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Engineering

असममित-पहचान द्वारा माइक्रोफ़्लुइड इमेजिंग फ्लो साइटोमेट्री समय-विस्तार ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी (एटीओएम)

Published: June 28, 2017 doi: 10.3791/55840
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, 1, 1, 2, 1, 1
1Department of Electrical and Electronic Engineering, The University of Hong Kong, 2Department of Mechanical Engineering, The University of Hong Kong

Summary

इस प्रोटोकॉल में अल्ट्राफाइड माइक्रोफ्लिडिक प्रवाह में एक सेल इमेजिंग के लिए एक असममित-पहचान समय-खंड ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी सिस्टम के कार्यान्वयन और इमेजिंग फ्लो साइटोमेट्री में उसके अनुप्रयोगों का वर्णन है।

Abstract

मापणीय मापदंडों की संख्या को स्केलिंग, जो बहुआयामी डेटा विश्लेषण और इस प्रकार उच्च-आत्मविश्वास सांख्यिकीय परिणामों की अनुमति देता है, प्रवाह साइटोमेट्री के उन्नत विकास में मुख्य प्रवृत्ति रही है। विशेषकर, उच्च-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग क्षमताओं को जोड़ने से सेलुलर / सब-सेलुलर संरचनाओं के जटिल आकारिकी विश्लेषण की अनुमति मिलती है। यह मानक प्रवाह के साथ संभव नहीं है cytometers। हालांकि, यह सेलुलर फ़ंक्शंस के हमारे ज्ञान को आगे बढ़ाने के लिए महत्वपूर्ण है और जीवन विज्ञान अनुसंधान, नैदानिक ​​निदान, और पर्यावरण निगरानी को लाभान्वित कर सकता है। फ्लो साइटमैट्री में इमेजिंग क्षमताओं को शामिल करने से परख प्रवाह को समझौता होता है, मुख्य रूप से कैमरे प्रौद्योगिकियों में गति और संवेदनशीलता की सीमाओं के कारण। छवि की गुणवत्ता को संरक्षित करते समय इमेजिंग प्रवाह cytometry का सामना करने वाली इस स्पीड या थ्रूपुट चैलेंज पर काबू पाने के लिए, असममित-पता लगाने के समय-विस्तार ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी (एटीओएम) को उच्च-विपरीत, एक-सेल इमेज को सक्षम करने के लिए दिखाया गया हैउप-सेलुलर संकल्प के साथ, एक इमेजिंग थ्रूपुट पर 100,000 से अधिक कोशिकाओं / एस के रूप में पारंपरिक समय-खंड इमेजिंग की इमेजिंग अवधारणा के आधार पर, जो अल्ट्राफाइड ब्रॉडबैंड लेजर दालों के इस्तेमाल से ऑल ऑप्टिकल इमेज एन्कोडिंग और पुनर्प्राप्ति पर निर्भर करता है, एटीओएम अनब्लेलैड / अस्थिर कोशिकाओं की छवि कंट्रास्ट को बढ़ाकर अग्रिम इमेजिंग प्रदर्शन को बढ़ाता है। कोशिकाओं की चरण-ढालगत जानकारी तक पहुंचने से यह हासिल किया जा सकता है, जिसे एक शॉट ब्रॉडबैंड दालों में दिखाया गया है। इसलिए, एटॉम एकल-सेल आकारिकी और बनावट के उच्च-थ्रुपुट माप में विशेष रूप से फायदेमंद है - सेल प्रकार, राज्यों, और यहां तक ​​कि फ़ंक्शन के सूचना संकेतक। अंततः, यह कोशिकाओं के बायोफिजिकल फेनोटाइपिंग के लिए एक शक्तिशाली इमेजिंग प्रवाह cytometry प्लेटफ़ॉर्म बन सकता है, जो कि वर्तमान राज्य के अत्याधुनिक जैव-रासायनिक-मार्कर-आधारित सेलुलर परख का समर्थन करता है। यह काम एक प्रोटोकॉल का वर्णन करता है जो एटीओएम प्रणाली के मुख्य मॉड्यूल स्थापित करता है (ऑप्टिकल फ्रंटएंड से डेटा पी मेंRocessing और विज़ुअलाइज़ेशन बैकएंड), साथ ही एटम पर आधारित इमेजिंग प्रवाह cytometry के कार्यप्रवाह, उदाहरण के तौर पर मानव कोशिकाओं और सूक्ष्म-शैवाल का उपयोग करते हुए।

Introduction

ऑप्टिकल इमेजिंग एक शक्तिशाली उपकरण और सेल-आधारित परख प्रस्तुत करता है (लगभग) गैर-इनवेसिव से कई सेलुलर / सबसुलुलर घटकों के विस्तृत स्थानिक वितरण की कल्पना करता है, इस प्रकार सेल की कोशिकीय, बायोफिजिकल, और बायोमोलिकुलल हस्ताक्षरों को उजागर किया जाता है। हालांकि, एकल कोशिकाओं से उच्च-सामग्री की जानकारी निकालने की इस क्षमता को आम तौर पर समझौता किया गया है जब कोशिकाओं की एक विशाल और विषम जनसंख्या की जांच होनी होती है। यह मापन थ्रूपुट और कंटेंट के बीच सेल-आधारित एशेज में एक आम ट्रेड-ऑफ का प्रतीक है। एक उल्लेखनीय उदाहरण यह है कि cytometry प्रवाह करने के लिए इमेजिंग क्षमता जोड़ने से शास्त्रीय गैर-इमेजिंग प्रवाह साइतोमीटर की तुलना में कम से कम 1-2 आदेशों के द्वारा थ्रूपूट की डाउन-स्केलिंग हुई है। यद्यपि यह जटिल रूपात्मक एकल-कोशिका विश्लेषण की पेशकश कर सकता है जो मानक प्रवाह साइटोमीटर 1 के साथ संभव नहीं है, इमेजिंग प्रवाह cytometry आमतौर पर आईडी के लिए पर्याप्त थ्रूपुट का अभाव हैउच्च सांख्यिकीय आत्मविश्वास के साथ सेलुलर विविधता प्रदान करें यह जीव विज्ञान में नई खोजों और रोगों के रोगजनन को समझने के लिए आवश्यक है। सामान्य ऑप्टिकल इमेजिंग रणनीतियों द्वारा लगायी गई गतिमान गति सीमा में प्रमुख तकनीकी चुनौती है: लेजर बीम स्कैनिंग, ( जैसे, गैल्वेमेट्रिक दर्पण द्वारा) और / या छवि सेंसर ( जैसे, चार्ज-युग्मित डिवाइस (सीसीडी) और पूरक धातु- ऑक्साइड अर्धचालक (CMOS)) लेजर स्कैनिंग गति को स्कैनिंग दर्पण के मैकेनिकल जड़ता द्वारा आंतरिक रूप से प्रतिबंधित किया जाता है, जबकि सीसीडी या सीएमओएस का फ्रेम रेट इमेजिंग स्पीड और संवेदनशीलता के बीच मौलिक व्यापार से सीमित है ( यानी, फ़्रेम दर में वृद्धि से कम सिग्नल डिटेक्शन संवेदनशीलता , और इसके विपरीत)।

