planlegger et ChEC-eksperiment, kan strukturell vurdering av protein av interesse være viktig. For eksempel fant vi at vedlegg MNase til C-terminalen til Reb1 ga et asymmetrisk spaltningsmønster rundt Reb1-motiver, mens ekspresjon av Reb1 med N-terminale MNase ga et symmetrisk spaltningsmønster 1 . Vi tilordner disse forskjellige spaltningsmønstre til strukturen til Reb1. DNA-bindingsdomene til Reb1 er lokalisert ved dets C-terminus; C-terminalen er således strukturert og nær DNA, som begrenser bevegelsesområdet for MNase og tillater bare C-terminal spaltning. I motsetning er C-terminalen til Abf1 relativt ustrukturert og kan således virke å øke tilRekkevidde av MNase, slik at spalting på begge sider av Abf1 bindingssteder. I tilfelle av Rap1, en annen gjær GRF, fant vi at forkortelse av linkeren mellom C-terminalen og MNase fra 33 til 8 aa var tilstrekkelig til å alvorlig redusere spaltning, kanskje på grunn av den foreslåtte avstanden til den C-terminale delen av Rap1 fra DNA 28 . Slike strukturelle hensyn er også sannsynlig å være viktig når man prøver å kartlegge bindingen av proteiner som er tilstede i store komplekser. For vår ChEC-seq-analyse av mediatorbinding til gjærgenomet 21 valgte vi underenheter hvis C-termini strukturelt var antatt å bli eksponert, snarere enn begravet i komplekset. Av de tre underenhetene fusjonert til MNase kløftet man ikke kraftig DNA, noe som tyder på at enten steriske begrensninger eller interaksjoner med andre DNA-bindingsfaktorer dempet DNA-spaltning.
Vi fant at ChEC-seq oppdager 4-12 ganger flere topper for gjær GRFs Abf1, Rap1 og Reb1 enn forskjellige ChIP-tilnærminger når alle tidspunkter ble vurdert sammen 1 . Disse områdene kan deles i to klasser basert på MNase spaltningskinetikk. Analyse av ChEC-seq-data for gjær-GRFer viste to midlertidig forskjellige klasser av bindingssteder 1 . Den første, kalt "rask" vises maksimal spaltning <1 min etter kalsiumtilsetning og inneholder generelt robuste kamper til kjente konsensusmotiver. Den andre, kalt "langsom", tok flere minutter for å nå merkbare nivåer av spaltning og var utarmet av motivkamp. Begge klassene av nettsteder ble i gjennomsnitt anriket for binding i ChIP datasett, selv om de ikke nødvendigvis ble kalt som topper i de ChIP-studiene. De fleste nettstedene for en gitt faktor var langsomme sider. Vi spekulerer på at raske steder er representative for high-affinitet transkripsjonsfaktorbindingssteder, mens tregte steder representerer loci transientt samplet under bindingsstedets skanning. ObBetjening av to klasser bindingssteder adskilt av kinetikken av MNase-spaltning kan forklare observasjonen i mange ChIP-seq datasett at et stort antall topper for en gitt faktor med en veletablert DNA-bindingsspecifikitet ikke inneholder et konsensusmotiv 29 : Formaldehyd-tverrbinding, utført i 10-15 minutter i de fleste ChIP-protokoller, kan gjentatte ganger fange forbigående eller opportunistiske interaksjoner av en faktor med genomet, som fører til signalvekst. Faktisk foreslår sammenligning av ChIP-exo og levende cellebilder at dette er tilfelle 2 . Spesielt observerte vi ikke en så dramatisk tidsavhengig reduksjon i Mediator ChEC-seq-signaler 21 , med Mediator ChEC-seq-signalet relativt konstant fra 30 s til 20 min. Gitt disse observasjonene, anbefaler vi at du utfører ChEC-seq med kort varighet for å gjenopprette bindingssteder med høy tillit.
