Summary

La infusión subcutánea de neurotrofina 4 con bombas osmóticas o inyección muscular directa mejora el envejecimiento de los músculos laríngeos de la rata

Published: June 13, 2017
doi:

Summary

Aquí, presentamos un protocolo para describir el uso de la neurotrofina 4 (NTF4) sistemática y directamente para remodelar los músculos laríngeos envejecidos en ratas.

Abstract

La disfunción laríngea en los ancianos es una causa importante de discapacidad, desde trastornos de voz hasta disfagia y pérdida de los reflejos protectores de las vías respiratorias. Existen pocas terapias, si las hay, que apuntan a la disfunción del músculo laríngeo relacionada con la edad. Las neurotrofinas participan en la inervación muscular y la diferenciación de las uniones neuromusculares (NMJs). Se cree que las neurotrofinas potencian la transmisión neuromuscular aumentando la liberación del neurotransmisor. Las uniones neuromusculares (NMJs) se hacen más pequeñas y menos abundantes en los músculos laríngeos de rata envejecidos, con evidencia de denervación funcional. Exploramos los efectos de NTF4 para uso clínico futuro como un terapéutico para mejorar la función en el envejecimiento de los músculos laríngeos humanos. Aquí, proporcionamos el protocolo detallado para la aplicación sistémica y la inyección directa de NTF4 para investigar la capacidad de envejecimiento de la rata músculo laríngeo para remodelar en respuesta a la aplicación de NTF4. En este método, las ratas recibieron NTF4 ya sea sistemáticamente a través de oSmotic o por inyección directa a través de los pliegues vocales. Luego se diseccionaron los músculos laríngeos y se utilizaron para el examen histológico de morfología y la denervación relacionada con la edad.

Introduction

Los músculos laríngeos se contraen rápida y consistentemente y son vulnerables a los efectos adversos del envejecimiento. Se cree que esta actividad constante contribuye a problemas de voz o disfagia observados en personas mayores de 65 años 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 . Varios mecanismos moleculares y fisiopatológicos contribuyen a esta disfunción relacionada con la edad. Estos mecanismos pueden incluir la remodelación de la mucosa laríngea, la atrofia o pérdida de las fibras musculares, la falta de regeneración de las fibras musculares o la atrofia que provoca el arqueamiento de los pliegues vocales y la incapacidad del cierre de la glotis 8 , 9 , 10 , 11 . No hay terapia médica comprobada en este momento que pueda comPara prevenir o rehabilitar estos cambios relacionados con la edad en estos músculos.

La modulación de la efectividad de la transmisión neuromuscular puede influir en gran medida en el rendimiento neuromotor. La familia de neurotrofinas incluye el factor de crecimiento nervioso (NGF), el factor de crecimiento nervioso derivado del cerebro (BDNF), la neurotrofina 3 (NTF3) y NTF4 12 , 13 . Se ha demostrado que las neurotrofinas modulan la eficacia sináptica 1 , 4 . El factor de crecimiento de los hepatocitos, el factor de crecimiento transformante beta y el factor de crecimiento de los fibroblastos se han utilizado recientemente en seres humanos para el tratamiento de las cicatrices de los pliegues vocales 15 17 . NTF4 también regula la eficacia de NMJ; Los ratones que carecen de NTF4 muestran NMJs desmontados 11 , 18 , 19 . Estos estudios llevan a efectos prometedores de tratamientosT de trastornos del músculo laríngeo envejecido y denervación con factores de crecimiento.

La terapéutica de inyección directa a los tejidos de los pliegues vocales no es sin precedentes en los seres humanos. Por ejemplo, las inyecciones locales de toxina botulínica se utilizan actualmente como un tratamiento eficaz para los trastornos del movimiento neurológico que afectan a los músculos de la laringe, como la disfonía espasmódica y la parálisis bilateral del nervio laríngeo recurrente 20 , 21 . El hidrogel de ácido hialurónico es otro inyectable, que se utiliza para tratar la cicatrización del pliegue vocal y la insuficiencia glotal 22 , 23 . La laringoplastia por inyección se puede utilizar para tratar una variedad de trastornos de la comunicación 24 . Estos métodos de inyección directa prometen mejorar la función vocal y tragar en las poblaciones de envejecimiento.

