Summary
Vi beskriver kromatin endogen klyvning i kombination med hög genomströmnings-sekvensering (ChEC-seq), en kromatinimmunpresipitations (ChIP) -orthogonal metod för kartläggning av proteinbindningsställen genomgående med mikrokocknukleas (MNase) fusionsproteiner.
Abstract
Genomgående kartläggning av protein-DNA-interaktioner är avgörande för förståelse av genreglering, kromatinreformering och andra kromatin-residenta processer. Formaldehyd-tvärbindning följt av kromatinimmunutfällning och genomströmningssekvensering (X-ChIP-seq) har använts för att få många värdefulla insikter i genombiologi. X-ChIP-seq har dock anmärkningsvärda begränsningar kopplade till tvärbindning och sonikering. Native ChIP undviker dessa nackdelar genom att utelämna tvärbindning, men resulterar ofta i dålig återhämtning av kromatinbundna proteiner. Dessutom är alla ChIP-baserade metoder föremål för antikroppskvalitetshänsyn. Enzymatiska metoder för kartläggning av protein-DNA-interaktioner, som innefattar fusion av ett protein av intresse för ett DNA-modifierande enzym, har också använts för att kartlägga protein-DNA-interaktioner. Vi kombinerade nyligen en sådan metod, kromatin endogen klyvning (ChEC), med hög genomströmnings-sekvensering som ChEC-seq. ChEC-seq bygger på fusion av en kromatin-assocIerat protein av intresse för mikrokocknukleas (MNas) för att generera riktade DNA-klyvning i närvaro av kalcium i levande celler. ChEC-seq är inte baserat på immunutfällning och kringgår sålunda potentiella problem med tvärbindning, sonikering, kromatinlösning och antikroppskvalitet samtidigt som det tillhandahåller högupplösande kartläggning med minimal bakgrundssignal. Vi ser att ChEC-seq kommer att vara en kraftfull motsvarighet till ChIP, vilket ger ett självständigt medel för att både validera ChIP-seq-fynd och upptäcka nya insikter i genomisk reglering.
Introduction
Kartläggning av bindningsställena för transkriptionsfaktorer (TF), kromatinomvandlare och andra kromatinrelaterade reglerande faktorer är nyckeln till att förstå alla kromatinbaserade processer. Medan kromatinimmunutfällning och hög genomströmningssekvensering (ChIP-seq) -metoder har använts för att få många viktiga insikter i genombiologi, har de anmärkningsvärda begränsningar. Vi introducerade nyligen en alternativ metod, kallad kromatin endogen klyvning och hög genomströmning sekvensering (ChEC-seq) 1 , för att kringgå dessa nackdelar.
ChIP-seq utförs oftast med ett initialt formaldehydtvärbindningssteg (X-ChIP-seq) för att bevara protein-DNA-interaktioner. Emellertid har ett antal nyligen genomförda studier visat att X-ChIP-seq fångar transienta eller icke-specifika protein-DNA-interaktioner 2 , 3 , 4 , 5 <Sup>, 6 , 7 , 8 , vilket ger upphov till falska positiva bindningsställen. Dessutom användes sonikering, som vanligtvis användes för fragmentering av kromatin i X-ChIP-seq-experiment, företrädesvis skjuvregioner av öppen kromatin, vilket ledde till förspänd återvinning av fragment från dessa regioner 9 , 10 . Sonikering ger också en heterogen blandning av fragmentlängder, som slutligen begränsar bindningsställningsupplösningen, även om tillsatsen av ett exonukleas-digestionssteg avsevärt kan förbättra upplösningen 11 , 12 . Native ChIP-metoder, såsom upptagna regioner av genomer från affinitetsrenat naturligt isolerat kromatin (ORGANISKT) 13, använder inte tvärbindning och fragmentkromatin med mikrokocknukleas (MNas), lindrar potentiella biaser associerade med formaldehyd-tvärbindning och sonikering. Dock,Lösligheten hos många kromatinbundna proteiner under de relativt milda betingelser som krävs för nativ kromatinutvinning är dålig, vilket potentiellt leder till reducerat dynamiskt område och / eller falska negativa 14 .
Medan olika iterationer av ChIP-seq vanligen används för genombildning av proteiner med DNA-genomslag, har flera kartläggningstekniker baserade på fusion av proteiner av intresse för olika DNA-modifierande enzymer också implementerats. Ett sådant tillvägagångssätt är DNA-adeninmetyltransferasidentifiering (DamID) 15 , där ett kromatinbindande protein av intresse är genetiskt smält till Dam och denna fusion uttrycks i celler eller djur, vilket resulterar i metylering av GATC-sekvenser som är proximala till bindningsställen för proteinet. DamID är fördelaktigt genom att det inte är beroende av immunutfällning och sålunda undviker tvärbindning, antikroppar eller kromatinsolubilisering. Det utförs också in vivo . dock, Är upplösningen av DamID begränsad till kilobasskalan och metyleringsaktiviteten hos Dam-fusionsproteinet är konstitutiv. En andra metod baserad på enzymatisk fusion är Calling Card-seq 16 , som använder fusion av en faktor av intresse för ett transposas, vilket riktar platsspecifik integration av transposoner. Liksom DamID är Calling Card-seq inte baserat på immunutfällning och har därmed liknande fördelar, med den extra fördelen med ökad upplösning. Calling Card-seq kan emellertid begränsas av sekvensbiaser av transposaser och är också beroende av närvaron av restriktionsställen nära transposoninsättningsställen.
