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Engineering

Cytométrie de flux d'imagerie microfluidique par détection asymétrique Microscopie optique à temps-étirement (ATOM)

Published: June 28, 2017 doi: 10.3791/55840
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, 1, 1, 2, 1, 1
1Department of Electrical and Electronic Engineering, The University of Hong Kong, 2Department of Mechanical Engineering, The University of Hong Kong

Summary

Ce protocole décrit la mise en place d'un système de microscopie optique à étirage temporel de détection asymétrique pour l'imagerie monocellulaire dans un flux microfluidique ultra-rapide et ses applications dans la cytométrie de flux d'imagerie.

Abstract

La mise à l'échelle du nombre de paramètres mesurables, qui permet une analyse de données multidimensionnelle et donc des résultats statistiques de plus haute confiance, a été la tendance principale dans le développement avancé de la cytométrie en flux. En particulier, l'ajout de capacités d'imagerie haute résolution permet l'analyse morphologique complexe des structures cellulaires / sous-cellulaires. Ceci n'est pas possible avec les cytomètres de flux standard. Cependant, il est précieux de faire progresser notre connaissance des fonctions cellulaires et peut bénéficier de la recherche en sciences de la vie, du diagnostic clinique et de la surveillance de l'environnement. L'intégration des capacités d'imagerie dans la cytométrie de flux compromet le débit d'analyse, principalement en raison des limitations de la vitesse et de la sensibilité dans les technologies de caméra. Pour surmonter cette vitesse ou le défi de débit face à la cytométrie de flux d'imagerie tout en préservant la qualité de l'image, on a démontré que la microscopie optique étirable à distance (ATOM) de détection asymétrique permettait une imagerie monocellulaire à contraste élevéAvec une résolution sous-cellulaire, à un débit d'image aussi élevé que 100 000 cellules / s. Basé sur le concept d'imagerie conventionnelle à l'étirement du temps, qui repose sur l'encodage et la récupération d'images tout-optique grâce à l'utilisation d'impulsions laser à large bande ultra-rapide, ATOM avance les performances d'imagerie en améliorant le contraste d'image des cellules non marquées / non colorées. Ceci est obtenu en accédant à l'information de gradient de phase des cellules, qui est codée spectralement en impulsions à large bande à un seul coup. Par conséquent, ATOM est particulièrement avantageux dans les mesures à haut débit de la morphologie et de la texture d'une seule cellule, ce qui indique des types de cellules, des états et même des fonctions. En fin de compte, cela pourrait devenir une puissante plate-forme de cytométrie de flux d'imagerie pour le phénotypage biophysique des cellules, en complément de l'analyse cellulaire à base de marqueurs biochimiques à l'état actuel de l'art. Ce travail décrit un protocole pour établir les modules clés d'un système ATOM (du frontend optique vers les données pBackend de traitement et de visualisation), ainsi que le flux de travail de la cytométrie de flux d'imagerie à base d'ATOM, en utilisant des exemples de cellules humaines et de micro-algues.

Introduction

L'imagerie optique présente un outil puissant et un test basé sur des cellules pour visualiser (presque) de façon non invasive la répartition spatiale détaillée de plusieurs composants cellulaires / subcellulaires, dévoilant ainsi une multitude de signatures morphologiques, biophysiques et biomoléculaires des cellules. Cependant, cette capacité à extraire des informations à haute teneur provenant de cellules isolées a généralement été compromise lorsqu'une population de cellules énorme et hétérogène devait faire l'objet d'une enquête. Cela marque un compromis commun entre les tests basés sur des cellules entre le débit de mesure et le contenu. Un exemple notable est que l'ajout de capacité d'imagerie à la cytométrie de flux a entraîné une réduction du débit d'au moins 1 à 2 ordres de grandeur par rapport à celle des cytomètres classiques de flux de non-imagerie. Bien qu'il puisse offrir une analyse morphologique simple à une cellule qui n'est pas possible avec les cytomètres de flux standard 1 , la cytométrie de flux d'imagerie n'a généralement pas de débit suffisant pour l'identificationD'enrichir l'hétérogénéité cellulaire avec une forte confiance statistique. Ceci est nécessaire pour de nouvelles découvertes en biologie et pour une compréhension de la pathogenèse des maladies. Le défi technique principal réside dans la limite de vitesse inhérente imposée par les stratégies d'image optique communes: la numérisation du faisceau laser ( par exemple, par des miroirs galvanométriques) et / ou des capteurs d'image ( par exemple, un dispositif à couplage de charge (CCD) Oxyde semi-conducteur (CMOS)). La vitesse de balayage laser est intrinsèquement limitée par l'inertie mécanique des miroirs de balayage, tandis que la cadence d'image de CCD ou de CMOS est limitée par le compromis fondamental entre la vitesse d'imagerie et la sensibilité ( c.-à-d. , et vice versa).

