Summary
우리는 micrococcal nuclease (MNase) 융합 단백질로 게놈 전체 단백질 바인딩 사이트를 매핑하기위한 염색질 immunoprecipitation (ChIP) - 직교 방식 높은 처리량 시퀀싱 (ChEC - seq)와 결합 염색질 내생 절단을 설명합니다.
Abstract
게놈 전체에 걸친 단백질 -DNA 상호 작용의 매핑은 유전자 조절, 염색질 재구성 및 기타 염색질 상주 과정을 이해하는 데 중요합니다. 염색질 면역 침전 및 높은 처리량 시퀀싱 (X-ChIP-seq)에 따른 포름 알데히이드 가교는 게놈 생물학에 대한 많은 가치있는 통찰력을 얻기 위해 사용되었습니다. 그러나 X-ChIP-seq는 가교 결합 및 초음파 처리와 관련하여 주목할만한 한계가 있습니다. 네이티브 칩은 가교 결합을 생략함으로써 이러한 결점을 피하지만 종종 크로 마틴 결합 단백질의 빈약 한 회복을 초래합니다. 또한 모든 ChIP 기반 방법은 항체 품질 고려 사항의 적용을받습니다. 단백질을 DNA 변형 효소에 융합시키는 단백질 -DNA 상호 작용을 매핑하는 효소 적 방법도 단백질 -DNA 상호 작용을 매핑하는 데 사용되어왔다. 우리는 최근 ChEC-seq와 같은 high-throughput sequencing을 가진 chromatin endogenous cleavage (ChEC)와 같은 방법을 조합했다. ChEC-seq은 염색체 결합체 (chromatin-assoc)의 융합에 의존한다생균 내 칼슘의 존재하에 표적화 된 DNA 절단을 생성하기 위해 미세 구균 핵산 분해 효소 (MNase)에 관심있는 대상 단백질. ChEC-seq은 면역 침전을 기반으로하지 않으며 가교 결합, 초음파 처리, 염색질 가용화 및 항체 품질에 대한 잠재적 인 우려를 회피하면서 최소한의 배경 신호로 고해상도 매핑을 제공합니다. 우리는 ChEC-seq가 ChIP에 대한 강력한 대응 물이 될 것이며, ChIP-seq 발견을 검증하고 게놈 규제에 대한 새로운 통찰력을 발견 할 수있는 독립적 인 수단을 제공 할 것이라고 기대한다.
Introduction
전사 인자 (TF), 염색질 리모델러 및 기타 염색질 관련 규제 요소의 결합 부위를 매핑하는 것이 모든 염색소 기반 프로세스를 이해하는 데 중요합니다. 염색질 면역 침전 및 높은 처리량 시퀀싱 (ChIP-seq) 접근법은 게놈 생물학에 대한 많은 중요한 통찰력을 얻기 위해 사용되었지만 주목할만한 한계가 있습니다. 우리는 최근 이러한 단점을 피하기 위해 염색질 내인성 절단 및 높은 처리량 시퀀싱 (ChEC - seq) 1 라고하는 대체 방법을 도입했습니다.
ChIP-seq는 단백질 -DNA 상호 작용을 보존하기 위해 초기 포름 알데히드 가교 결합 단계 (X-ChIP-seq)로 수행되는 것이 가장 일반적입니다. 그러나 최근의 여러 연구에 따르면 X-ChIP-seq는 일시적 또는 비특이적 단백질 -DNA 상호 작용을 2 , 3 , 4 , 5 <거짓 양성 결합 부위를 유발하는 6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16, 또한 X-ChIP-seq 실험에서 염색질을 단편화하는 데 일반적으로 사용되는 초음파 처리는 열린 염색질의 영역을 우선적으로 절단하여이 영역에서 단편의 편향된 회수를 유도합니다 9 , 10 . Sonication 또한 exonuclease 소화 단계의 추가가 크게 해상도 11 , 12 을 향상시킬 수 있지만, 단편 길이의 이질적인 혼합물을 궁극적으로 바인딩 사이트 해상도를 제한한다. 친화도가 높고 자연적으로 분리 된 염색질 (ORGANIC) 13 에서 게놈의 점령 된 영역과 같은 기본 ChIP 방법은 포름 알데히이드 가교 결합 및 초음파 처리와 관련된 잠재적 인 편향을 경감시켜 미세 크로스 캡슐 핵산 분해 효소 (MNase)와 교차 결합 및 크로 마틴 조각을 사용하지 않습니다. 하나,네이티브 염색질 추출에 필요한 비교적 온화한 조건에서 많은 염색질 결합 단백질의 용해도가 낮아 잠재적으로 동적 범위 및 / 또는 거짓 네거티브 14 가 감소합니다.