ऑल-ऑप्टिकल, अल्ट्राफाइड इमेज-एन्कोडिंग तंत्र के आधार पर, ऑप्टिकल टाइम-स्ट्रेच इमेजिंग को उच्च-थ्रूपुट इमेजिंग फ्लो साइट के लिए एक आकर्षक मंच के रूप में दिखाया गया हैओमेटर, पारंपरिक छवि सेंसर या यांत्रिक लेजर स्कैनिंग की आवश्यकता के बिना 2 , 3 । समय खिंचाव इमेजिंग के कार्य सिद्धांत के विस्तृत विवरण 4 , 5 , 6 , 7 के संदर्भ में मिल सकते हैं। संक्षेप में, इसमें दो विनिमेय मैपिंग चरण होते हैं: (i) वर्णक्रमीय एन्कोडिंग (तरंगदैर्ध्य-अंतरिक्ष मानचित्रण), जिसमें इमेजेड नमूनों के स्थानिक निर्देशांक प्रकाश-स्पंदित बीम 8 , 9 के स्पेक्ट्रम में अलग-अलग तरंग दैर्ध्य के लिए मैप किए जाते हैं, और (ii) डिस्पेरिव फूरियर ट्रांसफ़ॉर्मेशन (वेवलेंथ टाइम मैपिंग) 9 , जिसमें व्यक्तिगत लेजर दालों के तरंग दैर्ध्य घटकों को समूह वैल्यू फैलाव (जीवीडी) के माध्यम से अस्थायी (तरंगदैर्ध्य-भरी) तरंगों ( चित्रा 1 ) में बदल दिया जाता है। एक महत्वपूर्णसमय-खिंचाव इमेजिंग की सुविधा ऑप्टिकल प्रवर्धन है, जो अल्ट्राफाइट फोटोडेटेशन और जीवीडी हानि के कारण संवेदनशीलता के नुकसान को सम्मिलित करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है, इस प्रकार तस्वीर संकेतक शोर 9 द्वारा प्रदूषित किए बिना छवि संकेत-टू-शोर अनुपात (एसएनआर) को बढ़ाता है। । चूंकि प्रत्येक लेजर पल्स ने इमेजेड नमूनों की एक रेखा-स्कैन को एनकोड किया है, जो कोशिकाओं के यूनिडायरेक्शनल फ्लो के ऑर्थोगोनल है, एक प्रभावी लाइन स्कैन दर लेजर पुनरावृत्ति दर से निर्धारित होती है, जो आमतौर पर 10 मेगाहर्ट्ज से अधिक है। यह अल्ट्राफास्ट ऑपरेशन ब्लर-फ्री, एकल-सेल छवि कैप्चर को 10,000-100,000 कोशिकाओं / यानी ( जैसे, पारंपरिक इमेजिंग प्रवाह cytometry की तुलना में 10-100 गुना अधिक) के एक थ्रूपुट पर सक्षम बनाता है। नतीजतन, समय-विस्तार इमेजिंग उच्च-थ्रुपुट, सिंगल-सेल, इमेज-आधारित स्क्रीनिंग में अद्वितीय अनुप्रयोगों को प्राप्त कर सकता है, खासकर जब अज्ञात विविधता की पहचान की आवश्यकता होती है या बड़े पैमाने पर जनसंख्या (हजारों से लाखों सेल एलएस), जैसे दुर्लभ कैंसर सेल स्क्रीनिंग 10 या माइक्रो-शैवाल वर्गीकरण 11

टाइम-स्टैंच इमेजिंग मुख्य रूप से उज्ज्वल क्षेत्र (बीएफ) छवि कैप्चर पर निर्भर करती है, जिसमें से 2 , 3 , 9 , 10 , 11 की कोशिकाओं से छवि अंतर को प्रकाश बिखरने और अवशोषण से उत्पन्न किया जाता है। इस तरह के लेबल मुक्त, एकल-कोशिका इमेजिंग क्षमताओं, फ्लोरोसेंट लेबल्स, जैसे कि साइटोटोक्सिसिटी और फोटोबलीचिंग से जुड़े हानिकारक प्रभावों को बाईपास कर सकती हैं, और फिर सेलुलर और सब-सेलुलर बनावट और आकृति विज्ञान के आधार पर सिंगल-सेल विश्लेषण के लिए बहुमूल्य जानकारी प्रदान करती हैं। इन लेबल मुक्त पैरामीटर कोशिकाओं के गहरे चित्र वर्गीकरण के लिए प्रभावी साबित होते हैं, खासकर जब एक विशाल सेल आबादी 11 उपलब्ध है ,"Xref"> 12 हालांकि, कई अवसरों में, बीएफ इमेजिंग लेबल मुक्त पारदर्शी कोशिकाओं के विस्तृत आकारिकी को प्रकट करने के लिए पर्याप्त अंतर प्रदान करने में विफल रहता है। अल्ट्राफास्ट फ्रेम दर 13 , 14 , 15 में इमेजिंग कॉन्ट्रास्ट बढ़ाने के लिए अलग-अलग लेबल मुक्त, चरण-विपरीत, समय-विस्तार इमेजिंग विधियों को विकसित किया गया है। इन तकनीकों में, श्लेयरेन फोटोग्राफी के समान अवधारणा के आधार पर चरण-ग्रेडिएंट (अंतर-हस्तक्षेप-विपरीत- (डीआईसी) के विपरीत) उजागर करने के लिए असममित-पता लगाने का समय-विस्तार ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी (एटीओएम) विकसित किया गया था, जिससे लेबल- एक ultrahigh microfluidic गति (ऊपर 10 मीटर / एस) पर एकल कोशिकाओं के मुक्त, उच्च विपरीत इमेजिंग 16 इस प्रभाव को आंशिक रूप से छवि-एन्कोडेड बीम पथ को अवरुद्ध या फोटोडेटेक्शन से पहले किरण को झुकाव करके तिरछा पहचान या रोशनी के माध्यम से उत्पन्न किया जा सकता है। एटॉम का एक अन्य लाभ इसकी एक हैएक साथ साथ दो चरण-ग्रेडिएंट विपरीत दिशाओं के साथ विरोधाभास करने की क्षमता। तीव्रता घटाव और दो विपरीत-विपरीत छवियों का सारांश समान चरण-स्कैन से, क्रमशः अंतर-चरण-ढाल के विपरीत और अवशोषण कंट्रास्ट उत्पन्न करता है। यह काम ऑप्टिकल सेटअप, नमूना तैयार करने, और डेटा अधिग्रहण और विज़ुअलाइजेशन की स्थापना सहित एटॉम के कार्यान्वयन का वर्णन करने वाले विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है। विशेष रूप से, यह काम मानव रक्त कोशिकाओं, कैंसर कोशिकाओं, और फ़ॉइट्लैंकटन (सूक्ष्मजीव) के सिंगल सेल इमेजिंग के साथ एटीओएम ऑपरेशन को दर्शाता है। यह एओटीएम की इजाजिंग फ्लो साइटोमेट्री के लिए बायोमेडिकल क्षेत्र में न केवल, बल्कि समुद्री और जैव ईंधन शोध 17 , 18 में एटॉम की प्रयोज्यता को उजागर करता है।

