Summary
Мы описываем эндогенное расщепление хроматина в сочетании с высокопроизводительным секвенированием (ChEC-seq), хромопатическим иммунопреципитацией (ChIP) -ортогональным методом для картирования сайтов связывания с белками генома с гибридными белками с микрококковой нуклеазой (MNase).
Abstract
Геномное картирование взаимодействия белок-ДНК имеет решающее значение для понимания регуляции генов, ремоделирования хроматина и других хроматиновых резидентных процессов. Сформирование формальдегида с последующей иммунопреципитацией хроматина и секвенированием с высокой пропускной способностью (X-ChIP-seq) было использовано для получения многих ценных сведений о биологии генома. Однако X-ChIP-seq имеет значительные ограничения, связанные с сшиванием и ультразвуком. Родной ChIP избегает этих недостатков, исключая сшивание, но часто приводит к плохому восстановлению связанных с хроматином белков. Кроме того, все методы на основе ChIP подвержены соображениям качества антител. Для картирования белково-ДНК-взаимодействий также использовались ферментативные методы картирования белково-ДНК-взаимодействий, которые включают слияние белка, представляющего интерес для модифицирующего ДНК фермента. Недавно мы объединили один такой метод - хроническое эндогенное расщепление (ChEC), с высокопроизводительным секвенированием как ChEC-seq. ChEC-seq полагается на слияние хроматина-ассоциированногоКоторый представляет интерес для микрококковой нуклеазы (МНКазы) для получения целенаправленного расщепления ДНК в присутствии кальция в живых клетках. ChEC-seq не основан на иммунопреципитации и поэтому обходит потенциальные проблемы с сшиванием, ультразвуком, солюбилизацией хроматина и качеством антител, обеспечивая при этом отображение высокого разрешения с минимальным фоновым сигналом. Мы предполагаем, что ChEC-seq станет мощным партнером ChIP, предоставляя независимые средства, позволяющие как проверять результаты ChIP-seq, так и открывать новые представления о геномном регулировании.
Introduction
Сопоставление сайтов связывания факторов транскрипции (ТФ), ремоделиров хроматина и других связанных с хроматином регуляторных факторов является ключом к пониманию всех процессов на основе хроматина. В то время как подходы хромотанового иммунопреципитации и высокопроизводительного секвенирования (ChIP-seq) были использованы для получения многих важных сведений о биологии генома, они имеют значительные ограничения. Недавно мы представили альтернативный метод, называемый эндогенным расщеплением хроматина и секвенированием с высокой пропускной способностью (ChEC-seq) 1 , чтобы обойти эти недостатки.
ChIP-seq чаще всего проводят с начальной стадией поперечной сшивки формальдегида (X-ChIP-seq) для сохранения взаимодействия белок-ДНК. Однако в ряде недавних исследований было показано, что X-ChIP-seq захватывает переходные или неспецифические белково-ДНК-взаимодействия 2 , 3 , 4 , 5 <Sup>, 6 , 7 , 8 , что приводит к появлению ложноположительных сайтов связывания. Кроме того, обработка ультразвуком, обычно используемая для фрагментации хроматина в экспериментах X-ChIP-seq, предпочтительно сдвигает области открытого хроматина, что приводит к необъективному извлечению фрагментов из этих областей 9 , 10 . Ультразвук также дает гетерогенную смесь длин фрагментов, в конечном счете ограничивая разрешение сайта-сайта, хотя добавление стадии экстрагирования экзонуклеазой может значительно улучшить разрешение 11 , 12 . Нативные методы ChIP, такие как оккупированные области геномов из очищенного от аффинности естественно выделенного хроматина (ORGANIC) 13 , не используют сшивание и фрагмент хроматина с микрококковой нуклеазой (MNase), уменьшая потенциальные смещения, связанные с сшиванием формальдегида и ультразвуком. Однако,Растворимость многих белков, связанных хроматинами, в относительно мягких условиях, необходимых для естественной экстракции хроматина, является плохим, что потенциально приводит к уменьшению динамического диапазона и / или ложных негативов 14 .
В то время как различные итерации ChIP-seq наиболее часто используются для картирования белок-ДНК в геноме, были также реализованы несколько методов картирования, основанных на слиянии белков, представляющих интерес для различных модифицирующих ДНК ферментов. Одним из таких подходов является идентификация ДНК-аденин-метилтрансферазы ДНК (DamID) 15 , где интересующий хроматин белок, представляющий интерес, генетически слит с плотиной, и этот синтез экспрессируется в клетках или животных, что приводит к метилированию последовательностей GATC, близких к сайтам связывания белка. DamID выгодно тем, что он не полагается на иммунопреципитацию и поэтому избегает сшивания, антител или солюбилизации хроматина. Он также выполняется in vivo . Однако, Разрешение DamID ограничено шкалой килобаз, и метилирующая активность слитого белка плотины является конститутивной. Второй способ, основанный на ферментативном слиянии, - это Calling Card-seq 16 , в котором используется слияние интересующего фактора с транспозазой, направляя специфическую для сайта интеграцию транспозонов. Подобно DamID, Calling Card-seq не основан на иммунопреципитации и, следовательно, имеет схожие преимущества, с дополнительным преимуществом повышенного разрешения. Однако Call-Card-seq может быть ограничена последовательными смещениями транспозаз и также зависит от наличия сайтов рестрикции, близких к сайтам вставки транспозонов.