ChIP-seq의 다양한 반복이 단백질 -DNA 상호 작용의 게놈 - 전체 매핑에 가장 일반적으로 사용되는 반면, 관심있는 단백질과 다양한 DNA- 변형 효소의 융합을 기반으로하는 여러 매핑 기술이 구현되었다. 이러한 접근법 중 하나는 목적하는 염색질 결합 단백질이 댐에 유 전적으로 융합되고이 융합이 세포 또는 동물에서 발현되어 단백질 결합 부위에 인접한 GATC 서열의 메틸화를 초래하는 DNA 아데닌 메틸 전이 효소 동정 (DamID) 15 이다. DamID는 면역 침강에 의존하지 않으며 가교 결합, 항체 또는 염색질 가용화를 피할 수 있다는 점에서 유리하다. 그것은 또한 생체 내에서 수행 됩니다. 하나, DamID의 분해능은 킬로베이스 스케일로 제한되며, 댐 융합 단백질의 메틸화 활성은 구성 성이다. 효소 결합에 기초한 두 번째 방법은 트랜스포존에 대한 관심있는 인자의 융합을 이용하여 트랜스포존의 부위 특이 적 통합을 지시하는 Calling Card-seq 16 이다. DamID와 마찬가지로, Calling Card-seq은 면역 침강을 기반으로하지 않으므로 증가 된 해상도의 이점이있는 유사한 장점이 있습니다. 그러나, Calling Card-seq은 트랜스포존의 서열 편향에 의해 제한 될 수 있으며 또한 트랜스포존 삽입 부위에 가까운 제한 효소의 존재에 의존한다.
Laemmli 연구실에서 개발 된 세 번째 효소 융합 방법은 염색질 내인성 절단 (ChEC) 17 입니다. ChEC에서는 염색질 관련 단백질과 MNase 사이의 융합이 세포에서 발현되며, MNase를 활성화시키기 위해 칼슘을 첨가하면 DNA가 태그가 붙은 결합 부위 근방에서 절단됩니다요인 ( 그림 1 ). Southern blotting과 함께, ChEC는 yeast 17 , 18 에서 다수의 개별 유전자좌에서 염색질 구조와 단백질 결합을 특성화하는데 사용되어 왔으며 , 저해상도 마이크로 어레이 분석과 결합하여 핵 세공 성분과 효모의 상호 작용을 조사했다 게놈 19 . ChEC는 DamID 및 Calling Card-seq와 유사한 이점을 제공하며, primer extension 19로 분석 할 때 그 해상도는 거의 단일 염기 쌍이다. ChEC는 또한 조절할 수 있습니다 : MNase에 의한 견고한 DNA 절단은 밀리몰 칼슘의 첨가에 달려있어 MNase는 살아있는 효모 세포에서 관찰되는 낮은 유리 칼슘 농도에서 불활성입니다 20 .
이전에 우리는 ChEC와 고효율 시퀀싱 (ChEC-seq)을 결합하면 TF 바인딩 사이트의 고해상도 맵을 제공 할 것이라고 가정했습니다. 사실, ChEC-seq는 게놈 1을 가로 지르는 신진 효모 일반 조절 인자 (Abf1, Rap1, Reb1)의 고해상도지도를 생성했습니다. 우리는 또한 ChEC-seq를 DNA와 직접 접촉하지 않고 ChIP-seq로지도 화하기 어려울 수있는 메가 달톤 크기의 복합체로 ChEC-seq의 적용 가능성을 확대하는 보존 된 필수 전사 전사 보조 활성제 인 모듈 형 Mediator 복합체에 성공적으로 적용했습니다. 기반 방법. ChEC-seq는 ChIP-seq 결과를 독립적으로 검증하고 염색질 상주 프로세스의 규제에 대한 새로운 통찰력을 창출하는 강력한 방법입니다. 여기, 출연 효모에서이 방법을 구현하기위한 단계별 프로토콜을 제시합니다.
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Protocol
1. 효모 균주의 생성
- MNase로 태그가 붙은 관심있는 인자를 가진 효모 균주를 생성하십시오.
- PCR은 특정 반응 혼합물 ( 표 2 )과 사이클링 조건 ( 표 3 )을 사용하여 원하는 벡터 ( 표 1 )에서 MNase 태깅 카세트를 증폭. 5 μL의 PCR 반응과 1 μL의 6X DNA loading dye를 섞는다. 40 분 동안 120 V에서 0.8 % 아가로 오스 겔에서 각 PCR 분액을 실행합니다. 예상되는 제품 크기는 ~ 2.3kb입니다.
- 증폭 된 태깅 카세트를 표준 리튬 아세테이트 변형 22 를 사용하여 원하는 스트레인으로 변형시키고 선택을 수행하십시오.