En tredje enzymatisk fusionsmetod, som utvecklats i Laemmli-lab, är kromatin-endogen klyvning (ChEC) 17 . I ChEC uttrycks en fusion mellan ett kromatinassocierat protein och MNas i celler och vid kalciumtillägg för aktivering av MNas klyvs DNA proximalt till bindningsställen för den märktaFaktor ( figur 1 ). I samband med Southern Blotting har ChEC använts för att karakterisera kromatinstruktur och proteinbindning vid ett antal enskilda loci i jäst 17 , 18 och har kombinerats med lågupplösande mikroarrayanalys för att undersöka interaktionen mellan kärnporomponenter med jäst Genom 19 . ChEC erbjuder fördelar som liknar DamID och Calling Card-seq, och dess upplösning är nästan enkelbaspar när det analyseras med primerförlängning 19 . ChEC är också kontrollerbar: Robust DNA-klyvning med MNase beror på tillsats av millimolärt kalcium, vilket säkerställer att MNas är inaktiv vid låga fria kalciumhalter som observeras i levande jästceller 20 .
Tidigare postulerade vi att kombinera ChEC med high-throughput-sekvensering (ChEC-seq) skulle tillhandahålla kartor med hög upplösning av TF-bindningsställen. Faktum är att ChEC-seq genererade högupplösta kartor över de generella jäste-generella regleringsfaktorerna (GRF) Abf1, Rap1 och Reb1 över genomet 1 . Vi har också framgångsrikt tillämpat ChEC-seq på det modulära Mediator-komplexet, en konserverad, essentiell global transkriptionell coaktivator 21 , som utvidgar tillämpligheten av ChEC-seq till megadalton-storlekskomplex som inte direkt berör DNA och kan vara svåra att kartlägga med ChIP- Baserade metoder. ChEC-seq är en kraftfull metod både för oberoende validering av ChIP-seq-resultat och generering av nya insikter i reglering av kromatin-residenta processer. Här presenterar vi ett steg för steg protokoll för genomförandet av denna metod i spirande jäst.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Generering av jäststammar
- Generera en jäststam som bär den faktor av intresse som är märkt med MNase.
- PCR förstärker MNas-märkningskassetten från den önskade vektorn ( tabell 1 ) med användning av den angivna reaktionsblandningen ( tabell 2 ) och cykliska betingelser ( tabell 3 ). Blanda 5 μl av PCR-reaktionen och 1 μl 6X DNA-laddningsfärg. Kör varje PCR-alikvot på en 0,8% agarosgel vid 120 V under 40 min. Den förväntade produktstorleken är ~ 2,3 kb.
- Transformera den förstärkta märkningskassetten till valfri stam med användning av standard litiumacetat-transformation 22 och utföra urval.
- Verifiera korrekt integration av märkningskassetten med koloni-PCR.
- Förbered den angivna reaktionsblandningen ( tabell 4 ) för antalet kolonier som ska screenas. Håll på isen tills det behövs.
- Välj en del av varje koloni som tesTed i botten av ett PCR-rör med hjälp av en steril tandpetare eller pipettspets.
- Mikrovågsugn de valda kolonierna vid hög effekt i 1 min.
- Tillsätt 50 μl PCR-blandning ( tabell 4 ) till varje mikrovågad koloni och pipetten upp och ner för att blanda. Utför PCR med angivna cykelförhållanden ( Tabell 5 ).
- Blanda 50 μl PCR-reaktion och 10 μl 6X DNA-laddningsfärg direkt i varje PCR-rör. Kör 10 μl av varje prov på en 1% agarosgel vid 120 V i 40 min. Den förväntade produktstorleken är ~ 700 bp.
OBS: Om så önskas, verifiera lämpligt uttryck av MNas-fusionsproteinet via western blotting. A-20,6 kilodaltonskift i molekylvikten hos det märkta proteinet förväntas.
- Generera en fri MNase-stam genom homologi-baserad kloning av promotorn av genen av intresse i pGZ136 (tabell 1) och transformation och selektion som i steg 1.1.2.
- AlternatiVely, montera promotorn av genen av intresse och 3xFLAG-MNase-SV40 NLS i en plasmidvektor, transformera och välj som i steg 1.1.2 och odla stammen i lämpligt selektivt tillstånd för underhåll av plasmiden.
2. ChEC
- På eftermiddagen / kvällen dagen före ChEC-experimentet ympa 3 ml jästpepton-dextros (YPD) eller lämpligt selektivt medium med en enda kolonn av stammen som bär den MNas-märkta faktorn. Inkubera denna kultur över natten (180 RPM skakning, 30 ° C).