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Protocol

1. नमूना तैयार करना

  1. नमूना तैयार करना (सहायक कोशिकाओं; एमसीएफ -7 कोशिकाएं)
    1. इनक्यूबेटर से सेल कल्चर डिश निकालें और संस्कृति माध्यम को हटा दें।
    2. अत्यधिक संस्कृति माध्यम को हटाने के लिए 1x फॉस्फेट-बफरर खारा (पीबीएस) के साथ एक डिश पर कोशिकाओं को कुल्ला।
    3. संस्कृति डिश (100 मिमी का व्यास) में 0.25% ट्रिप्सिन के समाधान के 3 एमएल जोड़ें और इसे 4 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर में डाल दें।
      नोट: trypsin कोशिकाओं के चिपकने वाला प्रोटीन घुलनशील ताकि वे संस्कृति पकवान से अलग हो जाएंगे।
    4. देखने के लिए जांचें कि क्या सभी कोशिकाओं को एक प्रकाश सूक्ष्मदर्शी (10X उद्देश्य) का उपयोग करके संस्कृति पकवान से अलग किया गया है। यदि नहीं, तो धीरे से सेल संस्कृति डिश हिला।
    5. ट्रिप्सिन की कार्रवाई को रोकने के लिए मानक संस्कृति माध्यम के 4 एमएल (89% डल्बेकेडो के संशोधित ईगल मध्यम (डीएमईएम), 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) और 1% पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन (पीएस) के साथ तैयार किया गया है।
    6. टीपूरे मिश्रण (ट्रिप्सिन समाधान और संस्कृति माध्यमों में कोशिकाओं) को एक अपकेंद्रित्र ट्यूब और अपकेंद्रित्र में 5 मिनट के लिए 200 x ग्राम पर रांजिए।
    7. सभी तरल निकालें और 1 एमबीएल 1x पीबीएस (पीएच मान: 7.4, 37 डिग्री सेल्सियस से पहले गर्म) में कोशिकाओं को पुनः निलंबित करें।
  2. नमूना तैयार करना (सुसंस्कृत सूक्ष्म-शैवाल)
    1. सुव्यवस्थित सूक्ष्म-शैवाल और संस्कृति का माध्यम ( जैसे समुद्री जल, अगर, या ताजे पानी) को नए ग्लास संस्कृति ट्यूबों (~ 15 एमएल) को 1: 5 की मात्रा अनुपात (सूक्ष्म शैवाल से संस्कृति माध्यम) में स्थानांतरित करना एक नया उप-संस्कृति माध्यम
    2. प्रयोग से पहले 72 - 120 घंटे के लिए एक प्रकाश / अंधेरे (एलडी) चक्र (आमतौर पर एलडी 16: 8) के अनुसार फ्लोरोसेंट बल्ब से कृत्रिम प्रकाश द्वारा लगातार रोशनी के तहत कांच संस्कृति ट्यूबों में रखें।
    3. उप-सुसंस्कृत नमूनों को एक अपकेंद्रित्र ट्यूब में स्थानांतरित करें और अच्छी तरह से मिलाएं।

2. एटम सिस्टम सेटअप


चित्रा 1: एटीओएम प्रणाली के योजनाबद्ध एक ब्रॉडबैंड स्पंदित लेजर को अल्ट्राफास्ट दालों को ( ए ) एक समय-खंड मॉड्यूल और ( बी ) एक इन-लाइन ऑप्टिकल एम्पलीफायर मॉड्यूल प्रदान करने के लिए कार्यरत है। समय-खंड मॉड्यूल अस्थायी तरंगों की एक ट्रेन बनाता है, जिनमें से प्रत्येक लेजर स्रोत के तरंग दैर्ध्य स्पेक्ट्रम की प्रतिलिपि है ( यानी, तरंगदैर्ध्य-से-समय मानचित्रण)। एम्पलीफायर मॉड्यूल नाड़ी-खींच (फैलाने वाले) नुकसान मुआवजे के लिए प्रयोग किया जाता है। फैला हुआ पल्स तब होता है ( सी ) एक विवर्तन झंझरी द्वारा फैलाया जाता है, 1 डी स्पेक्ट्रल बौछार रोशनी बनाने में, जिसमें व्यक्तिगत तरंगदैर्ध्य घटकों को एक रिले लेंस जोड़ी द्वारा रिले किया जाता है और उद्देश्य लेंस द्वारा विभिन्न कोशिकाओं ( डी ) माइक्रोफ़्लुइडिक चिप यह वर्णक्रमीय-एन्कोडिंग की प्रक्रिया हैस्पेक्ट्रेटिक एन्कोडेड लाइट फिर से एक अन्य उद्देश्य लेंस और एक दर्पण के माध्यम से सेल को पारित करेगा, विवर्तन की झंझरी में लौटकर और रिक्तकलन को एक अनियंत्रित स्पंदित किरण के रूप में बदल देगा। यह छवि-एन्कोडेड स्पंदित बीम तब है ( ई ) दो मार्गों में विभाजित है, जैसे कि दोनों बीम आंशिक रूप से अवरुद्ध ( च ) चाकू के किनारे, लेकिन विपरीत दिशाओं से, तंतुओं में जुड़ा होने से पहले ये दो मुस्करे अंतिम छवि के दो विपरीत () विपरीत एन्कोडेड चरण-ग्रेडिएंट विरोधाभासी हैं। दोनों संकेतों के विरोधाभासों का एक साथ पता लगाने के लिए, संकेतों में से एक ( जी ) समय-विलंब रेखा से गुजरता है, जैसे कि दो सिग्नल समय में बहुभाषी (इंटरलेव्ज्ड) होते हैं। डेटा अधिग्रहण के लिए एक उच्च गति वाले फोटोडेटेक्टर और वास्तविक समय आस्टसीलस्कप का उपयोग किया जाता है। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