Protocol

Utilizar las ratas macho Fischer 344-Brown Noruega a los 6 y 30 meses de edad para este protocolo. Las ratas se obtuvieron de la colonia de roedores del Instituto Nacional de Envejecimiento. Utilizamos las ratas para este estudio debido a que la estructura de la laringe de rata es similar a la del ser humano, sirviendo funcionalmente para la protección de las vías respiratorias y las vocalizaciones específicas de cada especie. Este estudio se realizó de acuerdo con la Política PHS sobre Cuidado Humano y Uso de Anim…

Representative Results

Las ratas se sacrificaron después de 2 semanas de infusión de bomba osmótica o 1 semana después de la inyección directa de NTF4. Las laringes se cosecharon, se colocaron en crioprotector (sacarosa al 30% y solución salina tamponada con fosfato al 70%) y luego se seccionaron en serie en anchos de 10 μm con un criostato. El envejecimiento de los músculos laríngeos se ven afectados por la administración de NTF4 [ 25] . Además de rata joven y vieja, compara…

Discussion

Los músculos laríngeos son vulnerables a los efectos desfavorables del envejecimiento. Estudios previos han demostrado cambios en el envejecimiento de los músculos laríngeos que incluyen cambios en el tamaño de las fibras, el número total de fibras, la capacidad regenerativa, el tamaño NMJ y los cambios de cantidad, además de las variaciones en la función contráctil y la isoforma de la miosina 4 , 11 , 27 ,

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabajo fue apoyado por subvenciones del Instituto Nacional sobre la Sordera y Otros Trastornos de la Comunicación (R21DC010806 a CAM y JCS y R01DC011285 a CAM).

Materials

Neurotrophin 4 Pepro Tech 450-04 200ng in 50μl
Alzet Osmotic Pump DURECT Corporation 2001D
30° endoscope Stoltz 61029D
50mm 30 gauge 100-μl syringe Hamilton 84850 and 201812
saline (sodium chloride solution) Sigma-Aldrich S8776
ketamine hydrochloride Henry Schein 56344
xylazine hydrochloride Henry Schein 33198
25 G 5/8 needle Becton-Dickinson 305901
1 ml syringe Becton-Dickinson 309659
ophthalmic ointment Henry Schein 8897
clippers Oster 44-018
ethanol Decon 2716
iodine (Betadine) Purdue Pharma L.P. 606404
heating pad Sunbeam 731-5
5-0 nylon suture thread AD Surgical PMN-518R6
crile hemostat Fine Science Tools 13005-14
delicate suture tying forceps Fine Science Tools 11063-07
meloxicam Henry Schein 49756
carprofen Merritt Veterinary Supplies 148700
antibiotic ointment Henry Schein 57110
acepromizine Aceproject Henry Schein 3845
isoflurane Isothesia Henry Schein 50033
induction box (anesthetizing box) Harvard Apparatus 50-0116
oxygen compressed tank Scott Gross UN1072
plexiglas platform Small Parts Inc (Amazon)
rubber tipped forceps Fine science tools rubber 11075-00
liquid rubber for forceps above Lowe's 42518
plastic spectula (BD syringe cut to length) Becton-Dickinson 309659
halogen light source rhino-laryngeal stroboscope Kay-Pentax RLS 9100 B
video recorder Kay-Pentax
sucrose Sigma-Aldrich S0389-500G
phosphate buffered saline Sigma-Aldrich P4417-100TAB
cryostat Mictotom HM525 Thermo Scientific HM 525
Gill 1 hematoxylin VWR 10143-142
Shandon eosin-Y alcoholic Thermo Fisher Scientific 6766007
anti-sodium channel Nav1.5 antibody produced in rabbit Sigma-Aldrich S0819
Texas red-X phalloidin Sigma-Aldrich T7471
alpha- bungarotoxin alexa fluor 488 conjugate Thermo Fisher Scientific B-13422
Small animal anaesthesia machine Smiths Medical CDS 9000