Третий метод ферментативного слияния, разработанный в лаборатории Laemmli, представляет собой эндогенное расщепление хроматина (ChEC) 17 . В ChEC слияние между хроматин-ассоциированным белком и MNase экспрессируется в клетках, а после добавления кальция для активации MNase ДНК расщепляется проксимально к сайтам связывания для меченыхФактора ( рис. 1 ). В сочетании с Саузерн-блоттингом ChEC использовался для характеристики структуры хроматина и связывания белка в ряде отдельных локусов в дрожжах 17 , 18 и был объединен с микроматричным анализом с низким разрешением для зондирования взаимодействия компонентов ядерных пор с дрожжами Геном 19 . ChEC предлагает преимущества, подобные DamID и Calling Card-seq, и его разрешение почти однопалубной пары при анализе с помощью расширения 19 праймера. ChEC также контролируема: надежное расщепление ДНК с помощью MNase зависит от добавления миллимолярного кальция, гарантируя, что MNase неактивен при низких концентрациях свободного кальция, наблюдаемых в живых дрожжевых клетках 20 .
Ранее мы предположили, что объединение ChEC с высокопроизводительным секвенированием (ChEC-seq) обеспечит карты с высоким разрешением сайтов привязки TF. Действительно, ChEC-seq генерирует карты высокого разрешения почкообразующих общих регуляторных факторов (GRF) Abf1, Rap1 и Reb1 в геноме 1 . Мы также успешно применили ChEC-seq к модульному медиаторному комплексу, сохраняющемуся, существенному глобальному транскрипционному коактиватору 21 , расширяющему применимость ChEC-seq к комплексам размером в мегадальтон, которые напрямую не связаны с ДНК и могут быть трудно отображены ChIP- Основанные методы. ChEC-seq является мощным методом как для независимой проверки результатов ChIP-seq, так и для генерации новых представлений о регулировании хроматин-резидентных процессов. Здесь мы представляем пошаговый протокол для реализации этого метода в почкодоносных дрожжах.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Генерация дрожжевых штаммов
- Генерируйте дрожжевой штамм, несущий фактор интереса, помеченный MNase.
- ПЦР амплифицируют кассету для маркировки MNase из желаемого вектора ( таблица 1 ), используя указанную реакционную смесь ( таблица 2 ) и условия циклирования ( таблица 3 ). Смешайте 5 мкл реакции ПЦР и 1 мкл 6X-загружающего ДНК ДНК. Проводите каждую аликвоту ПЦР на 0,8% агарозном геле при 120 В в течение 40 мин. Ожидаемый размер продукта ~ 2,3 кб.
- Преобразуйте усиленную кассету с мечением в выбранный штамм, используя стандартное преобразование 22 ацетата лития и выполняйте селекцию.
- Проверьте правильность интеграции кассеты с мечением с колониальной ПЦР.
- Подготовьте указанную реакционную смесь ( таблица 4 ) для количества колоний, подлежащих скринингу. Держите на льду, пока это не понадобится.
- Выберите часть каждой колонии, которая будетВ нижней части ПЦР-трубки, используя стерильную зубочистку или наконечник пипетки.
- Микроволны выбрали колонии при высокой мощности в течение 1 мин.
- Добавьте 50 мкл ПЦР-смеси ( таблица 4 ) в каждую микроволновую колонию и пипетку вверх и вниз для смешивания. Выполните ПЦР с использованием указанных условий циклирования ( Таблица 5 ).
- Смешайте 50 мкл реакции ПЦР и 10 мкл 6X ДНК-загружающего красителя непосредственно в каждой ПЦР-трубке. Прогон 10 мкл каждого образца на 1% агарозном геле при 120 В в течение 40 мин. Ожидаемый размер продукта ~ 700 б.п.
ПРИМЕЧАНИЕ. При желании проверьте правильную экспрессию слитого белка MNase через вестерн-блоттинг. Ожидается сдвиг молекулярной массы меченого белка на 20,6 килодальтона.
- Генерируют свободный штамм MNase путем гомологического клонирования промотора интересующего гена в pGZ136 (таблица 1) и трансформации и отбора, как на этапе 1.1.2.
- AlternatiСобирают промотор интересующего гена и 3 × FLAG-MNase-SV40 NLS в вектор плазмиды, трансформируют и выбирают так же, как на этапе 1.1.2, и вырабатывают штамм в соответствующем селективном состоянии для поддержания плазмиды.
2. ЧЕК
- Во второй половине дня / вечером за день перед экспериментом ChEC инокулируйте 3 мл дрожжево-пептон-декстрозы (YPD) или подходящую селективную среду с одной колонией штамма, несущей фактор, меченный MNase. Инкубируйте эту культуру в течение ночи (180 об / мин встряхивания, 30 ° C).
