Summary
نحن تصف الكروماتين الانقسام الذاتية إلى جانب تسلسل عالية الإنتاجية (تشيك-سيق)، المناعية لونين (رقاقة) طريقة متعامدة لرسم الخرائط مواقع ملزمة البروتين الجينوم على نطاق واسع مع نوكليس نوكوكلياز (منيس) البروتينات الانصهار.
Abstract
رسم الخرائط على نطاق الجينوم من التفاعلات البروتين الحمض النووي أمر بالغ الأهمية لفهم التنظيم الجيني، وإعادة عرض لونين، وغيرها من العمليات المقيمين الكروماتين. الفورمالديهايد يشابك تليها لونين مناعي وارتفاع الإنتاجية الإنتاجية (X-تشيب-سيق) وقد استخدمت لكسب العديد من الأفكار القيمة في علم الأحياء الجينوم. ومع ذلك، X-تشيب-سيق لديه قيود مرتبطة مرتبطة كروسلينكينغ وسونيكاتيون. رقاقة الأصلي تجنب هذه العيوب عن طريق حذف تشابك، ولكن غالبا ما يؤدي إلى الانتعاش الفقراء من البروتينات المرتبطة الكروماتين. وبالإضافة إلى ذلك، فإن جميع الطرق القائمة على رقاقة تخضع لاعتبارات الجودة الأجسام المضادة. وقد استخدمت أيضا أساليب الأنزيمية لرسم خرائط التفاعلات الحمض النووي للبروتين، والتي تنطوي على الانصهار من البروتين من الاهتمام لانزيم تعديل الحمض النووي، لتعيين التفاعلات البروتين الحمض النووي. نحن في الآونة الأخيرة مجتمعة واحدة من هذه الطريقة، لونين الانقسام الذاتية (تشيك)، مع تسلسل الإنتاجية العالية كما تشيك-سيق. تشيك-سيق يعتمد على الانصهار من الكروماتين- أسوكالبروتين إاتد من الفائدة إلى نوكلياز ميكروكوكال (منيس) لتوليد استهداف الحمض النووي الانقسام في وجود الكالسيوم في الخلايا الحية. تشيك-سيق لا يقوم على إمونوبريسيانتاتيون وبالتالي التحايل على المخاوف المحتملة مع يشابك، صوتنة، لونين سولوبيليزاتيون، وجودة الأجسام المضادة مع توفير عالية الدقة رسم الخرائط مع الحد الأدنى من إشارة الخلفية. ونحن نتصور أن تشيك-سيق سوف تكون نظير قوي ل تشيب، وتوفير وسيلة مستقلة من أجل التحقق من صحة النتائج تشيب-سيق، واكتشاف رؤى جديدة في التنظيم الجيني.
Introduction
رسم الخرائط مواقع ملزمة من عوامل النسخ (تفس)، إعادة تشكيل الكروماتين، والعوامل التنظيمية الأخرى المرتبطة بالكروماتين هو المفتاح لفهم جميع العمليات القائمة على الكروماتين. في حين استخدمت المناعية لونين وارتفاع تسلسل الإنتاجية (تشيب-سيق) نهج لكسب العديد من الأفكار الهامة في علم الأحياء الجينوم، لديهم قيود ملحوظة. لقد أدخلنا مؤخرا طريقة بديلة، يطلق عليها الانقسام الداخلي لونين والإنتاجية العالية تسلسل (تشيك-سيق) 1 ، للتحايل على هذه السلبيات.
وغالبا ما يتم تنفيذ تشيب-سيق مع خطوة الفورمالديهايد الأولي يشابك (X- رقاقة-سيق) للحفاظ على التفاعلات البروتين الحمض النووي. ومع ذلك، فقد أشار عدد من الدراسات الحديثة أن X-تشيب-سيق يلتقط التفاعلات البروتين الحمض النووي عابرة أو غير محددة 2 ، 3 ، 4 ، 5 <سوب>، 6 ، 7 ، 8 ، مما يؤدي إلى مواقع ملزمة إيجابية كاذبة. وبالإضافة إلى ذلك، سونيكاتيون، وتستخدم عادة لتفريق لونين في التجارب X- تشيب-سيق، مناطق المقصات تفضيلي من لونين مفتوح، مما يؤدي إلى الانتعاش منحازة شظايا من هذه المناطق 9 ، 10 . سونيكاتيون ينتج أيضا خليط غير متجانسة من أطوال الشظايا، مما يحد في نهاية المطاف قرار الموقع ملزمة، على الرغم من أن إضافة خطوة الهضم نوكلياز يمكن أن تحسن كثيرا القرار 11 ، 12 . طرق رقاقة المحلية مثل المناطق المحتلة من الجينوم من تقارب تنقيته لونين معزولة طبيعيا (أورغانيك) 13 لا تستخدم كروسلينكينغ وشظية لونين مع نوكلياز ميكروكوكال (منيس)، والتخفيف من التحيزات المحتملة المرتبطة التشابك الفورمالديهايد وسونيكاتيون. ومع ذلك،فإن ذوبانية العديد من البروتينات المرتبطة بالكروماتين في ظل ظروف خفيفة نسبيا المطلوبة لاستخراج الكروماتين الأصلي ضعيف، مما قد يؤدي إلى انخفاض النطاق الديناميكي و / أو السلبيات الكاذبة 14 .