Vi forventer at ChEC-seq kan tilpasses til ikke-gjærsystemer. Konsentrasjonen av fritt kalsium i ustimulerte pattedyrceller er 50-300 nM 30 , 32 , langt under terskelen for effektiv MNase-aktivering. Begrensningstrinnet for etablering av ChEC-seq i metazoan-systemer er således dannelsen av fusjonsproteiner, som forblir langt mer arbeidskrevende i metazoan enn gjærceller. Imidlertid har endogen merking av metazoan-genene blitt sterkt tilrettelagt ved adventen av CRISPR-basert genomteknikk 33 , og denne begrensningen bør derfor lett overføres. Alternativt kan MNase-fusjonsproteiner uttrykkes ved lave nivåer fra plasmider. Denne tilnærmingen har vært ganske vellykket for DamID i Drosophila 34 , 35 og human 36- celler, og kan dermed også lette ChEC-seq i metazoanceller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi takker Moustafa Saleh og Jay Tourigny for kritisk lesning av manuskriptet og Steven Hahn og Steven Henikoff for mentorskap og støtte under utviklingen av ChEC-seq og dens anvendelse til Mediator-komplekset. SG støttes av NIH tilskudd R01GM053451 og R01GM075114, og GEZ støttes av Indiana University oppstartsmidler.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| dNTPs | NEB | N0447 | |
| Q5 high-fidelity DNA polymerase | NEB | M0491L | Other high-fidelity DNA polymerases, such as Phusion, may be used for cassette amplification. |
| TrackIt 1 Kb Plus DNA ladder | ThermoFisher Scientific | 10488085 | |
| Taq DNA polymerase | NEB | M0273L | |
| cOmplete Mini EDTA-free protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | 11836170001 | It is important that an EDTA-free protease inhibitor mix is used, so as not to inhibit MNase cleavage by chelation of Ca2+. |
| PMSF | ACROS Organics | AC215740010 | |
| Digitonin, High Purity | EMD Millipore | 300410-250MG | Make a 2% stock by dissolving 20 mg digitonin in 1 mL DMSO with vigorous vortexing. |
| Proteinase K, 20 mg/mL | Invitrogen | 25530049 | |
| RNase A, 10 mg/mL | ThermoFisher Scientific | EN0531 | |
| Ampure XP beads | Beckman Coulter | A63880 | Ampure-like beads can be generated using a published protocol (ref 24). |
| MagneSphere magnetic rack | Promega | Z5342 |
References
- Zentner, G. E., Kasinathan, S., Xin, B., Rohs, R., Henikoff, S. ChEC-seq kinetics discriminates transcription factor binding sites by DNA sequence and shape in vivo. Nat Commun. 6, 8733 (2015).
- Chen, J., et al. Single-Molecule Dynamics of Enhanceosome Assembly in Embryonic Stem Cells. Cell. 156 (6), 1274-1285 (2014).
- Teytelman, L., Thurtle, D. M., Rine, J., van Oudenaarden, A. Highly expressed loci are vulnerable to misleading ChIP localization of multiple unrelated proteins. Proc Natl Acad Sci USA. 110 (46), 18602-18607 (2013).
- Park, D., Lee, Y., Bhupindersingh, G., Iyer, V. R. Widespread Misinterpretable ChIP-seq Bias in Yeast. PLoS ONE. 8 (12), 83506 (2013).
- Jain, D., Baldi, S., Zabel, A., Straub, T., Becker, P. B. Active promoters give rise to false positive 'Phantom Peaks' in ChIP-seq experiments. Nucleic Acids Res. , (2015).
- Krebs, W., et al. Optimization of transcription factor binding map accuracy utilizing knockout-mouse models. Nucleic Acids Res. 42 (21), 13051-13060 (2014).
- Paul, E., Zhu, Z. I., Landsman, D., Morse, R. H. Genome-Wide Association of Mediator and RNA Polymerase II in Wild-Type and Mediator Mutant Yeast. Mol Cell Biol. 35 (1), 331-342 (2015).
- Worsley Hunt, R., Wasserman, W. W. Non-targeted transcription factors motifs are a systemic component of ChIP-seq datasets. Genome Biol. 15 (7), 412 (2014).
- Vega, V. B., Cheung, E., Palanisamy, N., Sung, W. -K. Inherent Signals in Sequencing-Based Chromatin-ImmunoPrecipitation Control Libraries. PLoS ONE. 4 (4), 5241 (2009).
- Teytelman, L., et al. Impact of Chromatin Structures on DNA Processing for Genomic Analyses. PLoS ONE. 4 (8), 6700 (2009).
- Rhee, H. S., Pugh, B. F. Comprehensive Genome-wide Protein-DNA Interactions Detected at Single-Nucleotide Resolution. Cell. 147 (6), 1408-1419 (2011).
- He, Q., Johnston, J., Zeitlinger, J. ChIP-nexus enables improved detection of in vivo transcription factor binding footprints. Nat Biotech. 33 (4), 395-401 (2015).
- Kasinathan, S., Orsi, G. A., Zentner, G. E., Ahmad, K., Henikoff, S. High-resolution mapping of transcription factor binding sites on native chromatin. Nat Methods. 11 (2), 203-209 (2014).