- Утром дня эксперимента ChEC разбавьте ночную культуру до 50 мл среды до оптической плотности при 600 нм (OD 600 ) 0,2-0,3. Инкубируйте эту культуру (180 об / мин встряхивания, 30 ° C), пока она не достигнет OD 600 0,5-0,7. По мере приближения культуры к соответствующему OD 600 , установите тепловой блок или водяную баню до 30 ° C и начните оттаивать добавки буфера A ( Ta6).
- Подготовьте 5 мл добавок Buffer A plus ( таблица 6 ) на культуру. Храните буфер A при RT во время процедуры.
- Подготовьте микроцентрифужные пробирки, содержащие 90 мкл стоп-раствора ( таблица 7 ) и 10 мкл 10% SDS для каждого момента времени, который должен быть собран. Для каждого нового анализируемого фактора берут образцы через 0 с, 30 с, 1 мин, 2,5 мин, 5 мин и 10 мин.
- Декантируют культуру в 50 мл коническую трубку и центрифугируют при 1500 мкг и комнатной температуре (RT) в течение 1 мин.
- Тщательно ресуспендируйте клетки в 1 мл буфера А и перенесите ресуспендированные клетки в микроцентрифужную пробирку. Гранулы ресуспендировали клетки в микроцентрифуге при 1500 мкг и RT в течение 30 с.
- Супернатант аспирации и тщательно ресуспендировать клетки в 1 мл буфера А путем пипетирования вверх и вниз. Гранулы ресуспендировали клетки в микроцентрифуге при 1500 мкг и RT в течение 30 с. Повторите этот шаг один раз.
- Тщательно ресуспендировать клетки в 570 мкл буфера А. Добавить 30 мкл 2% дигитонина(Конечная концентрация 0,1%) для облегчения проницаемости клеток и инвертирования для смешивания.
- Пермеабилизируйте клетки в тепловом блоке или водяной бане при 30 ° С в течение 5 мин.
- Пипетируйте реакцию вверх и вниз, чтобы обеспечить равномерное распределение клеток. Удалите 100 мкл аликвоты пермеабилизированных клеток в качестве отрицательного контроля в микроцентрифужную пробирку, содержащую стоп-раствор и SDS (шаг 2.4), и вихрь коротко для смешивания.
- Добавьте 1,1 мкл 1 М CaCl 2 (2 мМ конечной концентрации) в пермеабилизированные клетки для активации MNase и инвертируйте несколько раз быстро или вихрь коротко для смешивания. Немедленно возвратите смешанную реакцию при 30 ° C и запустите таймер.
- В каждый момент времени, который нужно собрать, пипетируйте реакцию вверх и вниз, чтобы обеспечить равномерное распределение клеток, затем удалите 100 мкл аликвоты пермеабилизированных клеток в микроцентрифужную пробирку, содержащую стоп-раствор, и SDS и вихрь, чтобы перемешать. Для каждого нового анализируемого фактора возьмите 0 с (без добавления CaCl 2 ), 30 с, 1 мин, 2,5 мин, 5 мин и 10 мин.
ПРИМЕЧАНИЕ. ЧИК-эксперименты с факторами, которые быстро расщепляют ДНК при 30 ° С, могут быть выполнены при более низких температурах, чтобы замедлить кинетику расщепления MNase. - После того как все точки времени были собраны, добавьте 4 мкл 20 мг / мл протеиназы К в каждый образец, вихрь кратковременно перемешивают и инкубируют при 55 ° С в течение 30 мин.
- Добавьте к каждому образцу 200 мкл 25: 24: 1 фенола: хлороформ: изоамиловый спирт, энергично перемешивают, центрифугируют с максимальной скоростью и RT в микроцентрифуге в течение 5 мин.
- Удалите каждую водную фазу (~ 150 мкл) в новую пробирку. Добавьте 30 мкг гликогена и 500 мкл 100% этанола. Вихрь энергично перемешивают и осаждают на сухом льду в течение 10 мин или до тех пор, пока раствор не станет вязким.
- Гранулы осаждали ДНК с максимальной скоростью и 4 ° С в микроцентрифуге в течение 10 мин.
- Декантирующие супернатанты и промывные гранулы с 1 мл 70% этанола RT.
- Декантированный этанол, удаляющий остаток путем инвертированияD аккуратно постукивая трубками на бумажном полотенце. Кратко открутите образцы с помощью настольной центрифуги и используйте пипетку для удаления остаточного этанола, следя за тем, чтобы не повредить таблетку. Воздушно-сухие гранулы для РТ в течение 5 мин.
- В то время как гранулы сушат, сделайте основную смесь для ресуспендирования высушенных гранул в 29 мкл Трис, pH 8,0 + 1 мкл 10 мг / мл РНКазы А каждый. Дайджест РНК при 37 ° С в течение 20 мин.
- Смешайте 1 мкл 6X загружающего ДНК красителя с 5 мкл каждого образца и бегите на 1,5% агарозном геле при 120 В в течение 40 мин.