- 식민지 PCR과 태그 카세트의 올바른 통합을 확인합니다.
- 스크리닝 할 콜로니 수에 대해 지정된 반응 혼합물 ( 표 4 )을 준비합니다. 필요할 때까지 얼음을 계속하십시오.
- 각 식민지의 일부를 선택하여 테멸균 된 이쑤시게 또는 pipet 팁을 사용하여 PCR 튜브의 바닥에 ted.
- 1 분 동안 고출력으로 집게를 집어 넣습니다.
- 혼합하기 위해 각 microwaved 식민지와 pipet에 PCR 믹스 ( 표 4 ) 50 μL를 추가합니다. 지정된 순환 조건을 사용하여 PCR을 수행하십시오 ( 표 5 ).
- PCR 반응 50 μL와 각 PCR 튜브에 6X DNA 로딩 염료 10 μL를 직접 섞으십시오. 40 분 동안 120V에서 1 % 아가로 오스 겔에서 각 샘플의 10 μL를 실행합니다. 예상되는 제품 크기는 ~ 700bp입니다.
참고 : 원하는 경우 Western blotting을 통한 MNase 융합 단백질의 적절한 발현을 확인하십시오. 태그 단백질의 분자량에서 ~ 20.6 킬로 달톤의 변화가 예상된다.
- pGZ136 (표 1) 및 1.1.2 단계에서와 같은 변형 및 선택에 목적 유전자의 프로모터의 상 동성 기반 클로닝에 의해 무료 MNase 균주를 생성한다.
- Alternati다시 말하자면 관심있는 유전자의 프로모터와 3xFLAG-MNase-SV40 NLS를 플라스미드 벡터에 모으고, 1.1.2 단계에서와 같이 형질 전환하고 선택하고, 플라스미드의 유지를위한 적절한 선택 조건으로 변형시킨다.
2. ChEC
- ChEC 실험 전날 오후 / 저녁에 MNase-tagged factor를 갖는 균주의 단일 콜로니와 함께 3 mL의 효모 - 펩톤 - 덱스 트로 오스 (YPD) 또는 적절한 선택 배지를 접종한다. 이 배양 물을 밤새 품어주십시오 (180 RPM 흔들림, 30 ° C).
- ChEC 실험 당일 아침 밤새 배양 물을 50 mL의 배지로 희석하여 600 nm에서의 광학 밀도 (OD 600 )가 0.2 - 0.3이되도록하십시오. 0.5 ~ 0.7의 OD 600 에 도달 할 때까지이 배양 물 (180 RPM 흔들어, 30 ° C)을 품어 둔다. 배양 물이 적절한 OD 600에 접근 할 때, 30 ℃로 heat block 또는 water bath를 설정하고 Buffer A 첨가제 ( Ta6).
- 배양액 당 5 mL의 완충액 A 첨가물 ( 표 6 )을 준비하십시오. 절차 중에 버퍼 A를 실온에 유지하십시오.
- 수집 할 시점마다 정지 용액 ( 표 7 ) 90 μL 및 10 % SDS 10 μL를 포함하는 microfuge 튜브를 준비합니다. 분석 된 각각의 새로운 요소에 대해 0 초, 30 초, 1 분, 2.5 분, 5 분 및 10 분에 시료를 채취합니다.
- 배양액을 50 mL 원추형 튜브에 넣고 1,500 xg 및 실온 (RT)에서 1 분간 원심 분리한다.
- 버퍼 A의 1 ML에 철저하게 세포를 resuspend하고 microfuge 튜브에 resuspended 세포를 전송하십시오. 펠렛은 microfuge에서 세포를 1,500 xg 및 RT에서 30 초 동안 resuspended.
- 상청액을 흡인하고 철저히 pipetting하여 버퍼 A 1 ML에 세포를 resuspend. 펠렛은 microfuge에서 세포를 1,500 xg 및 RT에서 30 초 동안 resuspended. 이 단계를 한 번 반복하십시오.
- 철저히 버퍼 A의 570 μL에 세포를 resuspend. 2 % digitonin의 30 μL를 추가(0.1 % 최종 농도) 세포의 permeabilization을 촉진하고, 혼합 반전.
- 30 ° C에서 5 분간 열 블록 또는 수 욕조에서 세포를 투과시킨다.
- 세포의 균일 한 분포를 보장하기 위해 반응을 위 아래로 피펫 팅합니다. 중지 솔루션과 SDS (단계 2.4) 및 혼합 소용돌이가 포함 된 microfuge 튜브에 부정적인 컨트롤로 permeabilized 세포의 100 μL 나누어지는을 제거합니다.
