Summary

삼투압 펌프 또는 직접적인 근육 주사를 이용한 피하 뉴로트로핀 4 주입으로 노화 후두 근육 강화

Published: June 13, 2017
doi:

Summary

여기에서 우리는 쥐 노화 후두 근육을 재구성하기 위해 전신적으로 그리고 직접적으로 뉴로 트로 핀 4 (NTF4)의 사용을 기술하는 프로토콜을 제시합니다.

Abstract

노인에서 후두 장애는 음성 장애에서부터 연하 장애로,기도 보호 반사 신경 장애로 이어집니다. 연령 관련 후두 근육 기능 장애를 표적으로하는 치료법은 거의 없습니다. 뉴로 트로 핀 (neurotrophin)은 근육 신경 분포 및 신경근 접합부 (NMUs)의 분화에 관여합니다. 뉴로 트로 핀은 신경 전달 물질 방출을 증가시킴으로써 신경근 전달을 향상시키는 것으로 생각됩니다. neuromuscular junctions (NMJs)는 노화 된 쥐의 후두 근육에서 작고 덜 풍부 해지고, 기능적 소실의 증거가 있습니다. 우리는 노화 후두 근육의 기능을 향상시키는 치료제로서 미래의 임상 적 사용을위한 NTF4의 효과를 탐구했다. 여기서는 NTF4 적용에 대한 반응으로 쥐의 두드러기 후두 근육이 재 형성되는 능력을 조사하기 위해 NTF4의 전신 투여 및 직접 주사에 대한 상세한 프로토콜을 제공합니다. 이 방법에서는 쥐가 NTF4를 전신적 으로 o자극적 인 펌프 또는 성대를 통한 직접 주입에 의한 것입니다. 후속 근육을 절개하여 형태학 및 연령 관련 소실에 대한 조직 학적 검사에 사용 하였다.

Introduction

후두 근육은 신속하고 지속적으로 수축하며 노화의 부작용에 취약합니다. 이 지속적인 활동은 65 세 이상의 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 명에서 관찰되는 목소리 문제 또는 연하 장애에 기여하는 것으로 생각됩니다. 몇 가지 분자 및 pathophysiologic 메커니즘이 나이 관련 기능 장애에 기여한다. 이러한 메커니즘은 후두 점막의 재건, 근육 섬유 위축 또는 손실, 성대의 굽힘과 성문 폐쇄의 원인이되는 근섬유 재생 또는 위축의 결핍을 포함 할 수 있습니다 8 , 9 , 10 , 11 . 현재로서는 입증 된 의학 요법이 없습니다.이러한 근육의 연령 관련 변화를 철저히 예방하거나 재활시킵니다.

신경근 전달의 효과를 조절하면 신경 모터의 성능에 큰 영향을 줄 수 있습니다. 뉴로 트로 핀의 계열은 신경 성장 인자 (NGF), 뇌 파생 신경 성장 인자 (BDNF), 뉴로 트로 핀 3 (NTF3) 및 NTF4 12 , 13을 포함 한다. 뉴로 트로 핀은 시냅스 효능을 조절하는 것으로 나타났습니다. 간세포 성장 인자, 형질 전환 성장 인자 베타 및 섬유 아세포 성장 인자는 최근 성대 흉터 치료를 위해 인간에서 사용되어왔다. NTF4는 또한 NMJ 효과를 조절합니다. NTF4가 결핍 된 마우스는 해체 된 NMJs 11 , 18 , 19를 보여준다. 이 연구는 치료자의 유망한 효과를 가져옵니다고령화 된 후두 근육 장애 및 성장 인자로 인한 노화.

성대 주름의 조직에 대한 직접 주사 치료제는 인간에게 전례가 없습니다. 예를 들어, 보툴리누스 독소의 국소 주사는 경련성 발성 장애 및 양측 재발 성 후두 신경 마비와 같은 후두 근육에 영향을 미치는 신경 학적 운동 장애에 대한 효과적인 치료법으로 현재 사용되고 있습니다 20 , 21 . Hyaluronic acid hydrogel은 보컬 폴드 징후와 성문 기능 부전을 치료하는 데 사용되는 또 다른 주사제입니다 22 , 23 . 주사 후두 성형술은 다양한 의사 소통 장애 치료에 사용될 수 있습니다 24 . 이러한 직접적인 주사 방법은 노령 인구에서 보컬 기능과 삼킴을 향상시킬 수 있습니다.