  1. टाइम सेंट रेटक मॉड्यूल
    1. करीब अवरक्त (एनआईआर) रेंज में 800-1,500 एनएम रेंज में अनुशंसित केंद्र तरंग दैर्ध्य के साथ एक ब्रॉडबैंड फिटोसेकंड (एफएस) या पीकोसेकंड (पीएस) स्पंदित लेजर स्रोत का काम करें।
      नोट: विशिष्ट आवश्यक पल्स चौड़ाई उप-100 एफएस से लेकर कुछ पीए तक हो सकती है। स्पंदित लेजर स्रोतों की विस्तृत आवश्यकताओं को संदर्भ 4 और 5 में देखा जा सकता है। महत्वपूर्ण मीट्रिक तालिका 1 में हाइलाइट किए गए हैं।
      1. सुनिश्चित करें कि लेजर स्रोत में उच्च पुनरावृत्ति दर है, जो मेगाहर्ट्ज़ शासन ( जैसे मेगाहर्ट्स के दसियों) में होनी चाहिए ताकि एटॉम में अल्ट्राफास्ट इमेजिंग सुनिश्चित हो सके। इसके अलावा, फाइबर गुहा की क्षति बिजली सीमा के नीचे चोटी उत्पादन लेजर पावर को ठीक से सेट करें, लगभग 1 किलोवाट।
      2. स्पंदित लेजर स्रोत के शॉट-टू-शॉट अस्थायी और स्पेक्ट्रल स्थिरता सुनिश्चित करें।
        नोट: स्पेक्ट्रल आयाम में उतार-चढ़ाव में विशिष्ट सहिष्णुता 1.2% 1 9 , 20 ,Ss = "xref"> 21, जैसा कि इस सेटअप में फाइबर मोड-लॉक लेजर द्वारा प्राप्त किया गया है।
        नोट: लेजर स्रोत की ऑप्टिकल बैंडविड्थ 10-100 एनएम होने की उम्मीद है, जो एकल-सेल इमेजिंग 21 में पर्याप्त इमेजिंग फिल्ड ऑफ व्यू (एफओवी) की गारंटी के लिए आवश्यक है।
    2. एक फाइबर कोलीमीटर के माध्यम से, दांत लेजर स्पंदित बीम को एकल-मोड डिस्पेरिव ऑप्टिकल फाइबर में, जिसमें दालों को समूह वेग डिस्पैशन (जीवीडी) ( चित्रा 1 ए ) के माध्यम से बढ़ाया जाता है।
      नोट: यह प्रक्रिया है जिसके बाद प्रत्येक पल्स के स्पेक्ट्रम को तरंगदैर्ध्य-तरंग वाले तरंग ( यानी, तरंगदैर्ध्य-से-समय मानचित्रण) के रूप में समय पर मैप किया जाता है।
      नोट: कुल आवश्यक जीवीडी यह सुनिश्चित करने के लिए पर्याप्त होना चाहिए कि समग्र एटॉम छवि संकल्प तरंग-टू-टाइम मैपिंग प्रक्रिया से प्रभावित नहीं है (चर्चा देखें)। आमतौर पर, एनआईआर श्रेणी में, जीवीडी 0.1 एनएस / एनएम से अधिक होनी चाहिए। उदाहरण के लिए, थाई में नियोजित एक एकल मोड फाइबरवर्तमान सेटअप में 1,060 एनएम (कुल फाइबर 10 किमी की लंबाई) के तरंग दैर्ध्य के आसपास 0.38 एनएस / एनएम के कुल जीवीडी प्रदान करता है।
  2. स्पेक्ट्रल-एन्कोडिंग मॉड्यूल
    1. चित्रा 1 में सचित्र के रूप में, microfluidic चैनल के साथ बहने वाले कोशिकाओं के spectrally इनकोडिंग इमेजिंग प्रदर्शन करने के लिए एक ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप प्रणाली का निर्माण।
      नोट: इस ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप के मुख्य घटक में शामिल हैं: (1) एक विवर्तन झंकार, एक दूरबीन रिले-लेंस मॉड्यूल ( चित्रा 1 में आरएल 1 और आरएल 2 ), और दो उद्देश्य लेंस ( चित्रा 1 में Obj1 और Obj2)
      1. सबसे पहले, वर्णक्रमीय बौछार ( चित्रा 1 सी ) उत्पन्न करने के लिए विवर्तन झंझरी (ट्रांसमिशन-प्रकार झंझरी इस सेटअप में नियोजित किया जाता है) पर समय-बढ़ाया और संगोषित बीम को रोशन करें।
        नोट: diffracted बीम की शक्ति ( यानी, विवर्तन दक्षता) समायोजन द्वारा अधिकतम किया जा सकता हैवह झंझरी अभिविन्यास Littrow विन्यास को बंद कर दिया।
      2. एक 4-एफ इमेजिंग सिस्टम में दो रिले लेंस (आरएल 1 और आरएल 2) को कॉन्फ़िगर करें ( यानी, फोकल लम्बाई के योग के बराबर दूरी से आरएल 1 के फोकल प्लेन पर विवर्तन झंकार और पृथक आरएल 1 और आरएल 2 को रखें। फिर उद्देश्य लेंस Obj1 के पीछे फोकल हवाई जहाज़ पर इमेज किया जाएगा)।
      3. Obj1 के पीछे के छिद्र को भरने के लिए वर्णक्रमीय बौछार को सावधानी से संरेखित करें, जैसे वर्णक्रमीय बौछार का अनुमान लगाया जा सकता है और माइक्रोस्कोप के चित्र विमान पर केंद्रित हो सकता है।
        नोट: यहां, उद्देश्य लेंस का एनए ( चित्रा 1 में Obj1) 0.75 है।
      4. इस उद्देश्य के लेंस (ओबजे 2 ) के पीछे की छिद्र पर एक समान एनए और एक दर्पण दर्पण के साथ एक अन्य उद्देश्य लेंस ( चित्रा 1 में Obj2) रखें, इस तरह कि वर्णक्रमीय बौछार किरण को छवि विमान को डबल-पास करने और वापस लौटने के लिए गठबंधन किया जा सकता है डिफ़्रैक्शन ग्रेटिंग।
      5. समायोजित करेंउद्देश्य लेंस की जोड़ी (Obj1 और Obj2) जैसे कि उनके फोकल विमान एक दूसरे के साथ ओवरलैप करते हैं देखने के लिए जांचें कि क्या वर्णक्रमीय बौछार एक ही स्थान पर छवि विमान को दोगुना पड़ता है और उसी रास्ते के नीचे झंझरी पर लौटता है। यदि नहीं, तो ऑप्टिकल सिस्टम के आगे संरेखण और ट्यूनिंग करें।
        नोट: लौटे हुए प्रकाश को एक अतिरिक्त किरण-फाड़नेवाला के माध्यम से जाना चाहिए, जैसे प्रकाश असममित पहचान मॉड्यूल में प्रेषित किया जा सकता है।
      6. एक उपयुक्त स्तर पर ऑप्टिकल एम्पलीफायर लाभ को समायोजित करें, जैसे परिणामस्वरूप संकेत को एक अच्छा एसएनआर के साथ फोटोडेटेक्टर द्वारा पता लगाया जा सकता है, जो आमतौर पर> 10 डीबी है।
      7. नमूना प्लेटफॉर्म पर माइक्रोफ्लुइडिक चिप की स्थिति को समायोजित करें और समायोजित करें और सुनिश्चित करें कि वर्णक्रमीय बौछार, और इस तरह इमेजिंग क्षेत्र, माइक्रोफ्लुइडिक चैनल ( चित्रा 1 डी ) में रखा गया है।
        नोट: मील के भीतर तरल पदार्थों के प्रवाह की दिशा में वर्णक्रमीय बौछार orthogonally प्रकाशित होता हैआईसीआरओफ़्लुइडिक चिप, जैसे कि बहने वाला गति स्वतः दो-आयामी (2 डी) स्कैन करता है
  3. असममित पहचान मॉड्यूल
    1. इमेजड-एन्कोडेड बीम को दो में अलग करने के लिए एक अतिरिक्त बीम-स्प्लिटर रखें ( चित्रा 1 ए )।
      नोट: प्रत्येक बीम प्रतिकृति आंशिक रूप से एक चाकू किनारे से अवरुद्ध है।
    2. बीम ब्लॉक से पहले किरण की ऑप्टिकल शक्ति को मापें और रिकॉर्ड करें फिर, मैन्युअल रूप से चाकू किनारों की स्थिति (एक रेखीय अनुवाद मंच पर घुड़सवार) जैसे कि वे मोटे तौर पर बीम के आधा (दृश्य निरीक्षण द्वारा) को ब्लॉक करते हैं इसके बाद, बीम की शक्ति को मॉनिटर करने के लिए ऑप्टिकल पावर मीटर का उपयोग करें, जबकि किरण भर में अनुवाद करके चाकू किनारों की स्थिति को ठीक करना।
      नोट: यह सुझाव दिया जाता है कि इष्टतम स्थिति यह है कि जहां मूल मूल्य का ~ 50% शक्ति कम हो गई है ( यानी, अबाधित मामला)। यह ऐसी स्थिति है जो छवि संकेत का सबसे अच्छा संयोजन प्रदान करती हैशक्ति और छवि विपरीत वृद्धि
    3. दूसरे बीम प्रतिकृति के लिए कदम 2.3.2 दोहराएं। ध्यान दें कि एक बीम के लिए आंशिक बीम ब्लॉक की ओरिएंटेशन दूसरे किरण ( चित्रा 1f ) के संबंध में विपरीत होनी चाहिए।
    4. कुछ दो आंशिक रूप से अवरुद्ध मुस्कराते हुए, दो-फाइबर कोलीमिटर्स के माध्यम से दो अलग-अलग, एकल-मोड फाइबर हथियारों में।
      नोट: अन्य प्रतिकृति (विलंब-रेखा के बिना) ( चित्रा 1 जी ) के संबंध में समय-विलंब पेश करने के लिए हथियारों में से एक, एक फाइबर आधारित देरी-रेखा के रूप में सेवा करने वाली फाइबर की एक अतिरिक्त लंबाई है। दोनों photodetection से पहले एक फाइबर युग्मक द्वारा एकल फाइबर को निर्देशित कर रहे हैं। समय-देरी को लंबे समय तक पर्याप्त रूप से दो प्रतिकृतियां अलग करना चाहिए और अगले तरंग के साथ अस्थायी ओवरलैप से बचने के लिए पर्याप्त रूप से अलग होना चाहिए ( यानी, दो प्रतिकृतियां हमेशा पता लगाने से पहले एकल फाइबर में टाइम-इंटरलेव और समय-मल्टिप्लेक्स होता है ( चित्रा 2 ए ))।
    5. टोपीवास्तविक समय आस्टसीलस्कप के साथ पता लगाए गए ऑप्टिकल संकेतों को सटीक और डिजीटल करें ध्यान दें कि बैंडविड्थ और इस प्रकार आस्टसीलस्कप का नमूना दर पर्याप्त रूप से उच्च होना चाहिए ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि वे अंतिम छवि संकल्प को प्रभावित नहीं करते (चर्चा देखें)।
      नोट: यहां, 0.38 एनएस / एनएम, एक बैकेंड अधिग्रहण बैंडविड्थ और> 20 गीगाहर्ट्ज़ और> 40 जीएसए / एस के नमूने दर के जीवीडी के साथ क्रमशः आवश्यक हैं।