- permeabilized 세포에 1 M CaCl 2 (최종 농도 2 μM) 1.1 μL를 첨가하여 MNase를 활성화시키고 신속하게 여러 번 반전 시키거나 혼합 시키십시오. 즉시 30 ℃에서 혼합 반응을시키고 타이머를 시작하십시오.
- 수집 할 각 시점에서 세포를 균등하게 분배하기 위해 반응을 위아래로 pipetting 한 다음 정지 용액과 SDS가 들어있는 미세 다공성 튜브에 permeabilized 세포를 100 μL 나누어 넣고 가볍게 섞습니다. 분석 된 각각의 새로운 요소에 대해 0 초 (CaCl 2 첨가 없음), 30 초, 1 분, 2.5 분, 5 분, 및 10 분의 시간 포인트.
참고 : 30 ° C에서 DNA를 빠르게 절단하는 요인을 사용한 ChEC 실험은 MNase 절단 동역학을 늦추기 위해 저온에서 수행 할 수 있습니다. - 모든 시간 점이 수집되면 각 시료에 20 μg / mL proteinase K 4 μL를 넣고 가볍게 섞어 혼합하고 55 ° C에서 30 분 동안 배양합니다.
- 각 샘플에 25 : 24 : 1 페놀 : 클로로포름 : 이소 아밀 알코올 200 μL를 넣고 격렬히 섞어서 최대 속도와 RT에서 5 분 동안 원심 분리하십시오.
- 각각의 수성 상 (~ 150 μL)을 새 튜브에 옮깁니다. 글리코겐 30 μg과 100 % 에탄올 500 μL를 넣으십시오. 10 분 동안 또는 용액이 점성을 나타낼 때까지 드라이 아이스에 섞어서 침전 시키도록 격렬하게 가해줍니다.
- 펠렛은 DNA를 10 분 동안 최대 속도와 4 ℃에서 마이크로 퓨즈로 침전시켰다.
- 상층 액을 따라 내고 RT 70 % 에탄올 1 mL로 펠렛을 씻는다.
- 에탄올을 가만히 따르고,종이 타월에 튜브를 부드럽게 두드려서. 간단히 벤치 탑 원심 분리기를 사용하여 시료를 회전시키고 잔류 에탄올을 제거하기 위해 피펫을 사용하여 펠릿을 방해하지 않도록주의하십시오. 5 분 동안 실온에서 건조 된 펠렛.
- 펠릿이 건조하는 동안, 각각 10mg / mL RNase A의 pH 8.0 + 1 μL의 Tris 29 μL로 건조 펠렛을 resuspend하는 마스터 믹스를 만드십시오. RNA를 37 ° C에서 20 분 동안 분해하십시오.
- 각 샘플 5 μL와 6X DNA 로딩 염료 1 μL를 섞고 40 분 120 V에서 1.5 % 아가로 오스 겔에 실행합니다.
3. 사이즈 선택
참고 : 크기 선택의 목표는 시퀀싱 할 샘플에서 게놈 DNA의 다중 킬로베이스 단편을 제거하고 ~ 150 bp (뉴 클레오 솜 DNA의 대략 크기) 이하의 단편을 풍부하게하는 것입니다. 시퀀싱 데이터에서, <400 bp의 단편이 풍부 해져서 뉴 클레오 솜 DNA 크기 (~ 150 bp) 주변의 주목할만한 피크와 서브 뉴 클레오 솜 단편의 피크 또는 넓은 분포가 풍부합니다.
<ol>참고 : ChEC-seq 데이터 분석은 복잡한 절차이며이 기사의 범위를 벗어납니다. 데이터 분석에 대한 자세한 정보는 이전 발행물 1 , 21 에서 찾을 수 있으며 분석에 사용되는 사용자 정의 스크립트는 GitHub (https://github.com/zentnerlab/chec-seq)에서 사용할 수 있습니다. HOMER 25 (http://homer.salk.edu)는 ChEC-seq 데이터의 명령 행 분석에도 사용할 수 있습니다.
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Representative Results
성공적인 ChEC 실험의 경우, 아가로 오스 겔 전기 영동에 의한 DNA 분석은 게놈 DNA의 번짐 및 최종 완전한 소화에 의해 지시 된 바와 같이, DNA 단편화에 따른 칼슘 의존성 증가를 나타낼 것이다. 어떤 경우에는 전통적인 MNase 소화와 비슷한 밴드 사다리가 확장 소화 후에 관찰됩니다. 이것은 nucleosome-depleted regions (NDRs)에 결합하는 일반적인 조절 인자 인 Reb1의 ChEC 분석의 경우이다 ( 그림 2 ). 우리는 GRFs의 경우, 확장 소화가 신속하게 절단 된 결합 부위에서 신호 손실을 초래한다는 것을 발견했습니다 1 . 이상적으로, Reb1 ChEC의 30 초 및 1 분 시점과 같이 고 분자량의 번짐을 나타내는 게놈 DNA 밴드의 크기가 감소 된 샘플은 신호의 시간 의존적 손실을 피하기 위해 시퀀싱에 사용됩니다 .