- På morgonen på dagen för ChEC-experimentet späds över nattkulturen i 50 ml medium till en optisk densitet vid 600 nm (OD 600 ) av 0,2-0,3. Inkubera denna kultur (180 RPM skakning, 30 ° C) tills den når en OD 600 på 0,5-0,7. När kulturen närmar sig lämplig OD 600 , sätt värmeblock eller vattenbad till 30 ° C och börja tina buffert A tillsatser ( TaBle 6).
- Förbered 5 ml buffert A plus tillsatser ( tabell 6 ) per kultur. Håll buffert A vid RT under proceduren.
- Förbered mikrofuge rör innehållande 90 | il stopplösning ( Tabell 7 ) och 10 | il 10% SDS för varje tidpunkt som ska uppsamlas. För varje ny faktor som analyseras, ta prov vid 0 s, 30 s, 1 min, 2,5 min, 5 min och 10 min.
- Dekantera kulturen i ett 50 ml koniskt rör och centrifugera vid 1 500 xg och rumstemperatur (RT) i 1 min.
- Resuspendera cellerna noggrant i 1 ml buffert A och överför de resuspenderade cellerna till ett mikrovågsrör. Pellets resuspenderade celler i en mikrofuge vid 1 500 xg och RT i 30 s.
- Aspirera supernatanten och grundligt resuspendera cellerna i 1 ml buffert A genom pipettering upp och ner. Pellets resuspenderade celler i en mikrofuge vid 1500 xg och RT i 30 s. Upprepa detta steg en gång.
- Resuspenderar cellerna grundligt i 570 μl buffert A. Tillsätt 30 μl 2% digitonin(0,1% slutkoncentration) för att underlätta permeabilisering av cellerna och invertera för att blanda.
- Permeabilisera celler i värmeblock eller vattenbad vid 30 ° C i 5 min.
- Pipettera reaktionen upp och ner för att säkerställa en jämn fördelning av celler. Ta bort en 100 μl alikvot av permeabiliserade celler som en negativ kontroll till en mikrovågsrör innehållande stopplösning och SDS (steg 2.4) och virvelblandning kortvarigt att blanda.
- Tillsätt 1,1 μL 1 M CaCl2 (2 mM slutkoncentration) till permeabiliserade celler för att aktivera MNase och invertera flera gånger snabbt eller virvelblandning för att snabbt blandas. Returnera omedelbart den blandade reaktionen vid 30 ° C och starta en timer.
- Vid varje tidpunkt som ska samlas upp pipetterar reaktionen upp och ner för att säkerställa en jämn fördelning av cellerna, sedan avlägsnas en 100 μl alikvot av permeabiliserade celler till ett mikrovågsrör innehållande stopplösning och SDS och virvel kort för att blandas. För varje ny faktor som analyseras, ta 0 s (ingen CaCl 2 tillsatt), 30 s, 1 min, 2,5 min, 5 min och 10 min tidpunkter.
OBS: ChEC-experiment med faktorer som snabbt klyver DNA vid 30 ° C kan utföras vid lägre temperaturer för långsam MNase klyvningskinetik. - När alla tidpunkter har samlats tillsättes 4 μL 20 mg / ml proteinas K till varje prov, virvelblandas kort för att blandas och inkuberas vid 55 ° C under 30 minuter.
- Tillsätt 200 μL 25: 24: 1 fenol: kloroform: isoamylalkohol till varje prov, virvel blanda vortex och centrifugera med maximal hastighet och RT i en mikrofuge i 5 min.
- Ta bort varje vattenfas (~ 150 μL) till ett nytt rör. Tillsätt 30 μg glykogen och 500 μl 100% etanol. Vortex kraftigt att blanda och fälla på torris i 10 minuter eller tills lösningen är viskös.
- Pelletsfällt DNA vid maximal hastighet och 4 ° C i en mikrofuge i 10 min.
- Dekantera supernatanter och tvättpellets med 1 ml RT 70% etanol.
- Dekantera etanol, avlägsna resten genom att vända enD tappa försiktigt rören på en pappershandduk. Snurra prov med hjälp av en bänkcentrifug och använd en pipett för att avlägsna resterande etanol, var försiktig så att inte pelleten störs. Luft-torra pellets till RT i 5 min.
- Medan pellets torkar, gör en mastermix för att resuspendera torkade pellets i 29 pi Tris, pH 8,0 + 1 pi 10 mg / ml RNas A vardera. Digest RNA vid 37 ° C under 20 minuter.
- Blanda 1 μl 6X DNA-laddningsfärg med 5 μl av varje prov och kör på en 1,5% agarosgel vid 120 V i 40 min.
3. Storleksval
OBS: Målet med storleksval är att avlägsna flera kilobasfragment av genomiskt DNA från provet som skall sekvenseras och berika fragment av ~ 150 bp (ungefär storleken av nukleosomalt DNA) eller mindre. I sekvenseringsdata berikas fragment <400 bp, med en anmärkningsvärd topp runt storleken av nukleosomalt DNA (~ 150 bp) och en topp eller bred fördelning av subnucleosomala fragment.