3. प्रायोगिक प्रक्रियाएं

  1. नमूना लोड हो रहा है
    1. मानक हेमोसाइटोमीटर में पारंपरिक चरण के विपरीत माइक्रोस्कोप के तहत सेल की गणना करना।
    2. 1x पीबीएस (सूक्ष्म शैवाल के लिए वसंत के पानी के साथ) को पतला करके सेल घनत्व को समायोजित करें और विंदुक के साथ अच्छी तरह मिलाएं।
      नोट: सुझाई गई एकाग्रता 10 5 से 10 6 कोशिकाओं / एमएल से है।
    3. ऑप्टिकल इमेजिंग सिस्टम के नमूना प्लेटफॉर्म पर माइक्रोफ्लुइडिक चिप को माउंट करें।
      नोट: microfluidicचिप मुख्य रूप से पॉलीडिमैथाइलसिलोनैन (PDMS) से बना है और मानक प्रतिकृति मोल्डिंग विधि का उपयोग करके निर्मित है। माइक्रॉफ़्लिडिक चैनल एक असिमट्रिक घुमावदार चैनल के साथ डिज़ाइन किया गया है ताकि इनरियल फ्लो फोकसिंग इफेक्ट उत्पन्न किया जा सके, इस तरह से इमेजिंग सेक्शन में कोशिकाओं को एकल फाइल में (80 माइक्रोग्राम x 80 माइक्रोग्राम (ऊंचाई x चौड़ाई) के आयाम के साथ उच्च गति पर प्रवाहित किया जा सकता है ।
    4. घनत्व-समायोजित सेल समाधान को 10 एमएल सिरिंज में स्थानांतरित करें।
    5. सिरिंज से माइक्रोफ्लुइडिक चिप और एक केन्द्रापसारक ट्यूब के प्रवेश के लिए कनेक्ट करें, जो निपटान संग्रह के लिए माइक्रोफ्लूइडिक चिप के आउटलेट में है।
    6. एक सिरिंज पंप पर सिरिंज को माउंट करें और वांछनीय थ्रूपूट देने के लिए उपयुक्त प्रवाह दर निर्धारित करें और कोशिकाओं और चैनल के बीच अत्यधिक कतरनी बल लगाने से बचें।
      नोट: नमूनों की रैखिक गति 0.5 और 10 मीटर के बीच होनी चाहिए नोट करें कि वास्तविक छवि रिकॉर्डिंग से पहले, अधिकतम करने के मामले में, सिस्टम को और अधिक बेहतर बनाने के लिए अक्सर यह आवश्यक होता हैइमेज सिग्नल की ताकत और दोहराए हुए चरणों 2.2.1.4-2.2.1.6 द्वारा ध्यान केंद्रित छवि का अनुकूलन।

4. डेटा अधिग्रहण

  1. प्रत्येक प्रयोग के लिए सहेजने के लिए डेटा अंक की एक उपयुक्त संख्या निर्धारित करें सहेजने के लिए डेटा अंक की संख्या नमूने के आकार और प्रवाह दर पर निर्भर करती है।
    नोट: आमतौर पर, यह 80 जीएसए / एस की नमूना दर के तहत 8-16 मिलियन नमूना अंक पर सेट है
  2. आस्टसीलस्कप का उपयोग करके बैच मोड में डेटा प्राप्त करें और सहेजें।

5. बैकएंड प्रोसेसिंग

चित्र 2
चित्रा 2: रेखा-स्कैन टाइम ट्रेस से एटॉम छवियों का पुनर्निर्माण अवशोषण कंट्रास्ट और विभेदक (एन्हांस्ड) चरण-ग्रेडिएंट कंट्रास्ट के साथ एटीओएम छवियों के पुनर्निर्माण के लिए, समय-विस्तारित दालों के दो सेट (बैंगनी और हरी दालों को देखें) से निकाले जाते हैं( ए ) समय-मल्टिप्लेक्स्ड अस्थायी तरंग ट्रेस और तब डिजिटल रूप से विभाजित किया जाता है और (2) दो विपरीत चरण-ग्रेडिएंट विरोधाभासों को प्रदर्शित करने वाली 2 डी छवियों के रूप में खड़ी होती है। ध्यान दें कि लेजर पुनरावृत्ति दर आकलन में गोल-बंद त्रुटि के कारण उप-सूचकांक बदलाव के लिए क्षतिपूर्ति करके ( सी ) विरूपण मुक्त चित्र बनाने के लिए एक कतरनी कार्रवाई की आवश्यकता है लेजर स्रोत की वर्णक्रमीय तीव्रता लिफाफे से ( डी ) कच्चे लाइन-स्कैन को घटाकर, छवियों की पृष्ठभूमि को हटाया जा सकता है। ( जी ) एक अवशोषण विपरीत छवि छवियों ( ई ) और ( एफ ) की एक पिक्सेल-बाय-पिक्सेल तीव्रता सार द्वारा प्राप्त की जा सकती है, जबकि ( एच ) एक अंतर चरण-ग्रेडिएंट विपरीत छवि छवियों के घटाव से प्राप्त की जा सकती है (ई) ) और (एफ)। कृपया एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करेंइस आंकड़े का

  1. आस्टसीलस्कप से ऑफ़लाइन छवि पुनर्निर्माण के लिए कंप्यूटर पर डेटा स्थानांतरण।
    नोट: यहां, डेटा को पोर्टेबल हार्ड डिस्क में संग्रहीत किया जाता है और आस्टसीलस्कप और प्रसंस्करण कंप्यूटर के बीच मैन्युअल रूप से स्थानांतरित किया जाता है। प्रत्येक प्रयोग के लिए हार्ड डिस्क की क्षमता 500 जीबी से अधिक होनी चाहिए।
    1. 2 डी छवि ( चित्रा 2 ) बनाने के लिए लाइन-स्कैन को डिजिटल रूप से स्टैक करने के लिए प्रमुख छवि पुनर्निर्माण के रूटिन का उपयोग करें।
      नोट: कस्टम प्रोग्राम (MATLAB) में दो समय-मल्टिप्लेक्स डेटा सेट ( चित्रा 2 में बैंगनी और हरे रंग के तरंगों) को अलग करके दो असममित पहचान छवियां पैदा करता है।
      1. दो असममित पहचान छवियों की तीव्रता को घटाकर एक विभेदक चरण-ग्रेडिएंट विपरीत छवि प्राप्त करें; एक अवशोषण विपरीत छवि दो असममित पहचान छवियों को जोड़कर प्राप्त की जा सकती है। एमसीएफ -7 और सूक्ष्म-शैवाल की चयनित छवियां देखेंचित्रा 3 ध्यान दें कि व्यक्तिगत छवियों की पृष्ठभूमि प्रोफाइल को पहले समाप्त कर दिया जाना चाहिए, और छवि तीव्रता और घटाव कार्यों से पहले उनकी तीव्रता सामान्यीकृत होनी चाहिए।
    2. आगे के विश्लेषण के लिए छवियों से प्राप्त मापदंडों की लाइब्रेरी, जैसे सेल वॉल्यूम, परिपत्र, और अवशोषण घनत्व आदि उत्पन्न करें।
  2. डाटा विज़ुअलाइजेशन प्लेटफॉर्म ( चित्रा 4 ) में डेटा की लाइब्रेरी इनपुट करें।
    1. पैरामीटरों की पुस्तकालय और विज़ुअलाइज़ेशन इंटरफ़ेस प्लेटफ़ॉर्म पर संबंधित पुनर्रचित चित्र लोड करें।
    2. अक्षरों को ब्याज के मापदंडों के रूप में सेट करें
      नोट: पैरामीटर समस्या-विशिष्ट हैं और उपयोगकर्ता द्वारा परिभाषित किए गए हैं वे MATLAB प्रोग्राम द्वारा ATOM छवियों से प्राप्त होते हैं। यहां, चयन के लिए सेल, सेल एरिया, सेल वॉल्यूम, और सेल परिपत्र की ऑप्टिकल अवशोषण घनत्व उपलब्ध है। प्रदर्शित करने के लिए डेटासेट चुनें, जैसे प्रत्येक सेल छवि को स्कैटर साजिश पर एक अलग डेटा बिंदु के रूप में देखा जा सकता है।
    3. माउस कर्सर को प्रत्येक बिंदु पर ले जाएं, जैसे संबंधित छवि और अन्य मापदंडों को एक फ्लोटिंग उप-विंडो में दिखाया गया है।
      नोट: अक्षों को एक इंटरैक्टिव तरीके से रैखिक और लॉगरिदमिक तराजू के बीच बदला जा सकता है।
    4. स्कैटर साजिश पर मैन्युअल रूप से gating द्वारा डेटासेट के किसी भी उपसमुच्चय का और विश्लेषण करें।
      नोट: गेटेड सबसेट के प्रत्येक पैरामीटर में हिस्टोग्राम पूरे पुस्तकालय के उन लोगों के खिलाफ लगाया जा सकता है अलग हिस्टोग्राम एक अन्य फ्लोटिंग उप-विंडो में प्रदर्शित होते हैं।