그림 3 ). 유사하게, 우리는 중재자 서브 유닛 Med8과 MNase의 융합에 의한 실질적인 DNA 절단을 관찰하지만, 칼슘 첨가 1 분 후에 MED8 프로모터에 의해 유도 된 자유 MNase는 아니다 ( 도 3 ).
Reb1 ChEC-seq 데이터를 ChIP-seq와 비교하기 위해 ORGANIC 13 에 의해 결정된 1,991 Reb1 피크 목록을 얻었다. 이러한 봉우리는 모티프 중간 점 주위의 100bp 창에서 각각의 기본 위치에서의 평균 단편 말단 수를 모티브로 한 것이다. 우리는 분열에서 눈에 띄는 비대칭을 관찰하였으며, 대부분의 단편 말단은 모티프의 상류 측에 매핑되었다 (그림 4 ).
그림 1 : ChEC-seq 방법의 개략도. 염색질 관련 단백질 (CAP) -MNase 융합은 효모 세포에서 발현됩니다. 단백질은 DNA에 결합하지만 핵에서 매우 낮은 유리 칼슘으로 인해 배경 수준 이상의 분열을 일으키지 않습니다. digitonin으로 세포를 permeabilization하고 밀리몰 칼슘을 첨가하면 게놈에 결합 된 CAP-MNase 융합 물이 DNA를 절단하여 작은 조각을 방출합니다. 그런 다음 이들 단편을 정제하고 시퀀싱하여 게놈으로 다시 매핑하여 CAP-MNase 융합을위한 결합 부위 근방의 단편 말단을 제공한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : Reb1 ChEC 실험에서 얻은 DNA의 아가 로즈 겔 전기 영동. 각 ChEC 시점에서 DNA의 5 μL 나누어지는 크기 선택하기 전에 1.5 % TAE - 아가로 오스 겔에서 분석되었다. 이것은 Reb1-MNase 융합에 의한 게놈 DNA의 점진적 소화를 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 : Reb1-MNase 및 MNase ChEC-seq 실험의 게놈 브라우저 스냅 샷 렙틴 1에 대한 단편 말단 신호 및 칼슘 첨가 후 유리 MNase ChEC-seq 30 초 및 Med8 및 유리 MNase ChEC-seq 1 분 후 효모 게놈의 대표적인 세그먼트를 따라 칼슘 첨가. 데이터 세트는 각 기본 위치에 매핑 된 프래그먼트 엔드의 수를 매핑 된 프래그먼트 엔드의 총 수로 나눈 다음 매핑 된 총베이스 수를 곱하여 정규화되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4 : Reb1-MNase- 방출 단편이 Reb1 ORGANIC 사이트 주위에 풍부 해짐. ORGANIC 13 에 의해 결정된 1,991 Reb1 모티프 주위의 30 s Reb1 및 유리 MNase ChEC-seq 단편 말단 신호의 평균 플롯. 데이터는 그림 3 에서와 같이 표준화되었다.lank ">이 그림의 확대 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 플라스미드 | 효모 선택 마커 | 노트 | 부가가치 플라스미드 수 |
| pGZ108 | kanMX6 | 3xFLAG-MNase 태깅, 33aa 링커 | 70231 |
| pGZ109 | HIS3MX6 | 3xFLAG-MNase 태깅, 33aa 링커 | 70232 |
| pGZ110 | TRP1 | 3xFLAG-MNase 태깅, 33aa 링커 | 70233 |
| pGZ136 | URA3 | REB1 프로모터의 제어하에 3xFLAG-MNase-SV40 NLS를 발현 | 72273 |
| pGZ173 | kanMX6 | MNase 태깅, 8a 링커 | 70234 |
표 1 : ChEC Plasmids의 세부 사항. 모든 태깅 벡터는 pFA6a 벡터를 기반으로하므로 일반적으로 사용되는 F2 / R1 태깅 프라이머 쌍과 호환됩니다. 태깅 카세트는 지시 된 길이의 링커, 웨스턴 블 랏팅 (3xFLAG 태그를 제거하기 위해 링커가 단축 된 pGZ173의 경우를 제외하고), MNase의 성숙 체인 (GenBank P00644 , aa 83 - 231) 및 표시된 선택 마커.