<ol>OBS! Analys av ChEC-seq-data är ett komplext förfarande och bortom omfattningen av denna artikel. Detaljerad information om dataanalys finns i tidigare publikationer 1 , 21 och de anpassade skript som används för analys finns på GitHub (https://github.com/zentnerlab/chec-seq). HOMER 25 (http://homer.salk.edu) kan också användas för kommandoradsanalys av ChEC-seq-data.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I fallet med ett framgångsrikt ChEC-experiment kommer analys av DNA genom agarosgelelektrofores att avslöja en kalciumberoende ökning i DNA-fragmenteringstidens över-tid, såsom indikeras genom utsmältning och eventuell fullständig uppslutning av genomiskt DNA. I vissa fall observeras en stege av band liknande den som ses med en traditionell MNase-digestion efter förlängd digestion. Detta är fallet för ChEC-analys av Reb1, en allmän reglerande faktor som binder nukleosomutarmade regioner (NDR) ( Figur 2 ). Vi har funnit, när det gäller GRF, leder förlängd digestion till förlust av signal vid snabbt klyvda bindningsställen 1 . Idealiskt kommer ett prov med en minskning av storleken på det genomiska DNA-bandet som visar smältning med hög molekylvikt, såsom 30 s och 1 min-tidpunkter för Reb1 ChEC, att användas för sekvensering för att undvika tidsberoende signalförlust .
Figur 3 ). På samma sätt observerar vi väsentlig DNA-klyvning genom en fusion av mediatorunderenheten Med8 med MNase, men inte fri MNas driven av MED8 - promotorn , 1 minut efter kalciumtillägg ( Figur 3 ).
För att jämföra Reb1 ChEC-seq-data till ChIP-seq erhöll vi en lista över 1,991 Reb1-toppar bestämda av ORGANIC 13 . Dessa toppar var motivcentrerade med det genomsnittliga fragmentändtalet vid varje basposition i ett 100 bp-fönster runt motivets mittpunkt. Vi observerade en slående asymmetri i klyvning, med majoriteten av fragmenten slutar kartläggning till motströms sidan av motivet (Figur 4 ).
Figur 1 : Schematisk av ChEC-seq-metoden. En kromatinassocierad protein (CAP) -MNas-fusion uttrycks i jästceller. Proteinet binds till DNA men genererar inte klyvning över bakgrundsnivåer på grund av det mycket låga fria kalciumet i kärnan. Vid permeabilisering av celler med digitonin och tillsats av millimolärt kalcium binds CAP-MNas-fusioner till genom-klyvnings-DNA, vilket frigör små fragment. Dessa fragment renas sedan, sekvenseras och mappas tillbaka till genomet, vilket ger toppar av fragmentändar proximala till bindningsställen för CAP-MNas-fusionen. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2 : Agarosgelelektrofores av DNA från ett Reb1 ChEC-experiment. En 5 | il alikvot av DNA från varje ChEC-tidpunkt analyserades på en 1,5% TAE-agarosgel innan det valde storlek. Detta visar progressiv digestion av genomiskt DNA genom Rebl-MNas-fusionen. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3 : Genoms Browser Snapshots av Reb1-MNase och Free MNase ChEC-Seq Experiments. IGV-visningar av fragmentändningssignalen för Rebl och fri MNase ChEC-seq 30 s efter kalciumtillägg och Med8 och fri MNase ChEC-seq 1 min av Ter kalcium tillsats längs ett representativt segment av jästgenomet. Dataset normaliserades genom att dividera antalet fragmentändar mappade till varje basposition med det totala antalet fragmentändningar mappade och multiplicera med det totala antalet baserade kartor. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4 : Berikning av Reb1-MNas-utsläppt fragment slutar runt Reb1 ORGANISKA platser. Medelvärde av 30 s Reb1 och fri MNase ChEC-seq-fragmentens slutsignal runt 1,991 Reb1-motiv bestämda av ORGANIC 13 . Data normaliserades som i figur 3 .Lank "> Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
| plasmid | Jästselekterbar markör | anteckningar | Addgen-plasmidnummer |
| pGZ108 | kanMX6 | 3xFLAG-MNase-märkning, 33 aa linker | 70231 |
| pGZ109 | HIS3MX6 | 3xFLAG-MNase-märkning, 33 aa linker | 70232 |
| pGZ110 | TRP1 | 3xFLAG-MNase-märkning, 33 aa linker | 70233 |
| pGZ136 | URA3 | Expresserar 3xFLAG-MNase-SV40 NLS under kontroll av REB1 - promotorn | 72.273 |
| pGZ173 | kanMX6 | MNase-märkning, 8 aa linker | 70234 |
Tabell 1: Detaljer om ChEC-plasmider. Alla märkningssvektorer är baserade på pFA6a-vektorer och är sålunda kompatibla med de vanligen använda F2 / R1-märkningsprimerparen. Märkningskassetten består av en länkare av den angivna längden, en 3xFLAG-epitop för att underlätta detektering genom western blotting (förutom i fallet med pGZ173, där linkern har förkortats för att ta bort 3xFLAG-taggen), den mogna kedjan av MNase (GenBank P00644 , Aa 83-211) och den angivna selekterbara markören.