في حين أن التكرارات المختلفة من تشيب سيق، هي الأكثر شيوعا لرسم الخرائط على نطاق الجينوم من التفاعلات الحمض النووي للبروتين، كما تم تنفيذ عدة تقنيات رسم الخرائط على أساس انصهار البروتينات التي تهم مختلف الأنزيمات تعديل الحمض النووي. واحد من هذه النهج هو دنا أدينين ميثيل ترانسفيراس تحديد (داميد) 15 ، حيث يتم دمج البروتين ملزم من الكروماتين من الفائدة إلى وراثيا ويتم التعبير عن هذا الانصهار في الخلايا أو الحيوانات، مما أدى إلى مثيلة من تسلسل غاتس القريبة لمواقع ملزمة للبروتين. داميد مفيد في أنه لا يعتمد على مناعي وهكذا يتجنب التشابك، الأجسام المضادة، أو لونين الانحلال. كما يتم تنفيذها في الجسم الحي . ومع ذلك، يقتصر قرار داميد على مقياس الكيلوباس ونشاط الميثيلات من بروتين الدم الانصهار هو كونستيتوتيف. وهناك طريقة ثانية تقوم على الانزيم الانزيمية هي استدعاء بطاقة- 16 ، الذي يوظف الانصهار من عامل من الفائدة إلى ترانسبوزاز، توجيه التكامل موقع معين من ترانسبوسونس. مثل داميد، استدعاء بطاقة المتابعة لا يستند إلى إمونوبريسيانتاتيون وبالتالي لديها مزايا مماثلة، مع فائدة إضافية من زيادة القرار. ومع ذلك، قد تقيد بطاقة الاتصال المتابعة بالتسلسل التحيز من ينتقل ويعتمد أيضا على وجود مواقع تقييد قريبة من مواقع الإدراج ترانزوسون.
وهناك طريقة الانزيمية الثالثة الانصهار، وضعت في مختبر لامللي، هو لونين الانقسام الذاتية (تشيك) 17 . في تشيك، يتم التعبير عن الانصهار بين البروتين المرتبط بالكروماتين و منيس في الخلايا، وعلى إضافة الكالسيوم لتنشيط منيس، يتم تشريح الحمض النووي الأقرب إلى مواقع ملزمة للموسومةعامل ( الشكل 1 ). جنبا إلى جنب مع النشاف الجنوبية، وقد استخدمت تشيك لتوصيف هيكل الكروماتين والبروتين ملزمة في عدد من لوكسي الفردية في الخميرة 17 ، 18 ، وتم دمجها مع تحليل ميكروأري منخفضة الدقة للتحقيق في التفاعل من مكونات المسام النووية مع الخميرة الجينوم 19 . تشيك يقدم فوائد مماثلة ل داميد و بطاقة دعوة المتابعة، وقرارها هو تقريبا زوج واحد قاعدة عند تحليل التمديد التمهيدي 19 . تشيك هو أيضا يمكن السيطرة عليها: الانقسام الحمض النووي قوي مناس يعتمد على إضافة مليمولار الكالسيوم، وضمان أن منيس غير نشط في تركيزات منخفضة الكالسيوم الحرة لوحظ في خلايا الخميرة الحية 20 .
في السابق، افترضنا أن الجمع بين تشيك مع تسلسل الإنتاجية العالية (تشيك-سيق) من شأنه أن يوفر خرائط عالية الدقة من مواقع الربط تف. في الواقع، تشيك-sq ولدت خرائط عالية الدقة من الخميرة الناشئة العوامل التنظيمية العامة (غرفس) Abf1، Rap1، و Reb1 عبر الجينوم 1 . وقد نجحنا أيضا في تطبيق تشيك-سيق على مجمع الوسطاء المعياري، وهو عامل حفظي عالمي أساسي محفظ 21 ، وتوسيع نطاق تطبيق تشيك-سيق إلى مجمعات الحجم ميغادالتون التي لا تتصل مباشرة دنا وقد يكون من الصعب رسم بواسطة رقاقة- . تشيك-سيق هو وسيلة قوية على حد سواء للتحقق من صحة مستقلة النتائج تشيب-سيق وتوليد رؤى جديدة في تنظيم العمليات المقيمين الكروماتين. هنا، نقدم بروتوكول خطوة بخطوة لتنفيذ هذه الطريقة في مهدها الخميرة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. جيل من سلالات الخميرة
- توليد سلالة الخميرة التي تحمل عامل الفائدة الموسومة مع منيس.
- ير تضخيم كاسيت منيس علامات من ناقلات المطلوب ( الجدول 1 ) باستخدام خليط التفاعل المحدد ( الجدول 2 ) وظروف الدراجات ( الجدول 3 ). مزيج 5 ميكرولتر من تفاعل ير و 1 ميكرولتر من 6X دنا تحميل الصبغة. تشغيل كل قسامة ير على هلام الاغاروز 0.8٪ في 120 V لمدة 40 دقيقة. حجم المنتج المتوقع هو ~ 2.3 كيلوبايت.
- تحويل كاسيت العلامات تضخيم في سلالة من الاختيار باستخدام معيار تحويل خلات الليثيوم 22 وأداء التحديد.
- تحقق من التكامل الصحيح من شريط العلامات مع مستعمرة ير.
- إعداد خليط التفاعل المحدد ( الجدول 4 ) لعدد من المستعمرات ليتم فحصها. الحفاظ على الجليد حتى الحاجة.
- اختيار جزء من كل مستعمرة ليكون تيستيد في الجزء السفلي من أنبوب ير باستخدام مسواك معقمة أو طرف الماصة.
- الميكروويف المستعمرات التقطت في قوة عالية لمدة 1 دقيقة.
- إضافة 50 ميكرولتر من مزيج ير ( الجدول 4 ) إلى كل مستعمرة ميكروافيد والماصة صعودا وهبوطا لخلط. أداء ير باستخدام ظروف الدراجات المحددة ( الجدول 5 ).
- مزيج 50 ميكرولتر من تفاعل ير و 10 ميكرولتر من 6X دنا تحميل الصبغة مباشرة في كل أنبوب ير. تشغيل 10 ميكرولتر من كل عينة على هلام الاغاروز 1٪ في 120 V لمدة 40 دقيقة. حجم المنتج المتوقع هو ~ 700 نقطة أساس.
ملاحظة: إذا رغبت في ذلك، تحقق من التعبير المناسب للبروتين الانصهار منيس عبر النشاف الغربية. A ~ 20.6 كيلودالتون التحول في الوزن الجزيئي للبروتين الموسومة ومن المتوقع.
- توليد سلالة منيس خالية من الاستنساخ القائم على التماثل من المروج من الجينات من الفائدة في pGZ136 (الجدول 1) والتحول والاختيار كما هو الحال في الخطوة 1.1.2.