3. Выбор размера
ПРИМЕЧАНИЕ. Цель выбора размера заключается в удалении фрагментов из нескольких килобаз геномной ДНК из образца, подлежащего секвенированию, и обогащения фрагментов ~ 150 б.п. (примерно размер нуклеосомной ДНК) или меньше. В данных секвенирования фрагменты <400 б.п. обогащены, с заметным пиком вокруг размера нуклеосомной ДНК (~ 150 п.о.) и пиковым или широким распределением субнуклеосомных фрагментов.
<ол>ПРИМЕЧАНИЕ. Анализ данных ChEC-seq является сложной процедурой и выходит за рамки данной статьи. Подробную информацию о анализе данных можно найти в предыдущих публикациях 1 , 21 , а пользовательские сценарии, используемые для анализа, доступны в GitHub (https://github.com/zentnerlab/chec-seq). HOMER 25 (http://homer.salk.edu) также может использоваться для анализа данных ChEC-seq в командной строке.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
В случае успешного эксперимента ChEC анализ ДНК с помощью электрофореза в агарозном геле выявит зависимое от кальция увеличение фрагментации ДНК в течение времени, о чем свидетельствует размывание и возможное полное переваривание геномной ДНК. В некоторых случаях после длительного переваривания наблюдается лестница полос, сходная с таковой, наблюдаемая при традиционном расщеплении MNase. Это относится к анализу ChEC для Reb1, общего регуляторного фактора, который связывает нуклеосомно-обедненные области (NDR) ( рисунок 2 ). Мы обнаружили, что в случае GRF расширенное пищеварение приводит к потере сигнала на быстро расщепленных сайтах связывания 1 . В идеальном случае образец с уменьшением размера полосы геномной ДНК, который отображает высокомолекулярное размытие, например 30 секунд и 1 мин. Времени для Reb1 ChEC, будет использоваться для секвенирования, чтобы избежать зависящей от времени потери сигнала ,
рисунок 3 ). Аналогично, мы наблюдаем существенное расщепление ДНК путем слияния субъединицы Med8 с Med8 с MNase, но не свободной MNase, приводимой промотором MED8 , через 1 мин после добавления кальция ( рис. 3 ).
Чтобы сравнить данные ReB1 ChEC-seq с ChIP-seq, мы получили список из 1 991 пиков Reb1, определенных ORGANIC 13 . Эти пики были центрированы по мотивом со средним количеством конца конца фрагмента в каждом базовом положении в окне 100 п.о. вокруг середины мотивов. Мы наблюдали поразительную асимметрию в расщеплении, причем большинство концов концов фрагментов находилось в верхней части мотив (Рисунок 4 ).
Рисунок 1 : Схема метода ChEC-seq. Слияние хроматин-ассоциированного белка (CAP) -MNase экспрессируется в дрожжевых клетках. Белок связывается с ДНК, но не генерирует расщепление выше фоновых уровней из-за очень низкого свободного кальция в ядре. При пермеабилизации клеток с дигитонином и добавлении мимилорного кальция, слияния CAP-MNase, связанные с ДНК-расщеплением генома, высвобождение небольших фрагментов. Эти фрагменты затем очищают, секвенируют и наносят на карту обратно в геном, давая пики концов фрагментов ближе к сайтам связывания для слияния CAP-MNase. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2 : Электрофорез в агарозном геле ДНК из эксперимента ChEC Reb1. Аликвоту по 5 мкл ДНК из каждой точки времени ЧИК анализировали на 1,5% TAE-агарозном геле до выбора размера. Это показывает прогрессивное переваривание геномной ДНК слиянием Reb1-MNase. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3 : Снимки браузера генома в Reb1-MNase и Free MNase ChEC-seq Experiments. IGV-представления конечного сигнала фрагмента для Reb1 и свободного MNase ChEC-seq 30 с после добавления кальция и Med8 и свободного MNase ChEC-seq 1 мин af Тер-кальция вместе с представительным сегментом дрожжевого генома. Наборы данных были нормализованы путем деления числа концов фрагментов, сопоставленных с каждой базовой позицией, на общее количество концов фрагментов, отображаемых и умножающихся на общее количество отображаемых баз. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4 : Обогащение фрагментов, выпущенных в Reb1-MNase, заканчивается вокруг сайтов ORBANIC Reb1. Средний график 30 с Reb1 и свободный фрагмент конца фрагмента ChEC-seq MNase около 1,991 мотивов Reb1, определенных ORGANIC 13 . Данные были нормализованы, как на рисунке 3 .Lank "> Нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этого рисунка.
| плазмида | Селективный маркер дрожжей | Заметки | Число плазмиды Addgene |
| pGZ108 | kanMX6 | 3xFLAG-MNase тегирование, 33 aa linker | 70231 |
| pGZ109 | HIS3MX6 | 3xFLAG-MNase тегирование, 33 aa linker | 70232 |
| pGZ110 | TRP1 | 3xFLAG-MNase тегирование, 33 aa linker | 70233 |
| pGZ136 | URA3 | Выражает 3xFLAG-MNase-SV40 NLS под контролем промотора REB1 | 72273 |
| pGZ173 | kanMX6 | MNase tagging, 8 aa linker | 70234 |
Таблица 1: Подробная информация о ЧЭС-плазмидах. Все векторы мечения основаны на векторах pFA6a и поэтому совместимы с обычно используемыми парами праймеров F2 / R1. Кассета для мечения состоит из линкера указанной длины, эпитопа 3xFLAG для облегчения обнаружения с помощью вестерн-блоттинга (за исключением случая pGZ173, где линкер был укорочен для удаления метки 3xFLAG), зрелая цепь MNase (GenBank P00644 , Aa 83-231) и указанный селектируемый маркер.