| Reagens | Volym | [Slutlig] |
| 5x PCR-buffert | 10 ml | 1x (2 mM MgCl2) |
| 10 mM dNTP-blandning (2,5 mM vardera dNTP) | 1 ml | 200 mM (50 mM vardera dNTP) |
| 10 mM F2-primer | 2,5 ml | 0,5 mM |
| 10 mM Rl primer | 2,5 ml | 0,5 mM |
| PGZ108 / 109/110/172 (1-5 ng / ml) | 1 ml | |
| 2 U / μL hot start high-fidelity polymeras | 0,5 ml | 1 U |
| DdH20 | 32,5 ml |
Tabell 2: Reaktionsblandning för PCR-amplifiering av 3xFLAG-MNas-märkningskassetter. F2 / R1-primer-sekvenser kan hittas på http://yeastgfp.yeastgenome.org/yeastGFPOligoSequence.txt.
| Temperatur (° C) | Tid | Cycles |
| 98 | 30 s | 1 |
| 98 | 10 s | 25 |
| 55 | 30 s | 25 |
| 72 1 min 15 s | 25 | |
| 72 | 2 min | 1 |
| 10 | Evigt | Håll |
Tabell 3: Termiska cykelbetingelser för PCR-amplifiering av 3xFLAG-MNas-märkningskassetter. Inkubationstemperatur och förlängningstid kan behöva justeras baserat på det använda DNA-polymeraset.
| Reagens | Volym | [Slutlig] |
| 10x Taq buffert | 5 ml | 1x (1,5 mM MgCl2) |
| 10 mM dNTP-blandning (2,5 mM vardera dNTP) | 1 ml | 200 mM (50 mM vardera dNTP) |
| 10 mM kontrollera primer | 1 ml | 0,2 mM |
| 10 mM MNase-R eller negativ kontrollprimer | 1 ml | 0,2 mM |
| 5 U / ml Taq-polymeras | 0,5 ml | 2,5 U |
| DdH20 | 41,5 ml |
Tabell 4: Reaktionsblandning för kolonn-PCR-bekräftelse av MNas-märkning. Kontrollera primer-sekvenser finns på http://yeastgfp.yeastgenome.org/yeastGFPOligoSequence.txt. Kontrollprimeren användes som framåtriktaren tillsammans med en omvänd primer i MNase (5'-TTGTGCAGCTTCTTGGTAC-3 ') och en omvänd primer ~ 500 baspar (bp) nedströms om respektive gen som en negativ kontroll.
| Temperatur (° C) | Tid | Cycles |
| 95 | 5 min | 1 |
| 95 | 30 s | 35 |
| 55 | 30 s | 35 |
| 68 | 1 min | 35 |
| 68 | 5 min | 1 |
| 10 | Evigt | Håll |
Tabell 5: Termiska cykelbetingelser för kolonn-PCR-bekräftelse av MNas-märkning. Inkubationstemperatur och förlängningstid kan behöva justeras baserat på det använda DNA-polymeraset.
| Reagens | Volym | [Slutlig] |
| 1 M Tris, pH 7,5 | 1,5 ml | 15 mM |
| 1 M KCl | 8 ml | 80 mM |
| 0,2 M EGTA | 50 ml | 0,1 mM |
| DdH20 | Fyll till 100ml |
Tabell 6: Recept för buffert A. Före användning tillsättes hälften av en proteashämmare tablett, 50 | il 100 mM PMSF (1 mM slutlig), 5 | il 200 mM spermin (0,2 mM slutlig) och 2,5 | il av 1 M Spermidin (0,5 mM slutlig) per 5 ml lösning.
| Reagens | Volym | [Slutlig] |
| 5 M NaCl | 8 ml | 400 mM |
| 0,5 M EDTA | 4 ml | 20 mM |
| 0,2 M EGTA | 2 ml | 4 mM |
| DdH20 | Fyll till 100 ml |
Tabell 7: Recept för 2x stopplösning. Kombinera 90 μL stoP-lösning med 10 μl 10% SDS i ett mikrofuge-rör för varje tidpunkt som ska tas (se steg 2.4).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi har visat att ChEC kan kartlägga olika klasser av jästproteiner på kromatin och förutse att det kommer att vara allmänt tillämpligt på olika familjer av TF och andra kromatinbindande faktorer i jäst. ChEC-seq är fördelaktigt genom att det inte kräver tvärbindning, kromatinsolubilisering eller antikroppar. Således undviker ChEC artefakter som är potentiellt närvarande i X-ChIP-seq, såsom hyper-ChIPable artefact 3 , 4 och native ChIP, såsom falska negativa på grund av ofullständig proteinsolubilisering 14 . Den stora nackdelen med ChEC-seq, som med alla enzymatiska fusionsmetoder, är kravet på ett fusionsprotein. Detta kan uppnås snabbt i spirande jäst, men är mer mödosam i metazoaner. En annan begränsning av ChEC-seq är att den inte kan implementeras som-är för profilering av histon-modifikationer. En modifieringsbindande domän kan emellertid fusioneras till MNase och uttryckas, vilket möjliggör hIstone-modifieringskartläggning med ChEC-seq. I denna ven har ChIP-seq med användning av epitop-märkta histon-modifieringsbindande domäner använts för att kartlägga genomgående mönster av histon-modifiering 26 .