- Alternatiفيلي، تجميع المروج من الجينات في المصالح و 3xFLAG-مناس-SV40 نلس في ناقلات البلازميد، وتحويل وحدد كما هو الحال في الخطوة 1.1.2، وتنمو سلالة في حالة انتقائية المناسبة لصيانة البلازميد.
2. تشيك
- في فترة ما بعد الظهر / مساء اليوم السابق لتجربة تشيك، تطعيم 3 مل الخميرة الببتون-سكر العنب (يبد) أو المتوسطة الانتقائية المناسبة مع مستعمرة واحدة من سلالة تحمل عامل منيس الموسومة. احتضان هذه الثقافة بين عشية وضحاها (180 دورة في الدقيقة الهز، 30 درجة مئوية).
- في صباح اليوم من تجربة تشيك، تمييع الثقافة بين عشية وضحاها في 50 مل من المتوسطة إلى الكثافة البصرية في 600 نانومتر (أود 600 ) من 0.2 - 0.3. احتضان هذه الثقافة (180 دورة في الدقيقة الهز، 30 درجة مئوية) حتى تصل إلى أود 600 من 0.5-0.7. كما تقترب الثقافة أود 600 المناسبة ، تعيين كتلة الحرارة أو حمام الماء إلى 30 درجة مئوية والبدء في ذوبان الجليد العازلة المواد المضافة ( تابلي 6).
- إعداد 5 مل من العازلة بالإضافة إلى الإضافات ( الجدول 6 ) لكل ثقافة. إبقاء العازلة A في رت أثناء الإجراء.
- إعداد أنابيب ميكروفوج تحتوي على 90 ميكرولتر من حل وقف ( الجدول 7 ) و 10 ميكرولتر من 10٪ سدز لكل نقطة زمنية ليتم جمعها. لكل عامل جديد تحليلها، واتخاذ عينات في 0 ق، 30 ثانية، 1 دقيقة، 2.5 دقيقة، 5 دقائق، و 10 دقيقة.
- ثقافة الصب في أنبوب مخروطي 50 مل وطرد مركزي في 1500 x ج ودرجة حرارة الغرفة (رت) لمدة 1 دقيقة.
- ريسوسبيند تماما الخلايا في 1 مل من العازلة A ونقل الخلايا معلق إلى أنبوب ميكروفوج. بيليه معلق الخلايا في ميكروفوج في 1500 x ج و رت لمدة 30 ثانية.
- نضح طاف وخلايا ريسوسبيند بدقة في 1 مل من العازلة من قبل بيبتينغ صعودا وهبوطا. بيليه معلق الخلايا في ميكروفوج في 1500 x ج و رت لمدة 30 ثانية. كرر هذه الخطوة مرة واحدة.
- الخلايا ريسوسبيند تماما في 570 ميكرولتر من العازلة A. إضافة 30 ميكرولتر من 2٪ ديجيتونين(0.1٪ تركيز النهائي) لتسهيل بيرمابيليزاتيون من الخلايا، وعكس للخلط.
- بيرمابيليز الخلايا في كتلة الحرارة أو حمام الماء في 30 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
- الماصة رد فعل صعودا وهبوطا لضمان توزيع حتى من الخلايا. إزالة قسامة 100 ميكرولتر من الخلايا بيرمابيليزد كسيطرة سلبية إلى أنبوب ميكروفوج تحتوي على حل وقف و سدز (الخطوة 2.4) ودوامة لفترة وجيزة لخلط.
- إضافة 1.1 ميكرولتر من 1 M كاكل 2 (2 تركيز النهائي ملي) لخلايا بيرمابيليزد لتنشيط منيس وعكس عدة مرات بسرعة أو دوامة لفترة وجيزة لخلط. على الفور العودة رد فعل مختلطة في 30 درجة مئوية وبدء جهاز توقيت.
- في كل نقطة زمنية ليتم جمعها، ماصة رد فعل صعودا وهبوطا لضمان توزيع حتى من الخلايا، ثم إزالة قسامة 100 ميكرولتر من الخلايا بيرمابيليزد إلى أنبوب ميكروفوج تحتوي على حل وقف و سدز ودوامة لفترة وجيزة لخلط. لكل عامل جديد تحليلها، واتخاذ 0 ق (لا كاكل 2 المضافة)، 30 ثانية، 1 دقيقة، 2.5 دقيقة، 5 دقائق، و 10 دقيقة نقاط الوقت.
ملاحظة: تشيك التجارب مع العوامل التي يلتصق بسرعة الحمض النووي في 30 درجة مئوية يمكن أن يؤديها في درجات حرارة منخفضة لإبطاء حركية الانقسام منيس. - مرة واحدة وقد تم جمع كل نقاط الوقت، إضافة 4 ميكرولتر من 20 ملغ / مل بروتينز K لكل عينة، دوامة لفترة وجيزة لخلط، واحتضان عند 55 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
- إضافة 200 ميكرولتر من 25: 24: 1 الفينول: الكلوروفورم: الكحول الإيزواميلي إلى كل عينة، دوامة بقوة لخلط، وأجهزة الطرد المركزي في أقصى سرعة و رت في ميكروفوج لمدة 5 دقائق.
- إزالة كل مرحلة مائي (~ 150 ميكرولتر) إلى أنبوب جديد. إضافة 30 ميكروغرام من الجليكوجين و 500 ميكرولتر من الإيثانول بنسبة 100٪. دوامة بقوة لخلط وترسب على الجليد الجاف لمدة 10 دقيقة أو حتى حل لزج.
- بيليه عجلت الحمض النووي في أقصى سرعة و 4 درجات مئوية في ميكروفوج لمدة 10 دقيقة.
- صب سوبرناتانتس وغسل الكريات مع 1 مل من رت 70٪ من الإيثانول.
- صب الإيثانول، وإزالة المتبقية عن طريق عكسد التنصت بلطف الأنابيب على منشفة ورقية. تدور لفترة وجيزة عينات باستخدام الطرد المركزي بينشتوب واستخدام ماصة لإزالة الإيثانول المتبقية، مع الحرص على عدم إزعاج بيليه. الهواء الجاف الكريات ل رت لمدة 5 دقائق.