| реактив | объем | [Final] |
| 5-кратный ПЦР-буфер | 10 мл | 1x (2 мМ MgCl 2 ) |
| 10 мМ dNTP-смеси (2,5 мМ каждый dNTP) | 1 мл | 200 мМ (50 мМ каждый dNTP) |
| 10 мМ F2-праймер | 2,5 мл | 0,5 мМ |
| 10 мМ R1 pРимер | 2,5 мл | 0,5 мМ |
| PGZ108 / 109/110/172 (1-5 нг / мл) | 1 мл | |
| 2 U / μL высоконадежная полимераза горячего старта | 0,5 мл | 1 U |
| DdH 2 O | 32,5 мл |
Таблица 2: Реакционная смесь для ПЦР-амплификации кассет с маркировкой 3xFLAG-MNase. Последовательности праймеров F2 / R1 можно найти по адресу http://yeastgfp.yeastgenome.org/yeastGFPOligoSequence.txt.
| Температура (° C) | Время | циклы |
| 98 | 30 с | 1 |
| 98 | 10 с | 25 |
| 55 | 30 с | 25 |
| 72 1 мин 15 с | 25 | |
| 72 | 2 мин. | 1 |
| 10 | навсегда | Держать |
Таблица 3: Условия термического циклирования для ПЦР-амплификации кассет с маркировкой 3xFLAG-MNase. Температура инкубации и время расширения могут быть скорректированы на основе используемой ДНК-полимеразы.
| реактив | объем | [Final] |
| Буфер 10x Taq | 5 мл | 1x (1,5 мМ MgCl 2 ) |
| 10 мМ dNTP-смеси (2,5 мМ каждый dNTP) | 1 мл | 200 мМ (50 мМ каждый dNTP) |
| 10 мМ Проверить праймер | 1 мл | 0,2 мМ |
| 10 мМ MNase-R или отрицательный контрольный праймер | 1 мл | 0,2 мМ |
| 5 U / mL Taq полимераза | 0,5 мл | 2,5 U |
| DdH 2 O | 41,5 мл |
Таблица 4: Реакционная смесь для определения ПЦР колонии для маркировки MNase. Проверить последовательности праймеров можно на странице http://yeastgfp.yeastgenome.org/yeastGFPOligoSequence.txt. Контрольный праймер используется в качестве прямого праймера вместе с обратным праймером в MNase (5'-TTGTGCAGCTTCTTGGTAC-3 ') и парами правого праймера ~500 (bp) ниже соответствующего гена в качестве отрицательного контроля.
| Температура (° C) | Время | циклы |
| 95 | 5 мин | 1 |
| 95 | 30 с | 35 |
| 55 | 30 с | 35 |
| 68 | 1 мин | 35 |
| 68 | 5 мин | 1 |
| 10 | навсегда | Держать |
Таблица 5: Условия термического циклирования для подтверждения ПЦР колонии при маркировке MNase. Температура инкубации и время расширения могут быть скорректированы на основе используемой ДНК-полимеразы.
| реактив | объем | [Final] |
| 1 М Трис, pH 7,5 | 1,5 мл | 15 мМ |
| 1 M KCl | 8 мл | 80 мМ |
| 0,2 М ЭГТА | 50 мл | 0,1 мМ |
| DdH 2 O | Заполните 100мл |
Таблица 6: Рецепт для буфера A. Перед использованием добавьте половину таблетки для ингибитора протеазы, 50 мкл 100 мМ PMSF (1 мМ финала), 5 мкл 200 мМ спермина (0,2 мМ финала) и 2,5 мкл 1 М Спермидин (0,5 мМ конечный) на 5 мл раствора.
| реактив | объем | [Final] |
| 5 М NaCl | 8 мл | 400 мМ |
| 0,5 М ЭДТА | 4 мл | 20 мМ |
| 0,2 М ЭГТА | 2 мл | 4 ммоль |
| DdH 2 O | Заполните 100 мл |
Таблица 7: Рецепт для стоп-решения 2x. Объединить 90 мкл стоP с 10 мкл 10% SDS в микроцентрифужной пробирке для каждой точки времени (см. Шаг 2.4).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Мы показали, что ChEC может отображать различные типы дрожжевых белков на хроматине и предвидеть, что он будет широко применяться к различным семействам TF и другим хроматин-связывающим факторам у дрожжей. ChEC-seq выгоден тем, что он не требует сшивки, солюбилизации хроматина или антител. Таким образом, ChEC избегает артефактов, потенциально присутствующих в X-ChIP-seq, таких как гипер-ChIPable артефакт 3 , 4 и собственный ChIP, таких как ложные негативы из-за неполной солюбилизации белка 14 . Основным недостатком ChEC-seq, как и всех методов ферментативного слияния, является потребность в слитом белке. Это может быть достигнуто быстро в почкодоносных дрожжах, но более трудоемко в метазоанах. Другим ограничением ChEC-seq является то, что он не может быть реализован как-будто для профилирования модификаций гистонов. Однако домен, связывающий модификацию, может быть слит с MNase и выражен, что позволяет hIstone изменение отображения с ChEC-seq. В этом ключе ChIP-seq с использованием эпитоп-меченых доменов, связывающих модификацию гистонов, был использован для сопоставления моделей генома с гистоном 26 .