Användningen av en fri MNase-kontroll är viktig för att fastställa specificiteten av ChEC-seq-resultaten. Den fria MNase-stammen bär MNas märkt med 3xFLAG och en simianvirus 40 nukleär lokaliseringssignal (SV40 NLS) under kontroll av den endogena promotorn för genen av intresse. Det är begreppsmässigt lik den obefintliga Dam-kontrollen som användes i DamID-studierna 27 och kontrollerar för icke-specifik klyvning på grund av tillgänglighet av kromatin. Som en fri MNase-kontroll för TF ChEC-seq integrerade vi 3xFLAG-MNase-SV40 NLS driven av REB1 - promotorn på ura3- locus 1 . För Mediator ChEC-seq uttryckte vi 3xFLAG-MNase-SV40 NLS under kontroll av MED8 - promotorn i en icke integrationsplasmaD-vektor bibehållen i selektivt medium 21 . I båda fallen observerades mycket liten klyvning med fri MNase. Sålunda bör en enda kontrollstam i vilken 3xFLAG-MNase-SV40 NLS drivs av en relativt robust promotor vara lämplig för de flesta experiment.
Vid planering av ett ChEC-experiment kan strukturell behandling av proteinet av intresse vara viktigt. Till exempel fann vi att tillägg MNase till C-änden av Reb1 gav ett asymmetriskt klyvningsmönster kring Reb1-motiv, medan uttrycket av Reb1 med N-terminalt MNas gav ett symmetriskt klyvningsmönster 1 . Vi tilldelar dessa olika klyvningsmönster till strukturen hos Reb1. DNA-bindningsdomänen för Rebl är belägen vid sin C-terminus; C-terminalen är sålunda strukturerad och nära DNA, vilket begränsar rörelseområdet för MNas och tillåter endast C-terminal klyvning. I motsats till detta är Cf-terminalen hos Abf1 relativt ostrukturerad och kan således verka att öka tillRäckvidd av MNas, vilket möjliggör klyvning på båda sidor av Abfl-bindningsställen. I fallet med Rap1, en annan jäst GRF, fann vi att förkortning av länken mellan C-terminalen och MNas från 33 till 8 aa var tillräcklig för att kraftigt minska klyvning, kanske på grund av det föreslagna avståndet mellan den C-terminala delen av Rapl från DNA 28 . Sådan strukturell övervägning är också sannolikt att vara viktig när man försöker kartlägga bindningen av proteiner närvarande i stora komplex. För vår ChEC-seq-analys av mediatorbindning till jästgenomet 21 valde vi subenheter vars C-termini strukturellt förutspåddes att exponeras, snarare än begravda inom komplexet. Av de tre subenheterna kondenserade till MNase klyvde man inte kraftigt DNA, vilket tyder på att antingen steriska begränsningar eller interaktioner med andra DNA-bindande faktorer dämpade DNA-klyvning.
Vi fann att ChEC-seq detekterar 4-12 gånger fler toppar för jäst GRFs Abf1, Rap1 och Reb1 än olika ChIP-tillvägagångssätt när alla tidpunkter beaktades tillsammans 1 . Dessa ställen kan delas upp i två klasser baserat på MNas klyvningskinetik. Analys av ChEC-seq-data för jäst-GRF avslöjade två temporärt separata klasser av bindningsställen 1 . Den första termen "snabb" visas maximal klyvning <1 min efter kalciumtillägget och innehåller i allmänhet robusta matchningar till kända konsensusmotiv. Den andra, betecknad "långsam", tog flera minuter för att nå märkliga nivåer av klyvning och var utarmade av motivkampanjer. Båda klasserna av webbplatser berikades i genomsnitt för bindning i ChIP-dataset, fastän de inte nödvändigtvis kallades som toppar i dessa ChIP-studier. Flertalet platser för en given faktor var långsamma platser. Vi spekulerar på att snabba sajter är representativa för bindningsställen med hög affinitetstransskriptionsfaktor, medan långsamma platser representerar loci som transienta samplas vid bindningsställsskanning. ObBetjäning av två klasser av bindningsställ separerade av kinetiken av MNas-klyvning kan förklara observationen i många ChIP-seq dataset att ett stort antal toppar för en given faktor med en väletablerad DNA-bindningsspecificitet inte innehåller ett konsensusmotiv 29 : Formaldehyd-tvärbindning, utförd i 10-15 minuter i de flesta ChIP-protokoll, kan upprepade gånger fånga övergående eller opportunistiska interaktioner av en faktor med genomet, vilket leder till signalinflation. Faktum är att jämförelse mellan ChIP-exo och live cell imaging tyder på att detta är fallet 2 . I synnerhet observerade vi inte en sådan dramatisk tidsberoende minskning i Mediator ChEC-seq-signaler 21 , med Mediator ChEC-seq-signalen relativt konstant från 30 s till 20 min. Med tanke på dessa observationer rekommenderar vi att du utför ChEC-seq med kort varaktighet för att återställa bindningsställen med hög säkerhet.