- بينما الكريات تجفيف، وجعل مزيج الرئيسي ل ريسوسبيند الكريات المجففة في 29 ميكرولتر من تريس، ودرجة الحموضة 8.0 + 1 ميكرولتر من 10 ملغ / مل ريبونوكلياز كل منهما. هضم الحمض النووي الريبي عند 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
- مزيج 1 ميكرولتر من 6X دنا تحميل الصبغة مع 5 ميكرولتر من كل عينة وتشغيلها على هلام الاغاروز 1.5٪ في 120 V لمدة 40 دقيقة.
3. حجم التحديد
ملاحظة: الهدف من اختيار الحجم هو إزالة شظايا متعددة كيلوباس من الحمض النووي الجيني من العينة لتكون تسلسل وإثراء شظايا من ~ 150 نقطة أساس (تقريبا حجم الحمض النووي نوكليوسومال) أو أصغر. في تسلسل البيانات، شظايا <400 بي بي هي المخصب، مع ذروة ملحوظة حول حجم الحمض النووي النيوكليوسومات (~ 150 نقطة أساس) وتوزيع ذروة أو واسعة من شظايا تحت نوكليوسومال.
<رأ>ملاحظة: تحليل بيانات تشيك-سيق هو إجراء معقد وخارج نطاق هذه المقالة. ويمكن الاطلاع على معلومات مفصلة عن تحليل البيانات في المنشورات السابقة 1 ، 21 ، والنصوص المخصصة المستخدمة للتحليل متاحة على جيثب (https://github.com/zentnerlab/chec-seq). هومر 25 (http://homer.salk.edu) يمكن أن تستخدم أيضا لتحليل سطر الأوامر للبيانات تشيك-سيق.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
في حالة تجربة تشيك ناجحة، وتحليل الحمض النووي من قبل الاغاروز هلام الكهربائي تكشف عن زيادة تعتمد على الكالسيوم في تجزئة الحمض النووي على مدى الوقت، كما هو مبين من قبل تلطيخ والهضم النهائي النهائي من الحمض النووي الجيني. في بعض الحالات، لوحظ سلم من العصابات مماثلة لتلك التي شهدت مع هضم منيس التقليدية بعد هضم موسع. هذا هو الحال بالنسبة لتحليل شيك من Reb1، وهو عامل تنظيمي عام يربط المناطق المستنفدة النيوكليوسوم (ندرس) ( الشكل 2 ). لقد وجدنا، في حالة غرف، تمديد الهضم يؤدي إلى فقدان إشارة في مواقع الربط المشقوق بسرعة 1 . من الناحية المثالية، سيتم استخدام عينة مع انخفاض في حجم الحمض النووي الجيني الفرقة التي تعرض عالية الوزن الجزيئي تلطيخ، مثل 30 ثانية و 1 دقيقة نقاط الوقت ل Reb1 تشيك، لتسلسل لتجنب فقدان الوقت تعتمد على إشارة .
her.within-بادج = "1"> يكشف التمثيل البصري للجزء من تجربة Reb1 تشيك-سيق عن إثراء قوي ل Reb1 على خلفية مشتقة من سلالة Reb1-منيس دون إضافة الكالسيوم وسلالة منيس الحرة بعد مدة متساوية من الحرة الكالسيوم (30 ثانية) ( الشكل 3 ). وبالمثل، فإننا نلاحظ انشقاق الحمض النووي كبير من خلال اندماج من Med8 الوسيط الوسيط مع منيس، ولكن ليس منيس الحرة مدفوعة من قبل المروج MED8 ، 1 دقيقة بعد إضافة الكالسيوم ( الشكل 3 ).
لمقارنة بيانات Reb1 تشيك-سيق إلى تشيب-سيق، حصلنا على قائمة من 1،991 ريب1 قمم تحددها أورغانيك 13 . وكانت هذه القمم محورها عمودي مع متوسط عدد نهاية الشظايا في كل موقف قاعدة في إطار 100 نقطة أساس حول نقطة منتصف الحافز. لاحظنا عدم تماثل لافت للنظر في الانقسام، مع الغالبية العظمى من جزء ينتهي رسم الخرائط إلى الجانب المنبع من عزر ( الشكل 4 ).
الشكل 1 : تخطيطي للطريقة تشيك-سيق. يتم التعبير عن البروتين المرتبط بالكروماتين (كاب) الانصهار -MNase في خلايا الخميرة. البروتين يربط إلى الحمض النووي ولكن لا تولد الانقسام فوق مستويات الخلفية بسبب الكالسيوم الحر منخفض جدا في النواة. على بيرمابيليزاتيون من الخلايا مع ديجيتونين وإضافة ميليمولار الكالسيوم، والانصمام كاب-مناز ملزمة الجينوم يلتصق الحمض النووي، وإطلاق شظايا صغيرة. ثم يتم تنقيته هذه الشظايا، تسلسل، وتعيينها مرة أخرى إلى الجينوم، وإعطاء قمم شظية ينتهي الأقرب إلى مواقع ملزمة للانصهار كاب-منيس. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
together.within الصفحات = "1"> 