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Representative Results

यह काम एटॉम द्वारा दो सिंगल-सेल इमेजिंग प्रदर्शनों को दर्शाता है: एक स्तनधारी कोशिकाओं (मानव परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर सेल (पीबीएमसी) और स्तन कैंसर कोशिकाओं (एमसीएफ -7)) और दूसरा एक फाइप्लांक्टन एस (स्कैनेडेसमस और क्लैमाडोमोनस) के साथ। पहला प्रयोग रक्त 23 में ट्यूमर कोशिकाओं (सीटीसी) को परिचालित करने, पहचान, गणना और लक्षण वर्णन के लिए तरल बायोप्सी में बढ़ती रुचि से प्रेरित था। प्राथमिक ट्यूमर साइटों से रक्त प्रवाह में सीटीसी को मापने की क्षमता मेटास्टेटिक कैंसर की प्रगति 24 , 25 की परीक्षा के लिए अनुमति देता है। हालांकि, सीटीसी विश्लेषण में मौजूद चुनौतियां: (i) सीटीसी की गिनती पूरे रक्त में अत्यधिक रक्त कोशिकाओं की तुलना में काफी कम है सीटीसी की पहचान और पुनर्प्राप्त करने के मौजूदा तरीकों में ज्यादातर सेल संवर्धन और पृथक्करण कदम शामिल हैं वर्ग = "xref"> 26 , 27 , 28 हालांकि, रक्त कोशिकाओं से दूषित पृष्ठभूमि और / या समृद्ध सीटीसी की व्यवहार्यता बाद के आणविक विश्लेषण ( जैसे, आरएनए अनुक्रमण) के लिए चिंता का विषय है। (Ii) सीटीसी दोनों बायोफिजिकल और बायोमोलेकुलर हस्ताक्षर के मामले में अत्यधिक विषम हैं, सीटीसी संवर्धन और पहचान की क्षमता को सीमित करते हैं। यह अंत करने के लिए, उच्च इमेजिंग थ्रूपूट के साथ लेबल मुक्त इमेजिंग फ्लो साइटोमेट्री एक आकर्षक उपकरण है जो प्रत्यक्ष इमेजिंग और सीटीसी की पहचान, रक्त कोशिकाओं की एक विशाल जनसंख्या के भीतर, कम से कम या संवर्धन के कदमों को पार करने के लिए भी अनुमति देता है।

दूसरा प्रयोग विशेष रूप से बड़े पैमाने पर फ़ाइप्लांकटन लक्षण वर्णन के लिए प्रासंगिक है, जो पर्यावरण विज्ञान में अग्रिमों को प्रभावित कर सकता है ( उदाहरण के लिए, हानिकारक अल्गल खिल (एचएबी) प्रजातियों का पता लगानाS = "xref"> 29 और अक्षय बायोडीजल स्रोतों के रूप में सूक्ष्मजीव प्रजातियों की पहचान) 17 । एटीओएम द्वारा सक्षम, फाईप्लांक्टन की उच्च-थ्रुपुट और उच्च-विपरीत एकल-कोशिका इमेजिंग की क्षमता विभिन्न प्रजातियों और प्रजातियों में आकार, बनावट और आकारिकी में जटिल विविधता को प्रकट करने के लिए मूल्यवान हो सकती है।

चित्रा 3 चित्रा 3 में स्तनधारी कोशिकाओं, एमसीएफ -7 और पीबीएमसी (~ 10 एम / एस की रफ्तार से बहती है) के साथ-साथ माइक्रोएल्गे, स्नेडेस्मुस और क्लैमाडोनास (~ 2 एम / एस की गति से बहती है), एटीओएम द्वारा कब्जा कर लिया गया है। । सभी चार मामलों में, दो विपरीत चरण-ग्रेडिएंट विरोधाभास दो बार-मल्टिप्लेक्स, एसिमैट्रेटिकली सिग्नल (चरण 2.3 में वर्णित) द्वारा प्राप्त किए गए थे। वे दोनों एक छद्म-त्रि-आयामी उपस्थिति प्रदर्शित करते हैं, जो डीआईसी छवियों जैसी दिखती हैं, जिनमें से प्रत्येक दो विपरीत छिद्र झुकाव दिखाता है ( चित्रा 3 ए में स्तंभ 1 और 2) यानी, अवशोषण-केवल और बढ़ाए गए अंतर चरण-ग्रेडिएंट विरोधाभास), चित्रा 3 ए में कॉलम 3 और 4 को प्राप्त करना संभव था -डी ) ध्यान दें कि न केवल लेबल मुक्त एटीओएम ब्लर-मुक्त एकल-सेल छवियों को प्रकट कर सकता है, लेकिन उच्च विपरीत वाले सेलुलर संरचनाओं को भी चिह्नित करता है विशेष रूप से, सूक्ष्म शैवाल में रिक्तिकाएं, पाइरेनॉइड और फ्लैगेला को चित्रा 3 में स्पष्ट रूप से देखा जा सकता है। यह इमेजिंग विशेषता स्वत: छवि-आधारित वर्गीकरण के लिए आंतरिक सेलुलर और सबसेलुलर बनावट / रूपों से प्राप्त पहचानकर्ताओं के एक समृद्ध समूह के समृद्ध रूप से सक्षम बनाता है।