| 시약 | 음량 | [결정적인] |
| 5x PCR 완충액 | 10 mL | 1x (2mM MgCl2) |
| 10 mM dNTP 믹스 (각 dNTP 2.5 mM) | 1 mL | 200 mM (각 dNTP 50 mM) |
| 10 mM F2 프라이머 | 2.5 mL | 0.5 mM |
| 10 mM R1p머저리 | 2.5 mL | 0.5 mM |
| pGZ108 / 109 / 110 / 172 (1-5 ng / mL) | 1 mL | |
| 2 U / μL 핫 스타트 고 충실도 폴리 메라 이제 | 0.5 mL | 1 U |
| ddH 2 O | 32.5 mL |
표 2 : 3xFLAG-MNase 태깅 카세트의 PCR 증폭 반응 혼합물. F2 / R1 프라이머 서열은 http://yeastgfp.yeastgenome.org/yeastGFPOligoSequence.txt에서 찾을 수 있습니다.
| 온도 (° C) | 시각 | 주기 |
| 98 | 30 초 | 1 |
| 98 | 10 초 | 25 세 |
| 55 | 30 초 | 25 세 |
| 72 1 분 15 초 | 25 세 | |
| 72 | 2 분 | 1 |
| 10 | 영원히 | 보류 |
표 3 : 3xFLAG-MNase 태깅 카세트의 PCR 증폭을위한 열 순환 조건. 부화 온도와 연장 시간은 사용 된 DNA 중합 효소에 따라 조정될 필요가 있습니다.
| 시약 | 음량 | [결정적인] |
| 10x Taq 완충액 | 5 mL | 1x (1.5 mM MgCl2) |
| 10 mM dNTP 믹스 (각 dNTP 2.5 mM) | 1 mL | 200 mM (각 dNTP 50 mM) |
| 10 mM 확인 프라이머 | 1 mL | 0.2 mM |
| 10 mM MNase-R 또는 음성 대조군 프라이머 | 1 mL | 0.2 mM |
| 5 U / mL Taq 폴리머 라제 | 0.5 mL | 2.5 U |
| ddH 2 O | 41.5 mL |
표 4 : 식민지 PCR에 대한 반응 혼합물 MNase 태깅 확인. Check primer sequence는 http://yeastgfp.yeastgenome.org/yeastGFPOligoSequence.txt에 있습니다. 체크 프라이머는 MNase 내의 역전사 (5'-TTGTGCAGCTTCTTGGTAC-3 ') 및 음성 대조군으로서의 각각의 유전자의 하류 프라이머 약 500 염기쌍 (bp)과 함께 순방향 프라이머로 사용된다.
| 온도 (° C) | 시각 | 주기 |
| 95 | 5 분 | 1 |
| 95 | 30 초 | 35 세 |
| 55 | 30 초 | 35 세 |
| 68 | 1 분 | 35 세 |
| 68 | 5 분 | 1 |
| 10 | 영원히 | 보류 |
표 5 : 식민지 PCR에 대한 열 순환 조건 MNase 태깅 확인. 부화 온도와 연장 시간은 사용 된 DNA 중합 효소에 따라 조정될 필요가 있습니다.
| 시약 | 음량 | [결정적인] |
| 1M 트리스, pH 7.5 | 1.5 mL | 15 mM |
| 1M KCl | 8 mL | 80 mM |
| 0.2 M EGTA | 50 mL | 0.1 mM |
| ddH 2 O | 100으로 채우기mL |
표 6 : 버퍼 A.에 대한 레시피 사용하기 전에 프로 테아 제 억제제 정제의 절반, 100 mM PMSF (1 mM 최종) 50 μL, 200 mM 스 페르 민 (0.2 mM 최종) 5 μL 및 1 M 용액 5 mL 당 스 페르미 딘 (최종 농도 0.5 mM).
| 시약 | 음량 | [결정적인] |
| 5 M NaCl | 8 mL | 400 mM |
| 0.5 M EDTA | 4 mL | 20 mM |
| 0.2 M EGTA | 2 mL | 4 mM |
| ddH 2 O | 100 mL로 채우십시오. |
표 7 : 2x Stop Solution을위한 Recipe. sto의 90 μL 결합p 용액을 10μL의 10 % SDS와 함께 microfuge tube에 넣었다 (2.4 단계 참조).