الشكل 2 : أغاروس جيل الكهربائي من الحمض النووي من تجربة تشيب Reb1. تم تحليل قسامة 5 ميكرولتر من الحمض النووي من كل نقطة وقت تشيك على هلام تاي-أغاروس 1.5٪ قبل اختيار الحجم. وهذا يدل على الهضم التدريجي من الحمض النووي الجيني من الانصهار Reb1-منيس. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3 : لقطات متصفح الجينوم من Reb1-مناس وخالية منيس تشيك-سيق التجارب. إيغف وجهات النظر من إشارة نهاية جزء ل Reb1 ومجاني منيس تشيك-سيق 30 ثانية بعد إضافة الكالسيوم و Med8 ومجانا منيس تشيك-سيق 1 دقيقة أف تر إضافة الكالسيوم على طول شريحة تمثيلية من جينوم الخميرة. تم تطبيع مجموعات البيانات من خلال تقسيم عدد نهايات الشظايا التي تم تعيينها لكل موضع قاعدة من خلال العدد الإجمالي للجزء من النهايات التي تم تعيينها وضربها من خلال العدد الإجمالي للقواعد التي تم تعيينها. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4 : إثراء جزء Reb1-منيس صدر ينتهي حول Reb1 المواقع العضوية. متوسط مؤامرة من 30 ثانية Reb1 ومجاني منيس تشيك-سيق نهاية جزء القطعة حول 1،991 Reb1 الزخارف التي يحددها أورغانيك 13 . تم تطبيع البيانات كما في الشكل 3 . لانك "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| البلازميد | الخميرة علامة اختيار | ملاحظات | عدد البلازميد أدجين |
| pGZ108 | kanMX6 | 3xFLAG-منيس وضع العلامات، 33 أ رابط | 70231 |
| pGZ109 | HIS3MX6 | 3xFLAG-منيس وضع العلامات، 33 آ رابط | 70232 |
| pGZ110 | TRP1 | 3xFLAG-منيس وضع العلامات، 33 آ رابط | 70233 |
| pGZ136 | URA3 | يعبر عن 3XFLAG-منيس-SV40 نلس تحت سيطرة المروج REB1 | 72273 |
| pGZ173 | kanMX6 | منيس وضع العلامات، 8 آ رابط | 70234 |
إيثين-بادج = "1"> الجدول 1: تفاصيل تشيك بلاسميدس. وتستند جميع ناقلات العلامات على ناقلات pFA6a وهكذا هي متوافقة مع أزواج التمهيدي وضع العلامات F2 / R1 شائعة الاستخدام. يتكون كاسيت الوسم من رابط من طول المشار إليه، حاتمة 3xFLAG لتسهيل الكشف عن طريق النشاف الغربية (إلا في حالة pGZ173، حيث تم اختصار الرابط لإزالة علامة 3xFLAG)، وسلسلة ناضجة من منيس (بنك الجينات P00644 ، آ 83 - 231)، وعلامة التحديد المحددة.
| الكاشف | الصوت | [نهائي] |
| 5X ير العازلة | 10 مل | 1x (2 ملي مغكل 2 ) |
| 10 ملي دنتب مزيج (2.5 ملم كل دنتب) | 1 مل | 200 ملي (50 ملي كل دنتب) |
| 10 مم F2 التمهيدي | 2.5 مل | 0.5 ملي |
| 10 ملي R1 primer | 2.5 مل | 0.5 ملي |
| pGZ108 / 109/110/172 (1-5 نغ / مل) | 1 مل | |
| 2 U / ميكرولتر بداية ساخنة عالية الدقة البلمرة | 0.5 مل | 1 U |
| د 2 O | 32.5 مل |
الجدول 2: خليط التفاعل ل ير التضخيم من 3xFLAG-منيس الوسم كاسيت. يمكن العثور على متواليات التمهيدي F2 / R1 في http://yeastgfp.yeastgenome.org/yeastGFPOligoSequence.txt.
| درجة الحرارة (° C) | زمن | دورات |
| 98 | 30 ثانية | 1 |
| 98 | 10 ثوان | 25 |
| 55 | 30 ثانية | 25 |
| 72 1 دقيقة 15 ثانية | 25 | |
| 72 | 2 دقيقة | 1 |
| 10 | إلى الأبد | معلق |
الجدول 3: ظروف ركوب الدراجات الحرارية ل ير التضخيم من 3xFLAG-منيس توصيف كاسيت. قد تحتاج درجة حرارة الحضانة والوقت التمديد إلى تعديلها على أساس البلمرة دنا المستخدمة.
| الكاشف | الصوت | [نهائي] |
| 10X العازلة الطوق | 5 مل | 1x (1.5 ملي مغكل 2 ) |
| 10 ملي دنتب مزيج (2.5 ملم كل دنتب) | 1 مل | 200 ملي (50 ملي كل دنتب) |
| 10 ملم فحص التمهيدي | 1 مل | 0.2 مليمتر |
| 10 ملم منيس-R أو السيطرة السلبية التمهيدي | 1 مل | 0.2 مليمتر |
| 5 U / مل تاق البلمرة | 0.5 مل | 2.5 U |
| د 2 O | 41،5 مل |
الجدول 4: خليط التفاعل لمستعمرة ير تأكيد منيس الوسم. ويمكن الاطلاع على متواليات التمهيدي في http://yeastgfp.yeastgenome.org/yeastGFPOligoSequence.txt. يتم استخدام التمهيدي الاختيار كما التمهيدي إلى الأمام جنبا إلى جنب مع التمهيدي العكسي داخل منيس (5'-تغتكتكتكتغتاك-3) وأزواج قاعدة التمهيدي ~500 (بب) العكسي من الجين المعني كسيطرة سلبية.
| درجة الحرارة (° C) | زمن | دورات |
| 95 | 5 دقائق | 1 |
| 95 | 30 ثانية | 35 |
| 55 | 30 ثانية | 35 |
| 68 | 1 دقيقة | 35 |
| 68 | 5 دقائق | 1 |
| 10 | إلى الأبد | معلق |
الجدول 5: ظروف ركوب الدراجات الحرارية لمستعمرة ير تأكيد منيس الوسم. قد تحتاج درجة حرارة الحضانة والوقت التمديد إلى تعديلها على أساس البلمرة دنا المستخدمة.
| الكاشف | الصوت | [نهائي] |
| 1 M تريس، ودرجة الحموضة 7.5 | 1.5 مل | 15 ملم |
| 1 M بوكل | 8 مل | 80 ملي |
| 0.2 M إغتا | 50 مل | 0.1 ملم |
| د 2 O | املأ إلى 100مل |
الجدول 6: وصفة العازلة A. قبل الاستخدام، إضافة نصف قرص مثبط الأنزيم البروتيني، 50 ميكرولتر من 100 ملم بمسف (1 ملم النهائي)، 5 ميكرولتر من 200 ملي من سبيرمين (0.2 ملي النهائي)، و 2.5 ميكرولتر من 1 M سبيرميدين (0.5 ملم النهائي) لكل 5 مل من الحل.