यह काम दर्शाता है कि जैवभौतिकीय गुण, जैसे सेल परिपत्रता और सेल आकार, के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है एमसीएफ -7 और पीबीएमसी का वर्गीकरण। ध्यान दें कि दो क्लस्टर एमसीएफ -7 नमूने में मनाए जाते हैं। सभी डेटा बिंदुओं के लिए उच्च-विपरीत छवियों की उपलब्धता हमें यह जांचने देती है कि समूहों में से कोई एक टुकड़े / मलबे ( चित्रा 4 ए ) से मेल खाती है। एटोम छवियों पर आधारित फाइटप्लँक्टन की दो प्रजातियों के बीच एक समान वर्गीकरण भी किया गया था। यहां, वर्गीकरण के परिणाम कस्टम यूजर इंटरफेस ( चित्रा 4 ) के द्वारा देखे गए 2 डी स्कैटर प्लॉट के रूप में प्रस्तुत किए जाते हैं। प्रत्येक कोशिका के अनुरूप स्कैटर प्लॉट में प्रत्येक एनोटेटेड डेटा बिंदु, एटॉम से प्राप्त विभिन्न मानदंडों के साथ और आगे का पता लगाया जा सकता है। इसी एटॉम छवि को साजिश में प्रत्यक्ष रूप से प्रदर्शित किया जा सकता है। आगे वर्गीकरण और विश्लेषण की सुविधा के लिए मैनुअल गेटिंग भी इस विज़ुअलाइज़ेशन इंटरफ़ेस में समर्थित है।

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चित्रा 3: अल्ट्राफाइड फ्लो स्पीड (~ 2-10 एम / एस) में माइक्रो-शैवाल और स्तनधारी कोशिकाओं के एटॉम इमेज गैली। ( ए ) स्केंडेसमस; ( बी ) क्लैमिडोमोनास; ( सी ) स्तन कैंसर कोशिकाओं, एमसीएफ -7; और ( डी ) मानव पीबीएमसी स्केंडेस्मुस और क्लैमाडोमोनस 2 एम / एस पर प्रवाहित होते हैं, जबकि एमसीएफ -7 और पीबीएमसी 10 एम / एस पर प्रवाहित होते हैं। प्रत्येक सेल प्रकार के लिए बाईं ओर दो स्तंभ (स्तंभ 1 और 2) दो विपरीत चरण-ढाल विरोधाभासों का प्रतिनिधित्व करते हैं। कॉलम 3 और 4 क्रमशः अवशोषण के विपरीत और अंतर (एन्हांस्ड) चरण-ग्रेडिएंट कंट्रास्ट का प्रतिनिधित्व करते हैं। स्केल बार = 20 माइक्रोन (लाल रंग में) इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्रा 4
फाईअनुच्छेद 4: एटॉम छवियों पर आधारित साइटोमेट्रिक विश्लेषण के लिए एक ग्राफ़िकल यूजर इंटरफेस। इस इंटरफ़ेस में उपयोगकर्ता एटॉम छवियों से प्राप्त विभिन्न सेल पैरामीटर ( जैसे, सेल आकार, परिपत्र, अवशोषण घनत्व, आदि ) को परिभाषित करके सेल-प्रकार वर्गीकरण और विश्लेषण कर सकता है। परिणाम केंद्र पैनल में प्रदर्शित स्कैटर प्लॉट में प्रदर्शित किया जा सकता है। विभिन्न प्रदर्शन विकल्पों का उपयोग और नियंत्रण, जिसमें एक्स-और वाई-अक्ष (एक्स- और वाई-एक्स पैरामीटर बटन) के लिए पैरामीटर और स्केलिंग शामिल हैं और डेटा सेट (डेटासेट बटन) के बीच स्विच करना संभव है। विस्तृत सेल जानकारी (सेल सूचना टैब) किसी विशेष डेटा बिंदु पर होवर करके पढ़ा जा सकता है। तेजी से नेविगेशन को सक्षम करने के लिए, उपयोगकर्ता एक और देखने के मोड में बदल सकता है और साथ ही केंद्र के पैनल में स्कैटरप्लॉट पर सभी छवियों को प्रदर्शित कर सकता है (मोड बटन देखना)। मैनुअल गेटिंग भी आगे के विश्लेषण के लिए किया जा सकता है पीला डेटा बिंदु एमसीएफ -7 सेल नमूना का प्रतिनिधित्व करते हैं (में ( <</ मजबूत>)) और स्केनेस्समस (एससीई) (में ( बी )), जबकि लाल डेटा अंक मानव पीबीएमसी नमूना (में (ए)) और क्लैमाडोनास (सीएए) (में (बी)) का प्रतिनिधित्व करते हैं। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

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Discussion

कई तकनीकी विवरण हैं जो ATOM सिस्टम सेटअप के दौरान विशेष ध्यान देने की आवश्यकता होती है। सबसे पहले, यह ध्यान रखना आवश्यक है कि असममित / तिरछी स्पेक्ट्रेटिक-एन्कोडेड रोशनी अवशोषण के चरण-ढाल घटकों ( यानी, छद्म प्रभाव) को अवशोषण के विपरीत में पेश कर सकती है और एटॉम में चरण-ग्रेडिएन्ट कंट्रास्ट को बढ़ाती है। इसलिए, तिरछी रोशनी के इस प्रभाव को कम किया जाना चाहिए। दूसरा, इसे जोर दिया जाना चाहिए कि समय-बहुसंकेतन या दो-दोहराव वाले दो-दोहराव वाली योजनाओं को इमेजिंग स्पीड ( यानी, लाइन-स्कैन दर> मेगाहर्टज के रखरखाव दर) में कोई महत्वपूर्ण समझौता नहीं किया जा सकता है, यह देखते हुए कि कुल अस्थायी चौड़ाई दो किरण-प्रतिकृतियां एक लाइन स्कैन की अवधि से अधिक नहीं हैं। तीसरा, फैलाने वाले फाइबर और एम्पलीफायरों के एकीकृत मॉड्यूल का इष्टतम कॉन्फ़िगरेशन लक्षित लाभ पर निर्भर करता है क्योंकि उपलब्ध एम्पलीफायरों का विनिर्देशन। ऑप्टिकल प्रवर्धन essentia हैजीवीडी 22 से जुड़े ऑप्टिकल नुकसान से निपटने के लिए समय-खंड की प्रक्रिया के लिए सिद्धांत रूप में, इसे किसी भी प्रकार के ऑप्टिकल एम्पलीफायर द्वारा लागू किया जा सकता है, अधिमानतः फाइबर प्रारूप में, ऐसा फाइबर आधारित, समय-विस्तार प्रक्रिया ( चित्रा 1 बी ) के साथ संगत है। ऑप्टिकल फाइबर आधारित ऑप्टिकल एम्पलीफायरों के व्यावहारिक उदाहरणों में एर्बियम-डाइड फाइबर एम्पलीफायरर्स (ईडीएफए; ~ 1500-1,600 एनएम के ऑपरेशन तरंग दैर्ध्य के लिए), येटर्बियम-डीपीड फाइबर एम्पलीफायर्स (वाईडीएफए; ~ 1060 एनएम के संचालन तरंग दैर्ध्य के लिए), फाइबर रमन एम्पलीफायर, और फाइबर ऑप्टिकल पैरामीट्रिक एम्पलीफायर (एफओपीए; किसी भी ऑपरेशन तरंगलांबिक के लिए, सिद्धांत रूप में, जब तक कि एक पंप लेजर स्रोत उपलब्ध है)। एम्पलीफायर शोर को मॉड्यूल डिजाइन में सावधानी से विचार किया जाना चाहिए। विस्तृत सिद्धांत को संदर्भ 8 में देखा जा सकता है। एक सामान्य विन्यास में कई डिस्परिव फाइबर सेगमेंट (प्रत्येक में कुछ किलोमीटर की लंबाई होती है) के बीच डाला गया एकाधिक / कैसकेड फाइबर एम्पलीफायर शामिल हो सकते हैं। एटीओएम ए के लिएसामान्य रूप से एनडी समय-खंड इमेजिंग, ठेठ ऑन-ऑफ ऑप्टिकल पावर गेन में लगभग 20-30 डीबी होना चाहिए। यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि ऑपरेशन तरंग दैर्ध्य श्रृंखला आमतौर पर ~ 800-1,550 एनएम तक सीमित होती है, मुख्य रूप से छोटे तरंग दैर्ध्य ( यानी, दृश्य तरंग दैर्ध्य) पर अत्यधिक ऑप्टिकल फाइबर हानि के कारण। इसलिए, समय-खंड इमेजिंग प्रदर्शनों के बहुमत के समान, फाइबर आधारित एटॉम तुरंत प्रतिदीप्ति इमेजिंग पर लागू नहीं होगा जहां दृश्य-प्रकाश परिचालन अभी भी सामान्य हैं। इसके बावजूद, ध्यान रखें कि फ्री स्पेस एन्जिल-चिरप-बढ़ाया विलंब (एफएसीआईडी) नामक एक समय-सारिणी जैसी फ्री स्पेस पल्स-स्ट्रेसिंग अवधारणा को हाल ही में एटॉम में अल्ट्राफास्ट लेजर स्कैनिंग इमेजिंग के साथ-साथ प्रतिदीप्ति इमेजिंग के लिए भी इस्तेमाल किया गया है। दृश्य तरंग दैर्ध्य 30 में