Использование свободного управления MNase важно для определения специфичности результатов ChEC-seq. Свободный штамм MNase несет MNase с меткой 3xFLAG и сигналом ядерной локализации вируса 40 вируса (SV40 NLS) под контролем эндогенного промотора для представляющего интерес гена. Он концептуально похож на неиспользованный контроль плотин, используемый в исследованиях DamID 27, и контроль за неспецифическим расщеплением из-за доступности хроматина. В качестве бесплатного управления MNase для TF ChEC-seq мы интегрировали 3xFLAG-MNase-SV40 NLS, управляемый промотором REB1 в локусе ura3 1 . Для Mediator ChEC-seq мы выразили 3xFLAG-MNase-SV40 NLS под контролем промотора MED8 в неинтегрирующей плазмидеD вектор, сохраненный в селективной среде 21 . В обоих случаях наблюдалось очень небольшое расщепление свободной МНКазой. Таким образом, для большинства экспериментов должен быть выбран один контрольный штамм, в котором 3xFLAG-MNase-SV40 NLS управляется относительно устойчивым промотором.
При планировании эксперимента ChEC важное значение имеет структурное рассмотрение интересующего белка. Например, мы обнаружили, что добавление MNase к C-концу Reb1 дало асимметричный шаблон расщепления вокруг мотивов Reb1, тогда как экспрессия Reb1 с N-концевой MNase дала симметричный шаблон расщепления 1 . Мы сопоставляем эти разные шаблоны расщепления структуре Reb1. ДНК-связывающий домен Reb1 расположен на его С-конце; Таким образом, С-конец структурирован и близок к ДНК, ограничивая диапазон движения МНКазы и только разрешая С-концевое расщепление. Напротив, C-конец Abf1 относительно неструктурирован и, таким образом, можетДосягаемости MNase, позволяя расщепление по обеим сторонам сайтов связывания Abf1. В случае Rap1, еще одного дрожжевого GRF, мы обнаружили, что укорачивание линкера между С-концом и МНСазой с 33 до 8 аа было достаточным для серьезного уменьшения расщепления, возможно, из-за предлагаемого расстояния С-концевой части Rap1 от ДНК 28 . Такое структурное рассмотрение также, вероятно, будет иметь важное значение при попытке сопоставить связывание белков, присутствующих в больших комплексах. Для нашего анализа ChEC-seq связывания медиатора с геномом 21 дрожжей мы выбрали субъединицы, C-концы которых были структурно предсказаны, чтобы их подвергали воздействию, а не были захоронены внутри комплекса. Из трех субъединиц, слитых с MNase, один не прочно расщеплял ДНК, предполагая, что либо стерические ограничения, либо взаимодействия с другими связывающими ДНК факторами ослабляют расщепление ДНК.
Мы обнаружили, что ChEC-seq обнаруживает в 4-12 раз больше пиков для дрожжевых GRF Abf1, Rap1 и Reb1, чем различные подходы к ЦИП, когда все точки времени считались вместе 1 . Эти сайты можно разделить на два класса, основанные на кинетике расщепления MNase. Анализ данных ChEC-seq для дрожжевых GRF показал два временных класса классов связывания 1 . Первое, называемое «быстрым», показало максимальное расщепление <1 мин после добавления кальция и обычно содержало надежные совпадения с известными консенсус-мотивами. Второй, называемый «медленным», занял несколько минут, чтобы достичь заметного уровня расщепления и был исчерпан мотивами матчей. Оба класса сайтов были в среднем обогащены для привязки к наборам данных ChIP, хотя они не обязательно назывались пиками в этих исследованиях ChIP. Большинство сайтов для данного фактора были медленными сайтами. Мы предполагаем, что быстрые сайты являются репрезентативными для сайтов связывания фактора высокой аффинности транскрипции, тогда как медленные сайты представляют собой локусы, временно дискретизированные во время сканирования сайта связывания. ОбОбслуживание двух классов сайтов связывания, разделенных кинетикой расщепления MNase, может объяснить наблюдение во многих наборах данных ChIP-seq, что большое количество пиков для данного фактора с хорошо определенной специфичностью связывания ДНК не содержат консенсусного мотива 29 : Формальдегидная сшивка, выполняемая в течение 10-15 минут в большинстве протоколов ChIP, может многократно захватывать переходные или оппортунистические взаимодействия фактора с геномом, что приводит к инфляции сигнала. Действительно, сравнение изображений ChIP-exo и живых клеток показывает, что это так. Примечательно, что мы не наблюдали такого резкого зависящего от времени снижения сигналов Mediator ChEC-seq 21 , при этом сигнал посредника ChEC-seq относительно постоянный от 30 с до 20 мин. Учитывая эти наблюдения, мы рекомендуем использовать кратковременный ChEC-seq для восстановления сайтов с высокой степенью достоверности связывания.