Protocol

이 프로토콜에 대해 6 개월에서 30 개월 된 수컷 Fischer 344-Brown Norway 쥐를 사용하십시오. 랫트는 국립 늙은 쥐 서식지 연구소 (National Institute of Aging)의 설치류 식민지에서 얻은 것이다. 랫트 후두의 구조는기도 보호 및 종 특이 적 발성을 위해 기능적으로 작용하는 인간의 것과 유사하기 때문에 본 연구를 위해 쥐를 사용했다.이 연구는 실험실 동물의 인간애 관리 및 사용에 관한 PHS 정책에 따라 수행…

Representative Results

2 주 동안 삼투압 펌프를 주입하거나 NTF4를 직접 주입 한 후 1 주일 동안 랫트를 안락사시켰다. 후두를 수확하고 동결 방지제 (30 % 자당 및 70 % 인산 완충 생리 식염수)에 넣은 다음 저온 유지 장치를 사용하여 10-μm 폭으로 연속 절편을 만들었습니다. 나이가 들어간 후두 근육은 NTF4 투여로 영향을받습니다 25 . 젊고 오래된 쥐 이외에, 우리는 thyroarytenoid 근?…

Discussion

후두 근육은 노화의 부작용에 취약합니다. 이전의 연구들은 수축 기능과 myosin isoform 변이의 변화뿐만 아니라 섬유 크기, 총 섬유 수, 재생 능력, NMJ 크기 및 양 변화에 대한 후두 근육의 변화를 보여주었습니다 4 , 11 , 27 , 30 , 31 . 노화 후두 근육은 신경 영양소의 적용으로 바?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

이 연구는 난청 및 기타 의사 소통 장애 (R21DC010806에서 CAM 및 JCS로, R01DC011285에서 CAM로)의 국립 연구소로부터의 보조금에 의해 지원되었습니다.

Materials

Neurotrophin 4 Pepro Tech 450-04 200ng in 50μl
Alzet Osmotic Pump DURECT Corporation 2001D
30° endoscope Stoltz 61029D
50mm 30 gauge 100-μl syringe Hamilton 84850 and 201812
saline (sodium chloride solution) Sigma-Aldrich S8776
ketamine hydrochloride Henry Schein 56344
xylazine hydrochloride Henry Schein 33198
25 G 5/8 needle Becton-Dickinson 305901
1 ml syringe Becton-Dickinson 309659
ophthalmic ointment Henry Schein 8897
clippers Oster 44-018
ethanol Decon 2716
iodine (Betadine) Purdue Pharma L.P. 606404
heating pad Sunbeam 731-5
5-0 nylon suture thread AD Surgical PMN-518R6
crile hemostat Fine Science Tools 13005-14
delicate suture tying forceps Fine Science Tools 11063-07
meloxicam Henry Schein 49756
carprofen Merritt Veterinary Supplies 148700
antibiotic ointment Henry Schein 57110
acepromizine Aceproject Henry Schein 3845
isoflurane Isothesia Henry Schein 50033
induction box (anesthetizing box) Harvard Apparatus 50-0116
oxygen compressed tank Scott Gross UN1072
plexiglas platform Small Parts Inc (Amazon)
rubber tipped forceps Fine science tools rubber 11075-00
liquid rubber for forceps above Lowe's 42518
plastic spectula (BD syringe cut to length) Becton-Dickinson 309659
halogen light source rhino-laryngeal stroboscope Kay-Pentax RLS 9100 B
video recorder Kay-Pentax
sucrose Sigma-Aldrich S0389-500G
phosphate buffered saline Sigma-Aldrich P4417-100TAB
cryostat Mictotom HM525 Thermo Scientific HM 525
Gill 1 hematoxylin VWR 10143-142
Shandon eosin-Y alcoholic Thermo Fisher Scientific 6766007
anti-sodium channel Nav1.5 antibody produced in rabbit Sigma-Aldrich S0819
Texas red-X phalloidin Sigma-Aldrich T7471
alpha- bungarotoxin alexa fluor 488 conjugate Thermo Fisher Scientific B-13422
Small animal anaesthesia machine Smiths Medical CDS 9000