Vi förutser att ChEC-seq kan anpassas till icke-jästsystem. Koncentrationen av fritt kalcium i ostimulerade däggdjursceller är 50-300 nM 30 , 32 , långt under tröskeln för effektiv MNas-aktivering. Det begränsande steget för etablering av ChEC-seq i metazoansystem är således alstringen av fusionsproteiner, som fortfarande är mycket mer krävande i metazoan än jästceller. Emellertid har endogen märkning av metazoan-gener underlättats avsevärt av tillkomsten av CRISPR-baserad genomteknik 33 , och därför bör denna begränsning lätt överföras. Alternativt kan MNas-fusionsproteiner uttryckas vid låga halter från plasmider. Detta tillvägagångssätt har varit ganska framgångsrikt för DamID i Drosophila 34 , 35 och humana 36 celler och kan sålunda även underlätta ChEC-seq i metazoanceller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar Moustafa Saleh och Jay Tourigny för kritisk läsning av manuskriptet och Steven Hahn och Steven Henikoff för mentorskap och support under utvecklingen av ChEC-seq och dess tillämpning på Mediator-komplexet. SG stöds av NIH-bidrag R01GM053451 och R01GM075114 och GEZ stöds av Indiana University startup funds.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| dNTPs | NEB | N0447 | |
| Q5 high-fidelity DNA polymerase | NEB | M0491L | Other high-fidelity DNA polymerases, such as Phusion, may be used for cassette amplification. |
| TrackIt 1 Kb Plus DNA ladder | ThermoFisher Scientific | 10488085 | |
| Taq DNA polymerase | NEB | M0273L | |
| cOmplete Mini EDTA-free protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | 11836170001 | It is important that an EDTA-free protease inhibitor mix is used, so as not to inhibit MNase cleavage by chelation of Ca2+. |
| PMSF | ACROS Organics | AC215740010 | |
| Digitonin, High Purity | EMD Millipore | 300410-250MG | Make a 2% stock by dissolving 20 mg digitonin in 1 mL DMSO with vigorous vortexing. |
| Proteinase K, 20 mg/mL | Invitrogen | 25530049 | |
| RNase A, 10 mg/mL | ThermoFisher Scientific | EN0531 | |
| Ampure XP beads | Beckman Coulter | A63880 | Ampure-like beads can be generated using a published protocol (ref 24). |
| MagneSphere magnetic rack | Promega | Z5342 |
References
- Zentner, G. E., Kasinathan, S., Xin, B., Rohs, R., Henikoff, S. ChEC-seq kinetics discriminates transcription factor binding sites by DNA sequence and shape in vivo. Nat Commun. 6, 8733 (2015).
- Chen, J., et al. Single-Molecule Dynamics of Enhanceosome Assembly in Embryonic Stem Cells. Cell. 156 (6), 1274-1285 (2014).
- Teytelman, L., Thurtle, D. M., Rine, J., van Oudenaarden, A. Highly expressed loci are vulnerable to misleading ChIP localization of multiple unrelated proteins. Proc Natl Acad Sci USA. 110 (46), 18602-18607 (2013).
- Park, D., Lee, Y., Bhupindersingh, G., Iyer, V. R. Widespread Misinterpretable ChIP-seq Bias in Yeast. PLoS ONE. 8 (12), 83506 (2013).
- Jain, D., Baldi, S., Zabel, A., Straub, T., Becker, P. B. Active promoters give rise to false positive 'Phantom Peaks' in ChIP-seq experiments. Nucleic Acids Res. , (2015).
- Krebs, W., et al. Optimization of transcription factor binding map accuracy utilizing knockout-mouse models. Nucleic Acids Res. 42 (21), 13051-13060 (2014).
- Paul, E., Zhu, Z. I., Landsman, D., Morse, R. H. Genome-Wide Association of Mediator and RNA Polymerase II in Wild-Type and Mediator Mutant Yeast. Mol Cell Biol. 35 (1), 331-342 (2015).
- Worsley Hunt, R., Wasserman, W. W. Non-targeted transcription factors motifs are a systemic component of ChIP-seq datasets. Genome Biol. 15 (7), 412 (2014).
- Vega, V. B., Cheung, E., Palanisamy, N., Sung, W. -K. Inherent Signals in Sequencing-Based Chromatin-ImmunoPrecipitation Control Libraries. PLoS ONE. 4 (4), 5241 (2009).
- Teytelman, L., et al. Impact of Chromatin Structures on DNA Processing for Genomic Analyses. PLoS ONE. 4 (8), 6700 (2009).
- Rhee, H. S., Pugh, B. F. Comprehensive Genome-wide Protein-DNA Interactions Detected at Single-Nucleotide Resolution. Cell. 147 (6), 1408-1419 (2011).