| الكاشف | الصوت | [نهائي] |
| 5 M كلوريد الصوديوم | 8 مل | 400 مليمتر |
| 0.5 M إدتا | 4 مل | 20 ملي |
| 0.2 M إغتا | 2 مل | 4 ملي |
| د 2 O | ملء إلى 100 مل |
الجدول 7: وصفة ل 2 X وقف الحل. الجمع بين 90 ميكرولتر من ستوp مع 10 ميكرولتر من 10٪ سدز في أنبوب ميكروفوج لكل نقطة زمنية ليتم اتخاذها (انظر الخطوة 2.4).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
لقد أظهرنا أن تشيك يمكن تعيين فئات متنوعة من البروتينات الخميرة على الكروماتين، وتوقع أنه سيتم تطبيقها على نطاق واسع على عائلات مختلفة من صناديق الاستئناف وغيرها من العوامل ملزم الكروماتين في الخميرة. تشيك-سيق هو مفيد في أنه لا يتطلب كروسلينكينغ، لونين سولوبيليزاتيون، أو الأجسام المضادة. وهكذا، تشيك يتجنب التحف التي يحتمل أن تكون موجودة في X- رقاقة- سيق، مثل قطعة أثرية تشيبابل فرط 3 ، 4 ، و رقاقة الأصلي، مثل السلبيات كاذبة بسبب عدم اكتمال بروتين سولوبليزاتيون 14 . العيب الرئيسي من تشيك-سيق، كما هو الحال مع جميع أساليب الانزيم الانزيمية، هو شرط للبروتين الانصهار. هذا يمكن أن يتحقق بسرعة في مهدها الخميرة، ولكن أكثر شاقة في ميتازوانز. قيود أخرى من تشيك-سيق هو أنه لا يمكن تنفيذها كما هو ل التنميط من التعديلات هيستون. ومع ذلك، يمكن دمجها مجال ملزمة التعديل ل منيس وأعرب، وتمكين حإستون تعديل الخرائط مع تشيك-سيق. في هذا السياق، تم استخدام تشيب-سيق باستخدام حشوات الموسومة هيستون تعديل النطاقات ملزمة لتعيين أنماط الجينوم واسعة من تعديل هيستون 26 .
استخدام عنصر تحكم منيس مجاني مهم في تحديد خصوصية النتائج تشيك-سيق. تحمل سلالة منيس الحرة منيس الموسومة مع 3xFLAG وفيروس سيميان 40 إشارة توطين النووية (SV40 نلس) تحت سيطرة المروج الذاتية للجين من الفائدة. ومن الناحية المفاهيمية مماثلة لسد السيطرة غير المستخدمة المستخدمة في دراسات دميد 27 والضوابط للانقسام غير محددة بسبب الوصول الكروماتين. كما تحكم منيس مجانا ل تف تشيك-سيق، نحن دمج 3xFLAG-منيس-SV40 نلس مدفوعة من قبل المروج REB1 في موضع ura3 1 . بالنسبة للوسيط تشيك-سيق، أعربنا عن 3xFLAG-مناس-SV40 نلس تحت سيطرة المروج MED8 في البلازما غير متكاملة(د) في وسط انتقائي 21 . في كلتا الحالتين، لوحظ القليل جدا من الانقسام بواسطة منيس الحرة. وبالتالي، سلالة التحكم واحدة حيث 3XFLAG-مناس-SV40 نلس مدفوعة من قبل المروج قوية نسبيا يجب أن تكون مناسبة لمعظم التجارب.
عند التخطيط لتجربة تشيك، قد يكون الاعتبار الهيكلي للبروتين من الفائدة مهمة. على سبيل المثال، وجدنا أن إلحاق منيس إلى C- محطة من Reb1 أعطى نمط الانقسام غير المتماثلة حول الزخارف Reb1، في حين أن التعبير عن Reb1 مع N- محطة منيس أعطى نمط الانقسام المتماثل 1 . نحن نعزو هذه الأنماط المختلفة الانقسام إلى بنية Reb1. يقع مجال الربط الحمض النووي من Reb1 في C- محطة. وبالتالي، فإن C- محطة هي منظمة وقريبة من الحمض النووي، مما يحد من نطاق الحركة منيس والسماح فقط C- محطة الانقسام. في المقابل، فإن C- محطة Abf1 غير هيكلي نسبيا، وبالتالي قد تعمل على زيادة لوصول منيس، مما يسمح الانقسام على جانبي المواقع ملزمة ABF1. في حالة Rap1، غرف الخميرة آخر، وجدنا أن تقصير الارتباط بين C- محطة و منيس من 33 إلى 8 آ كان كافيا للحد من الانقسام بشدة، ربما بسبب المسافة المقترحة من جزء C- محطة من Rap1 من دنا 28 . ومن المرجح أيضا أن يكون هذا الاعتبار الهيكلي مهم عند محاولة رسم خريطة ملزمة للبروتينات الموجودة في المجمعات الكبيرة. من أجل تحليل تشيك-سيق للوسيط الملزم للجينوم الخميرة 21 ، اخترنا الوحدات الفرعية التي تنبأ C-تيرميني بشكل هيكلي، بدلا من دفن داخل المجمع. من ثلاث وحدات فرعية تنصهر ل منيس، لم واحد لا يلتصق بقوة الحمض النووي، مما يشير إلى أن إما قيود ستيريك، أو التفاعلات مع عوامل ملزمة الحمض النووي الأخرى يضعف انشقاق الحمض النووي.