सूक्ष्म डिजाइन विचार की आवश्यकता है एक और महत्वपूर्ण पैरामीटर छवि संकल्प है। शास्त्रीय प्रकाश माइक्रोस्कोपी के विपरीत, छविस्पेक्ट्रल बौछार अक्ष के साथ एटॉम और सामान्य समय-खंड इमेजिंग का रिज़ॉल्यूशन तीन सीमित शासनों द्वारा शासित होता है 22 : (i) स्थानिक-फैलाव-सीमित संकल्प, जो विवर्तन झंझरी के वर्णक्रमीय संकल्प से संबंधित है, जिसे δ x स्थानिक ; (Ii) स्थिर-चरण की सन्निकरण सीमा, जिसे तरंग-लम्बाई-समय मानचित्रण प्रक्रिया की अस्पष्टता के रूप में परिभाषित किया जाता है δ एक्स एसपीए , जो कि जीवीडी 22 के वर्गमूल के साथ व्युत्क्रम करता है; और (iii) photodetector-सीमित संकल्प δ x det , जो photodetector की परिमित बैंडविड्थ का वर्णन करता है जो अंतिम स्थानिक संकल्प को भी प्रभावित कर सकता है। सामान्य तौर पर, इन तीन मापदंडों में सबसे बड़ा मूल्य एटॉम, δ एक्स ( यानी, δ x = अधिकतम { δ एक्स स्पेसियल , δ) के छवि संकल्प के रूप में परिभाषित किया गया है एसपीए , δ x डेट })। यह सुनिश्चित करना हमेशा वांछनीय है कि अंतिम संकल्प स्थानिक-फैलाव-सीमित है ( यानी, δ x = δ x स्थानिक > δ x SPA > δ x det )। इसलिए, दोनों जीवीडी (चरण 2.2.1.1) और फोटोडेटेक्टर के बैंडविड्थ (चरण 2.3.5) को इस स्थिति को पूरा करने के लिए पर्याप्त रूप से उच्च होना चाहिए। दूसरी ओर, प्रवाह की दिशा के साथ छवि रिज़ॉल्यूशन विवर्तन सीमा से मूल्यांकन किया जाता है यह केवल सच है जब Nyquist की नमूनाकरण स्थिति ( यानी, लेजर के पुनरावृत्ति दर (एच, एचजे) और कोशिकाओं के प्रवाह की दर (एफ, एम / एस) को इस तरह सेट करना चाहिए कि पिक्सल का आकार प्रवाह की दिशा F / R <2 δ y है, जहां δ y प्रवाह की दिशा के साथ विवर्तन-सीमित संकल्प है)। ध्यान दें कि झंझरी की विशिष्टता ( जैसे, </ Em> नाली घनत्व) और उद्देश्य लेंस ( उदाहरण के लिए, संख्यात्मक एपर्चर (एनए)) ध्यान से लक्षित संकल्प से मिलान करने के लिए डिज़ाइन किया जाना चाहिए।

वर्तमान एटॉम प्रदर्शन और प्रोटोकॉल दिखाते हैं कि डाटा अधिग्रहण ओसिलोस्कोप द्वारा किया जाता है और डेटा प्रोसेसिंग ऑफ़लाइन की जाती है, वास्तविक समय, निरंतर डेटा अधिग्रहण, प्रसंस्करण और यहां तक ​​कि विश्लेषिकी प्राप्त करने के लिए विशेष रूप से प्राप्त करने की क्षमता का लाभ उठाना अधिक अनुकूल है एटॉम द्वारा लाया गया अतिवादी और उच्च-विपरीत छवि कैप्चर क्षमता इस अंत में, एक उच्च-प्रदर्शन और उच्च-थ्रूपुट सिग्नल प्रोसेसिंग यूनिट को अपनाया जाना चाहिए, जैसे कि ग्राफिकल प्रोसेसिंग यूनिट (जीपीयू) और / या फ़ील्ड-प्रोग्रामेबल गेट सरणी (एफपीजीए), जो कि क्षमता की क्षमता का प्रदर्शन किया गया है ~ 1-10 जीबी / एस के रूप में उच्च के रूप में डेटा प्रोसेसिंग थ्रूपुट प्राप्त करना यह एटॉम ( यानी, ~ 10 जीएसए / एस) की अल्ट्राफास्ट नमूनाकरण क्षमता के साथ संगत है। एटॉम का एकीकरण और एक उच्च-थ्रुपुट डेटा प्रोसेसिंगसीसेलेरेटर डेटा-चालित जैविक अध्ययनों में एक नया प्रतिमान सक्षम बनाता है, खासकर एक विशाल आबादी के भीतर विभिन्न एकल कोशिकाओं के बीच अज्ञात विविधता को उजागर करने में। इस तरह की तकनीक, नैदानिक ​​अनुसंधान की एक नई पीढ़ी को सशक्त बना सकती है, जिसमें रोग प्रक्रिया के दौरान दुर्लभ, निरंकुश कोशिकाओं को लेबल-मुक्त तरीके से मापा जा सकता है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

हमारे लिए एमसीएफ -7 की तैयारी के लिए श्री पी। यह काम आंशिक रूप से हांगकांग विशेष प्रशासन क्षेत्र, चीन (परियोजना संख्या 1725 9 316, 17207715, 17207714, 17205715, 17207714, 17205215, और एचयूयू 720112 ई) के अनुसंधान अनुदान परिषद से अनुदान द्वारा समर्थित था, इनोवेशन एंड टेक्नोलॉजी सपोर्ट प्रोग्राम (आईटीएस / 090/14 ), और HKU के विश्वविद्यालय विकास कोष

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Nikon Plan Fluorite Physiology Objectives 40X Nikon MRF07420 Objective lens (Obj2)
Olympus Plan Fluorite Objective, 0.75 NA, 0.51 mm WD, 40X Olympus RMS40X-PF Objective lens (Obj1)
N-BK7 Plano-Convex Lenses Thorlabs LA1145-C For relaying spectral shower
FC/APC Fiber Collimation Package Thorlabs F220APC-1064 For outputing and collecting laser pulses
Pellicle beamsplitter Thorlabs BP145B3 For making beam replica
Protected silver mirror Thorlabs PF10-03-P01 For reflecting light
800-1650nm 12GHz single mode DC-coupled NIR Photoreceiver Newport 1544-B For converting light into electrical signal
Infiniium High-Performance Oscilloscope Agilent DSOX91604A To save the light-converted electrical signals
HI1060 optical fiber Corning HI1060 Optical fiber for time-stretch
YTTERBIUM DOPED FIBER AMPLIFIER Keopsys KPS-STD-BT-YFA-37-BO-SM-111-FA-FA Optical in-line amplifier
Holographic grating Wasatch Photonics 020305-6 Grating
Infuse/Withdraw Syringe Pumps Harvard Apparatus PHD 2000 Syringe pump for sample loading in micro-fluidic channels

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References

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