- Skene, P. J., Hernandez, A. E., Groudine, M., Henikoff, S. The nucleosomal barrier to promoter escape by RNA polymerase II is overcome by the chromatin remodeler Chd1. eLife. 3, 02042 (2014).
- Aughey, G. N., Southall, T. D. Dam it's good! DamID profiling of protein-DNA interactions. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 5 (1), 25-37 (2016).
- Wang, H., Mayhew, D., Chen, X., Johnston, M., Mitra, R. D. Calling Cards enable multiplexed identification of the genomic targets of DNA-binding proteins. Genome Res. 21 (5), 748-755 (2011).
- Schmid, M., Durussel, T., Laemmli, U. K. ChIC and ChEC: Genomic Mapping of Chromatin Proteins. Mol Cell. 16 (1), 147-157 (2004).
- Merz, K., et al. Actively transcribed rRNA genes in S. cerevisiae are organized in a specialized chromatin associated with the high-mobility group protein Hmo1 and are largely devoid of histone molecules. Genes Dev. 22 (9), 1190-1204 (2008).
- Schmid, M., et al. Nup-PI: The Nucleopore-Promoter Interaction of Genes in Yeast. Mol Cell. 21 (3), 379-391 (2006).
- Dunn, T., Gable, K., Beeler, T. Regulation of cellular Ca2+ by yeast vacuoles. J Biol Chem. 269 (10), 7273-7278 (1994).
- Grünberg, S., Henikoff, S., Hahn, S., Zentner, G. E. Mediator binding to UASs is broadly uncoupled from transcription and cooperative with TFIID recruitment to promoters. The EMBO Journal. 35 (22), 2435-2446 (2016).
- Gietz, R. D., Schiestl, R. H. High-efficiency yeast transformation using the LiAc/SS carrier DNA/PEG method. Nat. Protocols. 2 (1), 31-34 (2007).
- Rohland, N., Reich, D. Cost-effective, high-throughput DNA sequencing libraries for multiplexed target capture. Genome Res. 22 (5), 939-946 (2012).
- Orsi, G. A., Kasinathan, S., Zentner, G. E., Henikoff, S., Ahmad, K. Mapping regulatory factors by immunoprecipitation from native chromatin. Current protocols in molecular biology. Ausubel, F. M., et al. 110, 21-25 (2015).
- Heinz, S., et al. Simple Combinations of Lineage-Determining Transcription Factors Prime cis-Regulatory Elements Required for Macrophage and B Cell Identities. Mol Cell. 38 (4), 576-589 (2010).
- Kungulovski, G., et al. Application of histone modification-specific interaction domains as an alternative to antibodies. Genome Res. 24 (11), 1842-1853 (2014).
- Vogel, M. J., Peric-Hupkes, D., van Steensel, B. Detection of in vivo protein-DNA interactions using DamID in mammalian cells. Nat. Protocols. 2 (6), 1467-1478 (2007).
- Feeser, E. A., Wolberger, C. Structural and Functional Studies of the Rap1 C-Terminus Reveal Novel Separation-of-Function Mutants. J Mol Biol. 380 (3), 520-531 (2008).
- Neph, S., et al. An expansive human regulatory lexicon encoded in transcription factor footprints. Nature. 489 (7414), 83-90 (2012).
- Mountjoy, K. G., Kong, P. L., Taylor, J. A., Willard, D. H., Wilkison, W. O. Melanocortin receptor-mediated mobilization of intracellular free calcium in HEK293 cells. Physiol Genomics. 5 (1), 11-19 (2001).
- Seurin, D., Lombet, A., Babajko, S., Godeau, F., Ricort, J. -M. Insulin-Like Growth Factor Binding Proteins Increase Intracellular Calcium Levels in Two Different Cell Lines. PLoS ONE. 8 (3), e59323 (2013).
- Grienberger, C., Konnerth, A. Imaging Calcium in Neurons. Neuron. 73 (5), 862-885 (2012).
- Sander, J. D., Joung, J. K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nat Biotech. 32 (4), 347-355 (2014).
- Filion, G. J., et al. Systematic Protein Location Mapping Reveals Five Principal Chromatin Types in Drosophila Cells. Cell. 143 (2), 212-224 (2010).
- van Bemmel, J. G., et al. A Network Model of the Molecular Organization of Chromatin in Drosophila. Mol Cell. 49 (4), 759-771 (2013).
- Izzo, A., et al. The Genomic Landscape of the Somatic Linker Histone Subtypes H1.1 to H1.5 in Human Cells. Cell Rep. 3 (6), 2142-2154 (2013).