وجدنا أن تشيك-سيق بالكشف عن 4-12 مرات قمم أكثر للخميرة غرفس Abf1، Rap1، و ريب1 من مختلف النهج تشيب عندما تم النظر في جميع النقاط الزمنية معا 1 . ويمكن تقسيم هذه المواقع إلى فئتين على أساس حركية الانقسام منيس. كشف تحليل البيانات تشيك-سيق ل غرف الخميرة اثنين من فئات متميزة مؤقتا من مواقع الربط 1 . الأولى، وصفت "سريع"، عرض الانقسام القصوى <1 دقيقة بعد إضافة الكالسيوم وعموما تحتوي على تطابقات قوية لعناصر الإجماع المعروفة. والثانية، التي يطلق عليها اسم "بطيئة"، استغرقت عدة دقائق للوصول إلى مستويات ملحوظة من الانقسام واستنزفت من المباريات عزر. وقد تم إثراء كلا الفئتين من المواقع في المتوسط لربطها في مجموعات بيانات تشيب، على الرغم من أنها لم تسم بالضرورة بالقمم في تلك الدراسات تشيب. وكانت غالبية المواقع لعامل معين مواقع بطيئة. ونحن نتوقع أن المواقع السريعة هي ممثلة لمواقع ارتباط النسخ عالية الارتباط تقارب، في حين تمثل المواقع بطيئة الموقع عابر عابرة خلال المسح الموقع الملزم. ذي أوبيمكن أن تفسر خدمة فئتين من مواقع الربط التي تفصلها حركية الانقسام منيس الملاحظة في العديد من مجموعات البيانات تشيب-سيق أن عددا كبيرا من قمم لعامل معين مع دنا ملزمة ملزمة محددة لا تحتوي على عزر الإجماع 29 : الفورمالديهايد يشابك، أجريت لمدة 10-15 دقيقة في معظم بروتوكولات رقاقة، ويمكن التقاط مرارا وتكرارا تفاعلات عابرة أو انتهازية من عامل مع الجينوم، مما يؤدي إلى تضخم إشارة. في الواقع، مقارنة تشيب-إكسو والتصوير الخلية الحية تشير إلى أن هذا هو الحال 2 . ومن الجدير بالذكر أننا لم نلاحظ مثل هذا الانخفاض الدرامي الذي يعتمد على الوقت في إشارات الوسيط تشيك-سيق 21 ، مع إشارة الوسيط تشيك-سيق ثابت نسبيا من 30 ثانية إلى 20 دقيقة. وبالنظر إلى هذه الملاحظات، نوصي بإجراء مدة قصيرة تشيك-سيق لاسترداد مواقع الربط عالية الثقة.
نحن نتوقع أن تشيك-سيق يمكن تكييفها إلى غير الخميرةالأنظمة. تركيز الكالسيوم الحر في خلايا الثدييات أونستيمولاتد هو 50-300 نانومتر 30 ، 32 ، أقل بكثير من عتبة تفعيل كفاءة منيس. وبالتالي فإن الخطوة المحددة لإنشاء تشيك-سيق في نظم ميتازوان هو توليد البروتينات الانصهار، الذي لا يزال أكثر صعوبة في ميتازوان من خلايا الخميرة. ومع ذلك، فإن الوسم الذاتي للجينات ميتازوان قد سهلت إلى حد كبير بظهور هندسة الجينوم المستندة إلى كريسبر 33 ، وبالتالي يجب التغلب على هذا القيد بسهولة. بدلا من ذلك، يمكن التعبير عن البروتينات الانصهار منيس في مستويات منخفضة من البلازميدات. وقد كان هذا النهج ناجحا تماما ل داميد في ذبابة الفاكهة 34 و 35 و 36 خلايا الإنسان، وبالتالي قد يسهل أيضا تشيك-سيق في خلايا ميتازوان.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لديهم ما يكشف.
Acknowledgments
نشكر مصطفى صالح وجاي توريغني على قراءة نقدية للمخطوطة وستيفن هان وستيفن هينيكوف للحصول على الإرشاد والدعم خلال تطوير تشيك-سيق وتطبيقه على مجمع الوسيط. ويدعم سغ من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح R01GM053451 و R01GM075114 و جيز هو معتمد من قبل صناديق بدء تشغيل جامعة إنديانا.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| dNTPs | NEB | N0447 | |
| Q5 high-fidelity DNA polymerase | NEB | M0491L | Other high-fidelity DNA polymerases, such as Phusion, may be used for cassette amplification. |
| TrackIt 1 Kb Plus DNA ladder | ThermoFisher Scientific | 10488085 | |
| Taq DNA polymerase | NEB | M0273L | |
| cOmplete Mini EDTA-free protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | 11836170001 | It is important that an EDTA-free protease inhibitor mix is used, so as not to inhibit MNase cleavage by chelation of Ca2+. |
| PMSF | ACROS Organics | AC215740010 | |
| Digitonin, High Purity | EMD Millipore | 300410-250MG | Make a 2% stock by dissolving 20 mg digitonin in 1 mL DMSO with vigorous vortexing. |
| Proteinase K, 20 mg/mL | Invitrogen | 25530049 | |
| RNase A, 10 mg/mL | ThermoFisher Scientific | EN0531 | |
| Ampure XP beads | Beckman Coulter | A63880 | Ampure-like beads can be generated using a published protocol (ref 24). |
| MagneSphere magnetic rack | Promega | Z5342 |
References
- Zentner, G. E., Kasinathan, S., Xin, B., Rohs, R., Henikoff, S. ChEC-seq kinetics discriminates transcription factor binding sites by DNA sequence and shape in vivo. Nat Commun. 6, 8733 (2015).
- Chen, J., et al. Single-Molecule Dynamics of Enhanceosome Assembly in Embryonic Stem Cells. Cell. 156 (6), 1274-1285 (2014).
- Teytelman, L., Thurtle, D. M., Rine, J., van Oudenaarden, A. Highly expressed loci are vulnerable to misleading ChIP localization of multiple unrelated proteins. Proc Natl Acad Sci USA. 110 (46), 18602-18607 (2013).
- Park, D., Lee, Y., Bhupindersingh, G., Iyer, V. R. Widespread Misinterpretable ChIP-seq Bias in Yeast. PLoS ONE. 8 (12), 83506 (2013).
- Jain, D., Baldi, S., Zabel, A., Straub, T., Becker, P. B. Active promoters give rise to false positive 'Phantom Peaks' in ChIP-seq experiments. Nucleic Acids Res. , (2015).
- Krebs, W., et al. Optimization of transcription factor binding map accuracy utilizing knockout-mouse models. Nucleic Acids Res. 42 (21), 13051-13060 (2014).