Мы ожидаем, что ChEC-seq можно адаптировать к не дрожжамсистемы. Концентрация свободного кальция в нестимулированных клетках млекопитающих составляет 50-300 нМ 30 , 32 , что намного ниже порога эффективной активации MNase. Ограничивающим этапом для создания ChEC-seq в системах метазоанов является, таким образом, генерация слитых белков, которая остается намного более трудоемкой в метазоане, чем дрожжевые клетки. Тем не менее, эндогенная мечение метазоановых генов значительно облегчилось с появлением основанной на CRISPR геномной инженерии 33 , и поэтому это ограничение должно быть легко преодолено. Альтернативно, слитые белки MNase могут быть экспрессированы на низких уровнях от плазмид. Этот подход был довольно успешным для DamID в клетках Drosophila 34 , 35 и человека 36 и, таким образом, также мог бы облегчить ChEC-seq в клетках метазоана.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Мы благодарим Мустафу Салеха и Джей Туиньи за критическое чтение рукописи и Стивена Хана и Стивена Хеникова за наставничество и поддержку во время разработки ChEC-seq и его применения к медиаторскому комплексу. SG поддерживается грантами NIH R01GM053451 и R01GM075114, а GEZ поддерживается фондами запуска Университета штата Индиана.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| dNTPs | NEB | N0447 | |
| Q5 high-fidelity DNA polymerase | NEB | M0491L | Other high-fidelity DNA polymerases, such as Phusion, may be used for cassette amplification. |
| TrackIt 1 Kb Plus DNA ladder | ThermoFisher Scientific | 10488085 | |
| Taq DNA polymerase | NEB | M0273L | |
| cOmplete Mini EDTA-free protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | 11836170001 | It is important that an EDTA-free protease inhibitor mix is used, so as not to inhibit MNase cleavage by chelation of Ca2+. |
| PMSF | ACROS Organics | AC215740010 | |
| Digitonin, High Purity | EMD Millipore | 300410-250MG | Make a 2% stock by dissolving 20 mg digitonin in 1 mL DMSO with vigorous vortexing. |
| Proteinase K, 20 mg/mL | Invitrogen | 25530049 | |
| RNase A, 10 mg/mL | ThermoFisher Scientific | EN0531 | |
| Ampure XP beads | Beckman Coulter | A63880 | Ampure-like beads can be generated using a published protocol (ref 24). |
| MagneSphere magnetic rack | Promega | Z5342 |
References
- Zentner, G. E., Kasinathan, S., Xin, B., Rohs, R., Henikoff, S. ChEC-seq kinetics discriminates transcription factor binding sites by DNA sequence and shape in vivo. Nat Commun. 6, 8733 (2015).
- Chen, J., et al. Single-Molecule Dynamics of Enhanceosome Assembly in Embryonic Stem Cells. Cell. 156 (6), 1274-1285 (2014).
- Teytelman, L., Thurtle, D. M., Rine, J., van Oudenaarden, A. Highly expressed loci are vulnerable to misleading ChIP localization of multiple unrelated proteins. Proc Natl Acad Sci USA. 110 (46), 18602-18607 (2013).
- Park, D., Lee, Y., Bhupindersingh, G., Iyer, V. R. Widespread Misinterpretable ChIP-seq Bias in Yeast. PLoS ONE. 8 (12), 83506 (2013).
- Jain, D., Baldi, S., Zabel, A., Straub, T., Becker, P. B. Active promoters give rise to false positive 'Phantom Peaks' in ChIP-seq experiments. Nucleic Acids Res. , (2015).
- Krebs, W., et al. Optimization of transcription factor binding map accuracy utilizing knockout-mouse models. Nucleic Acids Res. 42 (21), 13051-13060 (2014).
- Paul, E., Zhu, Z. I., Landsman, D., Morse, R. H. Genome-Wide Association of Mediator and RNA Polymerase II in Wild-Type and Mediator Mutant Yeast. Mol Cell Biol. 35 (1), 331-342 (2015).
- Worsley Hunt, R., Wasserman, W. W. Non-targeted transcription factors motifs are a systemic component of ChIP-seq datasets. Genome Biol. 15 (7), 412 (2014).
- Vega, V. B., Cheung, E., Palanisamy, N., Sung, W. -K. Inherent Signals in Sequencing-Based Chromatin-ImmunoPrecipitation Control Libraries. PLoS ONE. 4 (4), 5241 (2009).
- Teytelman, L., et al. Impact of Chromatin Structures on DNA Processing for Genomic Analyses. PLoS ONE. 4 (8), 6700 (2009).