References

  1. Trupe, E. H., et al. Correlates and consequences of eating dependency in institutionalized elderly. J. Am. Geriatrics Society. 34 (3), 192-198 (1986).
  2. Ward, P. H., Colton, R., McConnell, F., Malmgren, L., Kashima, H., Woodson, G. Aging of the voice and swallowing. Otolaryngol. Head Neck Surg. 100 (4), 283-286 (1989).
  3. Gay, E. G., Kronenfeld, J. J., Dettmann, F. G. A comparison on the effect of regulation on health care for the older American: a tale of two states. Gerontologist. 34 (6), 787-796 (1994).
  4. Hagen, P., Lyons, G. D., Nuss, D. W. Dysphonia in the elderly:diagnosis and management of age-related voice changes. South. Med. J. 89 (2), 204-207 (1996).
  5. Broniatowski, M., et al. Current evaluation and treatment of patients with swallowing disorders. Otolaryngol. Head Neck Surgery. 120 (4), 464-473 (1999).
  6. Lundy, D. S., et al. Aspiration: cause and implications. Otolaryngol. Head Neck Surg. 120 (4), 474-478 (1999).
  7. Schindler, J. S., Kelly, J. H. Swallowing disorders in the elderly. Laryngoscope. 112 (4), 589-602 (2002).
  8. Gambino, D. R., Malmgren, L. T., Gacek, R. R. Age-related changes in the neuromuscular junctions in the human posterior cricoarytenoid muscles: a quantitative study. Laryngoscope. 100 (3), 262-268 (1990).
  9. Sinard, R. J. The aging voice: how to differentiate disease from normal changes. Geriatrics. 53 (7), 76-79 (1998).
  10. Baker, K. K., Olson-Raming, L., Sapir, S., Luschei, E. S., Smith, M. E. Control of vocal loudness in young and old adults. J. Speech Lang. Hear Res. 44 (2), 297-305 (2001).
  11. McMullen, C. A., Andrade, F. H. Functional and morphological evidence of age-related denervation in rat laryngeal muscles. J. Gerontol. A. Biol. Sci. Med. Sci. 64 (4), 435-442 (2009).
  12. Lai, K., Ip, N. Y. Postsynaptic signaling of new players at the neuromuscular junction. J. Neurocytol. 32 (5-8), 727-741 (2003).
  13. Huang, E. J., Reichardt, L. F. Neurotrophins: roles in neuronal development and function. Annu. Rev. Neurosci. 24 (1), 677-736 (2012).
  14. Gonzalez, M., et al. Disruption of Trkb mediated signaling induces disassembly of postsynaptic receptor clusters at neuromuscular junctions. Neuron. 24 (3), 567-583 (1999).
  15. Hirano, S., Kishimoto, Y., Suehiro, A., Kanemaru, S., Ito, J. Regeneration of aged vocal folds: first human case treated with fibroblast growth factor. Laryngoscope. 118 (12), 2254-2259 (2008).
  16. Branski, R. C., et al. Effects of transforming growth factor-beta 1 on human vocal fold fibroblasts. Ann. Oto. Rhinol. Laryngol. 118 (3), 218-226 (2009).
  17. Kishimoto, Y., et al. Effects of exogenous hepatocyte growth factor on vocal fold fibroblasts. Ann. Otol. Rhinol. Laryngol. 118 (8), 606-611 (2009).
  18. Belluardo, N., et al. Neuromuscular junction disassembly and muscle fatigue in mice lacking neurotrophin-4. Mol. Cell. Neurosci. 18 (1), 56-57 (2001).
  19. Johnson, A. M., Ciucci, M. R., Connor, N. P. Vocal training mitigates age-related changes within the vocal mechanisms in the old rat. J. Gerontol. A Biol. Sci. Med. Sci. 68 (12), 1458-1468 (2013).
  20. Roscow, D. E., Parikh, P., Vivero, R. J., Casiano, R. R., Lundy, D. S. Considerations for initial dosing of botulinum toxin in treatment of adductor spasmodic dysphonia. Oto. HeadNeck Surg. 148 (6), 1003-1006 (2013).
  21. Benninger, M. S., Hanick, A., Hicks, D. M. Cricothyroid muscle botulinum toxin injection to improve airway for bilateral recurrent laryngeal nerve paralysis, A case series. J. Voice. 30 (1), 96-99 (2016).
  22. Coppoolse, J. M. S., et al. An in vivo study of composite microgels based on hyaluronic acid and gelatin for the reconstruction of surgically injured rat vocal folds. J. Speech Lang Hear Res. 57 (2), S658-S673 (2014).
  23. Hertegård, S., et al. Cross-linked hyaluronan used as augmentation substance for treatment of glottal insufficiency: Safety aspects and vocal fold function. Laryngoscope. 112 (12), 2211-2219 (2002).
  24. Walker, W. F., Homberger, D. G. . Anatomy and dissection of the rat. , (1997).
  25. Ohno, T., Hirano, S., Rousseau, B. Age-associated changes in the expression and deposition of vocal fold collagen and hyaluronan. Ann. Oto. Rhinol. Laryngol. 25 (1), 192-197 (2009).
  26. Stemple, J. C., et al. Enhancement of aging rat laryngeal muscles with endogenous growth factor treatment. Physiol. Rep. 4 (10), e12798 (2016).
  27. McMullen, C. A., Andrade, F. H. Contractile dysfunction and altered metabolic profile of the aging rat thyroarytenoid muscle. J. Appl. Phys. 100 (2), 602-608 (2006).
  28. Engle, W. K., Cunningham, G. C. Rapid examination of muscle tissue. An improved trichrome method for fresh-frozen biopsy section. Neurology. (13), 919-923 (1963).
  29. Sheehan, D. C., Hrapchack, B. B. Theory and practice of histotechnology. Battelle. , (1980).
  30. Kulakowski, S. A., Parker, S. D., Personius, K. E. Reduced TrkB expression results in precocious age-like changes in neuromuscular structure, neurotransmission, and muscle function. J. Appl. Phys. 111 (3), 844-852 (2011).
  31. Nishida, N., et al. Age-related change in rat intrinsic laryngeal muscles: analysis of muscle fibers, muscle fiber proteins and subneural apparatuses. Eur Arch Otorhinolaryngol. 270 (3), 975-984 (2013).

Play Video

Cite This Article
Andreatta, R. D., Stemple, J. C., Seward, T. S., McMullen, C. A. Subcutaneous Neurotrophin 4 Infusion Using Osmotic Pumps or Direct Muscular Injection Enhances Aging Rat Laryngeal Muscles. J. Vis. Exp. (124), e55837, doi:10.3791/55837 (2017).

View Video