- He, Q., Johnston, J., Zeitlinger, J. ChIP-nexus enables improved detection of in vivo transcription factor binding footprints. Nat Biotech. 33 (4), 395-401 (2015).
- Kasinathan, S., Orsi, G. A., Zentner, G. E., Ahmad, K., Henikoff, S. High-resolution mapping of transcription factor binding sites on native chromatin. Nat Methods. 11 (2), 203-209 (2014).
- Skene, P. J., Hernandez, A. E., Groudine, M., Henikoff, S. The nucleosomal barrier to promoter escape by RNA polymerase II is overcome by the chromatin remodeler Chd1. eLife. 3, 02042 (2014).
- Aughey, G. N., Southall, T. D. Dam it's good! DamID profiling of protein-DNA interactions. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 5 (1), 25-37 (2016).
- Wang, H., Mayhew, D., Chen, X., Johnston, M., Mitra, R. D. Calling Cards enable multiplexed identification of the genomic targets of DNA-binding proteins. Genome Res. 21 (5), 748-755 (2011).
- Schmid, M., Durussel, T., Laemmli, U. K. ChIC and ChEC: Genomic Mapping of Chromatin Proteins. Mol Cell. 16 (1), 147-157 (2004).
- Merz, K., et al. Actively transcribed rRNA genes in S. cerevisiae are organized in a specialized chromatin associated with the high-mobility group protein Hmo1 and are largely devoid of histone molecules. Genes Dev. 22 (9), 1190-1204 (2008).
- Schmid, M., et al. Nup-PI: The Nucleopore-Promoter Interaction of Genes in Yeast. Mol Cell. 21 (3), 379-391 (2006).
- Dunn, T., Gable, K., Beeler, T. Regulation of cellular Ca2+ by yeast vacuoles. J Biol Chem. 269 (10), 7273-7278 (1994).
- Grünberg, S., Henikoff, S., Hahn, S., Zentner, G. E. Mediator binding to UASs is broadly uncoupled from transcription and cooperative with TFIID recruitment to promoters. The EMBO Journal. 35 (22), 2435-2446 (2016).
- Gietz, R. D., Schiestl, R. H. High-efficiency yeast transformation using the LiAc/SS carrier DNA/PEG method. Nat. Protocols. 2 (1), 31-34 (2007).
- Rohland, N., Reich, D. Cost-effective, high-throughput DNA sequencing libraries for multiplexed target capture. Genome Res. 22 (5), 939-946 (2012).
- Orsi, G. A., Kasinathan, S., Zentner, G. E., Henikoff, S., Ahmad, K. Mapping regulatory factors by immunoprecipitation from native chromatin. Current protocols in molecular biology. Ausubel, F. M., et al. 110, 21-25 (2015).
- Heinz, S., et al. Simple Combinations of Lineage-Determining Transcription Factors Prime cis-Regulatory Elements Required for Macrophage and B Cell Identities. Mol Cell. 38 (4), 576-589 (2010).
- Kungulovski, G., et al. Application of histone modification-specific interaction domains as an alternative to antibodies. Genome Res. 24 (11), 1842-1853 (2014).
- Vogel, M. J., Peric-Hupkes, D., van Steensel, B. Detection of in vivo protein-DNA interactions using DamID in mammalian cells. Nat. Protocols. 2 (6), 1467-1478 (2007).
- Feeser, E. A., Wolberger, C. Structural and Functional Studies of the Rap1 C-Terminus Reveal Novel Separation-of-Function Mutants. J Mol Biol. 380 (3), 520-531 (2008).
- Neph, S., et al. An expansive human regulatory lexicon encoded in transcription factor footprints. Nature. 489 (7414), 83-90 (2012).
- Mountjoy, K. G., Kong, P. L., Taylor, J. A., Willard, D. H., Wilkison, W. O. Melanocortin receptor-mediated mobilization of intracellular free calcium in HEK293 cells. Physiol Genomics. 5 (1), 11-19 (2001).
- Seurin, D., Lombet, A., Babajko, S., Godeau, F., Ricort, J. -M. Insulin-Like Growth Factor Binding Proteins Increase Intracellular Calcium Levels in Two Different Cell Lines. PLoS ONE. 8 (3), e59323 (2013).
- Grienberger, C., Konnerth, A. Imaging Calcium in Neurons. Neuron. 73 (5), 862-885 (2012).
- Sander, J. D., Joung, J. K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nat Biotech. 32 (4), 347-355 (2014).
- Filion, G. J., et al. Systematic Protein Location Mapping Reveals Five Principal Chromatin Types in Drosophila Cells. Cell. 143 (2), 212-224 (2010).
- van Bemmel, J. G., et al. A Network Model of the Molecular Organization of Chromatin in Drosophila. Mol Cell. 49 (4), 759-771 (2013).
- Izzo, A., et al. The Genomic Landscape of the Somatic Linker Histone Subtypes H1.1 to H1.5 in Human Cells. Cell Rep. 3 (6), 2142-2154 (2013).