References

  1. Trupe, E. H., et al. Correlates and consequences of eating dependency in institutionalized elderly. J. Am. Geriatrics Society. 34 (3), 192-198 (1986).
  2. Ward, P. H., Colton, R., McConnell, F., Malmgren, L., Kashima, H., Woodson, G. Aging of the voice and swallowing. Otolaryngol. Head Neck Surg. 100 (4), 283-286 (1989).
  3. Gay, E. G., Kronenfeld, J. J., Dettmann, F. G. A comparison on the effect of regulation on health care for the older American: a tale of two states. Gerontologist. 34 (6), 787-796 (1994).
  4. Hagen, P., Lyons, G. D., Nuss, D. W. Dysphonia in the elderly:diagnosis and management of age-related voice changes. South. Med. J. 89 (2), 204-207 (1996).
  5. Broniatowski, M., et al. Current evaluation and treatment of patients with swallowing disorders. Otolaryngol. Head Neck Surgery. 120 (4), 464-473 (1999).
  6. Lundy, D. S., et al. Aspiration: cause and implications. Otolaryngol. Head Neck Surg. 120 (4), 474-478 (1999).
  7. Schindler, J. S., Kelly, J. H. Swallowing disorders in the elderly. Laryngoscope. 112 (4), 589-602 (2002).
  8. Gambino, D. R., Malmgren, L. T., Gacek, R. R. Age-related changes in the neuromuscular junctions in the human posterior cricoarytenoid muscles: a quantitative study. Laryngoscope. 100 (3), 262-268 (1990).
  9. Sinard, R. J. The aging voice: how to differentiate disease from normal changes. Geriatrics. 53 (7), 76-79 (1998).
  10. Baker, K. K., Olson-Raming, L., Sapir, S., Luschei, E. S., Smith, M. E. Control of vocal loudness in young and old adults. J. Speech Lang. Hear Res. 44 (2), 297-305 (2001).
  11. McMullen, C. A., Andrade, F. H. Functional and morphological evidence of age-related denervation in rat laryngeal muscles. J. Gerontol. A. Biol. Sci. Med. Sci. 64 (4), 435-442 (2009).
  12. Lai, K., Ip, N. Y. Postsynaptic signaling of new players at the neuromuscular junction. J. Neurocytol. 32 (5-8), 727-741 (2003).
  13. Huang, E. J., Reichardt, L. F. Neurotrophins: roles in neuronal development and function. Annu. Rev. Neurosci. 24 (1), 677-736 (2012).
  14. Gonzalez, M., et al. Disruption of Trkb mediated signaling induces disassembly of postsynaptic receptor clusters at neuromuscular junctions. Neuron. 24 (3), 567-583 (1999).
  15. Hirano, S., Kishimoto, Y., Suehiro, A., Kanemaru, S., Ito, J. Regeneration of aged vocal folds: first human case treated with fibroblast growth factor. Laryngoscope. 118 (12), 2254-2259 (2008).
  16. Branski, R. C., et al. Effects of transforming growth factor-beta 1 on human vocal fold fibroblasts. Ann. Oto. Rhinol. Laryngol. 118 (3), 218-226 (2009).
  17. Kishimoto, Y., et al. Effects of exogenous hepatocyte growth factor on vocal fold fibroblasts. Ann. Otol. Rhinol. Laryngol. 118 (8), 606-611 (2009).
  18. Belluardo, N., et al. Neuromuscular junction disassembly and muscle fatigue in mice lacking neurotrophin-4. Mol. Cell. Neurosci. 18 (1), 56-57 (2001).
  19. Johnson, A. M., Ciucci, M. R., Connor, N. P. Vocal training mitigates age-related changes within the vocal mechanisms in the old rat. J. Gerontol. A Biol. Sci. Med. Sci. 68 (12), 1458-1468 (2013).
  20. Roscow, D. E., Parikh, P., Vivero, R. J., Casiano, R. R., Lundy, D. S. Considerations for initial dosing of botulinum toxin in treatment of adductor spasmodic dysphonia. Oto. HeadNeck Surg. 148 (6), 1003-1006 (2013).
  21. Benninger, M. S., Hanick, A., Hicks, D. M. Cricothyroid muscle botulinum toxin injection to improve airway for bilateral recurrent laryngeal nerve paralysis, A case series. J. Voice. 30 (1), 96-99 (2016).
  22. Coppoolse, J. M. S., et al. An in vivo study of composite microgels based on hyaluronic acid and gelatin for the reconstruction of surgically injured rat vocal folds. J. Speech Lang Hear Res. 57 (2), S658-S673 (2014).
  23. Hertegård, S., et al. Cross-linked hyaluronan used as augmentation substance for treatment of glottal insufficiency: Safety aspects and vocal fold function. Laryngoscope. 112 (12), 2211-2219 (2002).
  24. Walker, W. F., Homberger, D. G. . Anatomy and dissection of the rat. , (1997).
  25. Ohno, T., Hirano, S., Rousseau, B. Age-associated changes in the expression and deposition of vocal fold collagen and hyaluronan. Ann. Oto. Rhinol. Laryngol. 25 (1), 192-197 (2009).
  26. Stemple, J. C., et al. Enhancement of aging rat laryngeal muscles with endogenous growth factor treatment. Physiol. Rep. 4 (10), e12798 (2016).
  27. McMullen, C. A., Andrade, F. H. Contractile dysfunction and altered metabolic profile of the aging rat thyroarytenoid muscle. J. Appl. Phys. 100 (2), 602-608 (2006).
  28. Engle, W. K., Cunningham, G. C. Rapid examination of muscle tissue. An improved trichrome method for fresh-frozen biopsy section. Neurology. (13), 919-923 (1963).
  29. Sheehan, D. C., Hrapchack, B. B. Theory and practice of histotechnology. Battelle. , (1980).
  30. Kulakowski, S. A., Parker, S. D., Personius, K. E. Reduced TrkB expression results in precocious age-like changes in neuromuscular structure, neurotransmission, and muscle function. J. Appl. Phys. 111 (3), 844-852 (2011).
  31. Nishida, N., et al. Age-related change in rat intrinsic laryngeal muscles: analysis of muscle fibers, muscle fiber proteins and subneural apparatuses. Eur Arch Otorhinolaryngol. 270 (3), 975-984 (2013).

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Andreatta, R. D., Stemple, J. C., Seward, T. S., McMullen, C. A. Subcutaneous Neurotrophin 4 Infusion Using Osmotic Pumps or Direct Muscular Injection Enhances Aging Rat Laryngeal Muscles. J. Vis. Exp. (124), e55837, doi:10.3791/55837 (2017).

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