- Rhee, H. S., Pugh, B. F. Comprehensive Genome-wide Protein-DNA Interactions Detected at Single-Nucleotide Resolution. Cell. 147 (6), 1408-1419 (2011).
- He, Q., Johnston, J., Zeitlinger, J. ChIP-nexus enables improved detection of in vivo transcription factor binding footprints. Nat Biotech. 33 (4), 395-401 (2015).
- Kasinathan, S., Orsi, G. A., Zentner, G. E., Ahmad, K., Henikoff, S. High-resolution mapping of transcription factor binding sites on native chromatin. Nat Methods. 11 (2), 203-209 (2014).
- Skene, P. J., Hernandez, A. E., Groudine, M., Henikoff, S. The nucleosomal barrier to promoter escape by RNA polymerase II is overcome by the chromatin remodeler Chd1. eLife. 3, 02042 (2014).
- Aughey, G. N., Southall, T. D. Dam it's good! DamID profiling of protein-DNA interactions. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 5 (1), 25-37 (2016).
- Wang, H., Mayhew, D., Chen, X., Johnston, M., Mitra, R. D. Calling Cards enable multiplexed identification of the genomic targets of DNA-binding proteins. Genome Res. 21 (5), 748-755 (2011).
- Schmid, M., Durussel, T., Laemmli, U. K. ChIC and ChEC: Genomic Mapping of Chromatin Proteins. Mol Cell. 16 (1), 147-157 (2004).
- Merz, K., et al. Actively transcribed rRNA genes in S. cerevisiae are organized in a specialized chromatin associated with the high-mobility group protein Hmo1 and are largely devoid of histone molecules. Genes Dev. 22 (9), 1190-1204 (2008).
- Schmid, M., et al. Nup-PI: The Nucleopore-Promoter Interaction of Genes in Yeast. Mol Cell. 21 (3), 379-391 (2006).
- Dunn, T., Gable, K., Beeler, T. Regulation of cellular Ca2+ by yeast vacuoles. J Biol Chem. 269 (10), 7273-7278 (1994).
- Grünberg, S., Henikoff, S., Hahn, S., Zentner, G. E. Mediator binding to UASs is broadly uncoupled from transcription and cooperative with TFIID recruitment to promoters. The EMBO Journal. 35 (22), 2435-2446 (2016).
- Gietz, R. D., Schiestl, R. H. High-efficiency yeast transformation using the LiAc/SS carrier DNA/PEG method. Nat. Protocols. 2 (1), 31-34 (2007).
- Rohland, N., Reich, D. Cost-effective, high-throughput DNA sequencing libraries for multiplexed target capture. Genome Res. 22 (5), 939-946 (2012).
- Orsi, G. A., Kasinathan, S., Zentner, G. E., Henikoff, S., Ahmad, K. Mapping regulatory factors by immunoprecipitation from native chromatin. Current protocols in molecular biology. Ausubel, F. M., et al. 110, 21-25 (2015).
- Heinz, S., et al. Simple Combinations of Lineage-Determining Transcription Factors Prime cis-Regulatory Elements Required for Macrophage and B Cell Identities. Mol Cell. 38 (4), 576-589 (2010).
- Kungulovski, G., et al. Application of histone modification-specific interaction domains as an alternative to antibodies. Genome Res. 24 (11), 1842-1853 (2014).
- Vogel, M. J., Peric-Hupkes, D., van Steensel, B. Detection of in vivo protein-DNA interactions using DamID in mammalian cells. Nat. Protocols. 2 (6), 1467-1478 (2007).
- Feeser, E. A., Wolberger, C. Structural and Functional Studies of the Rap1 C-Terminus Reveal Novel Separation-of-Function Mutants. J Mol Biol. 380 (3), 520-531 (2008).
- Neph, S., et al. An expansive human regulatory lexicon encoded in transcription factor footprints. Nature. 489 (7414), 83-90 (2012).
- Mountjoy, K. G., Kong, P. L., Taylor, J. A., Willard, D. H., Wilkison, W. O. Melanocortin receptor-mediated mobilization of intracellular free calcium in HEK293 cells. Physiol Genomics. 5 (1), 11-19 (2001).
- Seurin, D., Lombet, A., Babajko, S., Godeau, F., Ricort, J. -M. Insulin-Like Growth Factor Binding Proteins Increase Intracellular Calcium Levels in Two Different Cell Lines. PLoS ONE. 8 (3), e59323 (2013).
- Grienberger, C., Konnerth, A. Imaging Calcium in Neurons. Neuron. 73 (5), 862-885 (2012).
- Sander, J. D., Joung, J. K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nat Biotech. 32 (4), 347-355 (2014).
- Filion, G. J., et al. Systematic Protein Location Mapping Reveals Five Principal Chromatin Types in Drosophila Cells. Cell. 143 (2), 212-224 (2010).
- van Bemmel, J. G., et al. A Network Model of the Molecular Organization of Chromatin in Drosophila. Mol Cell. 49 (4), 759-771 (2013).
- Izzo, A., et al. The Genomic Landscape of the Somatic Linker Histone Subtypes H1.1 to H1.5 in Human Cells. Cell Rep. 3 (6), 2142-2154 (2013).