- Paul, E., Zhu, Z. I., Landsman, D., Morse, R. H. Genome-Wide Association of Mediator and RNA Polymerase II in Wild-Type and Mediator Mutant Yeast. Mol Cell Biol. 35 (1), 331-342 (2015).
- Worsley Hunt, R., Wasserman, W. W. Non-targeted transcription factors motifs are a systemic component of ChIP-seq datasets. Genome Biol. 15 (7), 412 (2014).
- Vega, V. B., Cheung, E., Palanisamy, N., Sung, W. -K. Inherent Signals in Sequencing-Based Chromatin-ImmunoPrecipitation Control Libraries. PLoS ONE. 4 (4), 5241 (2009).
- Teytelman, L., et al. Impact of Chromatin Structures on DNA Processing for Genomic Analyses. PLoS ONE. 4 (8), 6700 (2009).
- Rhee, H. S., Pugh, B. F. Comprehensive Genome-wide Protein-DNA Interactions Detected at Single-Nucleotide Resolution. Cell. 147 (6), 1408-1419 (2011).
- He, Q., Johnston, J., Zeitlinger, J. ChIP-nexus enables improved detection of in vivo transcription factor binding footprints. Nat Biotech. 33 (4), 395-401 (2015).
- Kasinathan, S., Orsi, G. A., Zentner, G. E., Ahmad, K., Henikoff, S. High-resolution mapping of transcription factor binding sites on native chromatin. Nat Methods. 11 (2), 203-209 (2014).
- Skene, P. J., Hernandez, A. E., Groudine, M., Henikoff, S. The nucleosomal barrier to promoter escape by RNA polymerase II is overcome by the chromatin remodeler Chd1. eLife. 3, 02042 (2014).
- Aughey, G. N., Southall, T. D. Dam it's good! DamID profiling of protein-DNA interactions. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 5 (1), 25-37 (2016).
- Wang, H., Mayhew, D., Chen, X., Johnston, M., Mitra, R. D. Calling Cards enable multiplexed identification of the genomic targets of DNA-binding proteins. Genome Res. 21 (5), 748-755 (2011).
- Schmid, M., Durussel, T., Laemmli, U. K. ChIC and ChEC: Genomic Mapping of Chromatin Proteins. Mol Cell. 16 (1), 147-157 (2004).
- Merz, K., et al. Actively transcribed rRNA genes in S. cerevisiae are organized in a specialized chromatin associated with the high-mobility group protein Hmo1 and are largely devoid of histone molecules. Genes Dev. 22 (9), 1190-1204 (2008).
- Schmid, M., et al. Nup-PI: The Nucleopore-Promoter Interaction of Genes in Yeast. Mol Cell. 21 (3), 379-391 (2006).
- Dunn, T., Gable, K., Beeler, T. Regulation of cellular Ca2+ by yeast vacuoles. J Biol Chem. 269 (10), 7273-7278 (1994).
- Grünberg, S., Henikoff, S., Hahn, S., Zentner, G. E. Mediator binding to UASs is broadly uncoupled from transcription and cooperative with TFIID recruitment to promoters. The EMBO Journal. 35 (22), 2435-2446 (2016).
- Gietz, R. D., Schiestl, R. H. High-efficiency yeast transformation using the LiAc/SS carrier DNA/PEG method. Nat. Protocols. 2 (1), 31-34 (2007).
- Rohland, N., Reich, D. Cost-effective, high-throughput DNA sequencing libraries for multiplexed target capture. Genome Res. 22 (5), 939-946 (2012).
- Orsi, G. A., Kasinathan, S., Zentner, G. E., Henikoff, S., Ahmad, K. Mapping regulatory factors by immunoprecipitation from native chromatin. Current protocols in molecular biology. Ausubel, F. M., et al. 110, 21-25 (2015).
- Heinz, S., et al. Simple Combinations of Lineage-Determining Transcription Factors Prime cis-Regulatory Elements Required for Macrophage and B Cell Identities. Mol Cell. 38 (4), 576-589 (2010).
- Kungulovski, G., et al. Application of histone modification-specific interaction domains as an alternative to antibodies. Genome Res. 24 (11), 1842-1853 (2014).
- Vogel, M. J., Peric-Hupkes, D., van Steensel, B. Detection of in vivo protein-DNA interactions using DamID in mammalian cells. Nat. Protocols. 2 (6), 1467-1478 (2007).
- Feeser, E. A., Wolberger, C. Structural and Functional Studies of the Rap1 C-Terminus Reveal Novel Separation-of-Function Mutants. J Mol Biol. 380 (3), 520-531 (2008).
- Neph, S., et al. An expansive human regulatory lexicon encoded in transcription factor footprints. Nature. 489 (7414), 83-90 (2012).
- Mountjoy, K. G., Kong, P. L., Taylor, J. A., Willard, D. H., Wilkison, W. O. Melanocortin receptor-mediated mobilization of intracellular free calcium in HEK293 cells. Physiol Genomics. 5 (1), 11-19 (2001).
- Seurin, D., Lombet, A., Babajko, S., Godeau, F., Ricort, J. -M. Insulin-Like Growth Factor Binding Proteins Increase Intracellular Calcium Levels in Two Different Cell Lines. PLoS ONE. 8 (3), e59323 (2013).
- Grienberger, C., Konnerth, A. Imaging Calcium in Neurons. Neuron. 73 (5), 862-885 (2012).
- Sander, J. D., Joung, J. K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nat Biotech. 32 (4), 347-355 (2014).
- Filion, G. J., et al. Systematic Protein Location Mapping Reveals Five Principal Chromatin Types in Drosophila Cells. Cell. 143 (2), 212-224 (2010).
- van Bemmel, J. G., et al. A Network Model of the Molecular Organization of Chromatin in Drosophila. Mol Cell. 49 (4), 759-771 (2013).
- Izzo, A., et al. The Genomic Landscape of the Somatic Linker Histone Subtypes H1.1 to H1.5 in Human Cells. Cell Rep. 3 (6), 2142-2154 (2013).