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Discussion
우리는 ChEC가 다양한 종류의 효모 단백질을 염색질에 매핑 할 수 있으며, 효모의 다른 계열의 TF 및 기타 염색질 결합 인자에 널리 적용될 것으로 예상합니다. ChEC-seq은 가교 결합, 크로 마틴 가용화 또는 항체가 필요 없다는 점에서 유리하다. 따라서 ChEC는 불완전한 단백질 가용화로 인한 거짓 네거티브와 같은 hyper-ChIPable 아티팩트 3 , 4 및 기본 칩과 같은 X-ChIP-seq에 잠재적으로 존재하는 아티팩트를 피합니다 14 . ChEC-seq의 주요 단점은 모든 효소 융합 방법과 마찬가지로 융합 단백질에 대한 요구 사항입니다. 이것은 출아 효모에서 빨리 성취 될 수 있지만, 후생 동물에서는 더욱 힘들어집니다. ChEC-seq의 또 다른 한계는 히스톤 변형의 프로파일 링을 위해 그대로 구현 될 수 없다는 것이다. 그러나, 변형 - 결합 도메인은 MNase에 융합되어 표현 될 수있어, hChEC-seq를 사용한 등선 수정 매핑. 이 정점에서 epitope-tagged histone modification-binding domains를 사용하는 ChIP-seq은 histone modification 26 의 게놈 전체 패턴을 매핑하는데 사용되어왔다.
무료 MNase 컨트롤의 사용은 ChEC - seq 결과의 특이성을 확립하는 데 중요합니다. 무료 MNase 균주는 관심 유전자에 대한 내인성 프로모터의 제어하에 3xFLAG 및 유사 바이러스 40 핵 위치 확인 신호 (SV40 NLS)로 표지 된 MNase를 갖는다. DamID 연구 27 에서 사용 된 융합되지 않은 댐 (Damage) 대조군과 개념적으로 유사하며 염색질 접근성으로 인한 비특이적 분열을 통제합니다. TF ChEC-seq에 대한 MNase의 무료 컨트롤로서, 우리는 ura3 유전자좌 1 에서 REB1 프로모터에 의해 구동되는 3xFLAG-MNase-SV40 NLS를 통합시켰다 . 중재자 ChEC-seq에 대해, 우리는 비 - 통합 플라스미에서 MED8 프로모터의 제어하에 3xFLAG-MNase-SV40 NLS를 발현시켰다d 벡터는 선택 배지 21 에서 유지된다. 두 경우 모두, 유리 MNase에 의한 절단은 거의 관찰되지 않았다. 따라서, 3xFLAG-MNase-SV40 NLS가 비교적 견고한 프로모터에 의해 구동되는 단일 대조 균주가 대부분의 실험에 적합해야한다.
ChEC 실험을 계획 할 때 관심 단백질의 구조적 고려가 중요 할 수 있습니다. 예를 들어, Reb1의 C- 말단에 MNase를 부가하면 Reb1 모티프 주위에 비대칭적인 절단 패턴이 존재하는 반면, N- 말단 MNase를 갖는 Reb1의 발현은 대칭적인 절단 패턴 1을 제공 한다는 것을 발견했다. 우리는 이러한 다른 분열 패턴이 Reb1의 구조에 속한다고 생각한다. Reb1의 DNA 결합 도메인은 그의 C- 말단에 위치한다; 따라서, C- 말단은 DNA에 구조화되어 있으며, MNase의 운동 범위를 제한하고 오직 C- 말단 절단만을 허용한다. 대조적으로, Abf1의 C- 말단은 상대적으로 구조가 없으므로,MNase의 도달 거리로서 Abf1 결합 부위의 양쪽에서 절단을 허용한다. 다른 효모 GRF1 인 Rap1의 경우, 우리는 C- 말단과 MNase 사이의 링커를 33에서 8 aa로 단축시키는 것이 래트의 C 말단 부위의 제안 된 거리로 인해 절단을 심각하게 감소시키기에 충분하다는 것을 발견했다 DNA 28 . 그러한 구조적 고려는 또한 큰 복합체에 존재하는 단백질의 결합을지도화할 때 중요 할 수있다. 효모 게놈 21 에 대한 Mediator binding에 대한 ChEC-seq 분석을 위해, 우리는 C- 말단이 복합체 내에 묻히기보다는 구조적으로 노출 될 것으로 예측 된 서브 유닛을 선택했다. MNase에 융합 된 3 개의 서브 유닛들 중 하나는 DNA를 견고하게 절단하지 않았기 때문에 입체적 제약 또는 다른 DNA 결합 인자와의 상호 작용이 DNA 절단을 약화 시켰음을 시사한다.
우리는 ChEC-seq가 효모 GRF 인 Abf1, Rap1 및 Reb에 대해 4-12 배의 피크를 검출한다는 것을 발견했다모든 시점을 함께 고려했을 때 다양한 ChIP 접근 방식보다 1 . 이들 부위는 MNase 분열 동역학 (mase cleavage kinetics)에 기초하여 2 가지로 분류 될 수있다. 효모 GRFs에 대한 ChEC - seq 데이터의 분석은 두 개의 일시적으로 구별되는 결합 부위의 종류를 밝혀 냈습니다 1 . 첫 번째는 '빠름'으로, 칼슘 첨가 후 1 분 이내에 최대 절단을 나타내 었으며 일반적으로 알려진 컨센서스 모티브와 견고한 일치를 포함합니다. 두 번째는 '천천히'라고 불리는데 분명한 수준의 절단에 도달하기까지 몇 분이 걸렸으며 모티프 매치가 고갈되었습니다. ChIP 데이터 세트의 바인딩에 대해 두 가지 클래스의 사이트가 평균적으로 풍부 해졌지만, ChIP 연구에서 피크로 불리는 것은 아니 었습니다. 주어진 요인에 대한 사이트의 대부분은 느린 사이트였습니다. 우리는 고속 부위가 고친 화성 전사 인자 결합 부위를 대표하는 반면, 느린 부위는 결합 부위 스캐닝 동안 과도 적으로 샘플링 된 궤적을 나타내는 것으로 추측한다. 그 obMNase 절단의 동력학에 의해 분리 된 2 가지 부류의 결합 부위의 탐색은 많은 ChIP-seq 데이터 세트에서 잘 확립 된 DNA 결합 특이성을 갖는 주어진 인자에 대한 다수의 피크가 일치 모티프를 포함하지 않는다는 것을 설명 할 수있다 29 : 대부분의 ChIP 프로토콜에서 10-15 분 동안 수행되는 포름 알데히드 가교 결합은 인자의 팽창을 유도하는 게놈과의 일시적 또는 기회 주의적 상호 작용을 반복적으로 포착 할 수 있습니다. 실제로, ChIP-exo와 생세포 영상의 비교는 이것이 사례 2 임을 시사합니다. 특히, Mediator ChEC-seq 신호가 30 초에서 20 분까지 비교적 일정하게 유지되는 가운데, Mediator ChEC-seq 신호 21 에서 시간에 따른 이러한 극적인 감소를 관찰하지 못했습니다. 이러한 관찰을 감안할 때, 높은 신뢰도의 바인딩 사이트를 복구하기 위해 짧은 지속 시간의 ChEC-seq을 수행하는 것이 좋습니다.
우리는 ChEC-seq가 비 효모에 적응할 수있을 것으로 기대한다.시스템. 자극받지 않은 포유 동물 세포에서 유리 칼슘의 농도는 효율적인 MNase 활성화를위한 임계 값보다 훨씬 낮은 50-300 nM 30 , 32 입니다. metazoan 시스템에서 ChEC-seq를 확립하기위한 제한 단계는 따라서 효모 세포보다 metazoan에서 훨씬 힘들게 남아있는 융합 단백질의 생성이다. 그러나 metazoan 유전자의 내인성 태깅 (tagging)은 CRISPR 기반 genome engineering 33 의 출현으로 크게 촉진되었으므로 이러한 제약은 쉽게 극복되어야한다. 대안으로, MNase 융합 단백질은 플라스미드로부터 낮은 수준으로 발현 될 수있다. 이 접근법은 Drosophila 34 , 35 및 human 36 세포에서 DamID에 대해 매우 성공적이었으며, 따라서 metazoan 세포에서 ChEC-seq를 촉진 할 수도 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
ChEC-seq 개발과 Mediator 단지 적용에 대한 조언과 지원을 위해 원고와 Steven Hahn 및 Steven Henikoff의 비판적인 독서를 위해 Moustafa Saleh와 Jay Tourigny에게 감사드립니다. SG는 NIH 보조금 R01GM053451 및 R01GM075114에서 지원되며 GEZ는 Indiana University 시작 자금에서 지원됩니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| dNTPs | NEB | N0447 | |
| Q5 high-fidelity DNA polymerase | NEB | M0491L | Other high-fidelity DNA polymerases, such as Phusion, may be used for cassette amplification. |
| TrackIt 1 Kb Plus DNA ladder | ThermoFisher Scientific | 10488085 | |
| Taq DNA polymerase | NEB | M0273L | |
| cOmplete Mini EDTA-free protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | 11836170001 | It is important that an EDTA-free protease inhibitor mix is used, so as not to inhibit MNase cleavage by chelation of Ca2+. |
| PMSF | ACROS Organics | AC215740010 | |
| Digitonin, High Purity | EMD Millipore | 300410-250MG | Make a 2% stock by dissolving 20 mg digitonin in 1 mL DMSO with vigorous vortexing. |
| Proteinase K, 20 mg/mL | Invitrogen | 25530049 | |
| RNase A, 10 mg/mL | ThermoFisher Scientific | EN0531 | |
| Ampure XP beads | Beckman Coulter | A63880 | Ampure-like beads can be generated using a published protocol (ref 24). |
| MagneSphere magnetic rack | Promega | Z5342 |
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