Basé sur un mécanisme de codage d'image tout-optique et ultra-rapide, l'imagerie optique à l'étirement du temps a été démontrée comme une plate-forme attrayante pour le cytrate de flux d'imagerie à haut débitOmeters, sans besoin des capteurs d'images classiques ou du balayage laser mécanique 2 , 3 . Des descriptions détaillées du principe de fonctionnement de l'imagerie étirable peuvent être trouvées dans les références 4 , 5 , 6 , 7 . En bref, il consiste en deux étapes de mappage interchangeables: (i) codage spectral (mappage de l'espace de longueur d'onde), dans lequel les coordonnées spatiales de l'échantillon imagé sont mappées à différentes longueurs d'onde sur le spectre du faisceau lumineux 8 , 9 , Et (ii) une transformation de Fourier dispersive (mappage de longueur d'onde) 9 , dans laquelle les composantes de longueur d'onde des impulsions laser individuelles sont transformées (étirées) par dispersion de vitesse de groupe (GVD) en formes d'ondes temporelles (longueur d'onde) ( Figure 1 ). Un importantLa fonctionnalité de l'imagerie étirable est l'amplification optique, qui joue un rôle essentiel dans la lutte contre la perte de sensibilité due à la photodétection ultra-rapide et à la perte de GVD, améliorant ainsi le rapport signal / bruit d'image (SNR) sans être contaminé par le bruit photodétecteur 9 . Étant donné que chaque impulsion laser code pour un balayage en ligne de l'échantillon imagé, qui est orthogonal au flux unidirectionnel des cellules, un taux de balayage de ligne efficace est déterminé par le taux de répétition laser, qui est généralement au-delà de 10 MHz. Cette opération ultra-rapide permet une capture d'image à une seule cellule sans flou, à un débit de 10 000 à 100 000 cellules / s ( c.-à-d. 10 à 100 fois plus élevé que la cytométrie de flux d'imagerie conventionnelle). En conséquence, l'imagerie temporelle pourrait trouver des applications uniques dans le dépistage à base d'images à une seule cellule à haut débit, surtout lorsqu'il est nécessaire d'identifier une hétérogénéité inconnue ou des cellules aberrantes / aberrantes dans une population importante (des milliers à des millions de Cel Ls), comme le dépistage de cellules cancéreuses rarement 10 ou la classification des microalgues 11 .

L'imagerie étirable repose principalement sur la capture d'image de champ lumineux (BF), à partir de laquelle le contraste de l'image est généré par diffusion de lumière et absorption à partir des cellules 2 , 3 , 9 , 10 , 11 . De telles capacités d'imagerie à une seule cellule exemptes d'étiquettes pourraient contourner les effets néfastes associés aux étiquettes fluorescentes, telles que la cytotoxicité et la photoblanchiment, et fournissent pourtant des informations précieuses pour une analyse monocellulaire basée sur la texture et la morphologie cellulaire et sous-cellulaire. Ces paramètres exempts d'étiquettes se sont révélés efficaces pour la classification des images en profondeur, en particulier lorsqu'une population cellulaire énorme est disponible 11 ,"Xref"> 12. Cependant, à plusieurs reprises, l'imagerie BF ne fournit pas un contraste suffisant pour révéler la morphologie détaillée des cellules transparentes exemptes d'étiquettes. Différentes modalités d'imagerie sans étiquetage, de contraste de phase et d'étirement du temps ont été développées pour améliorer le contraste de l'imagerie aux cadences d'images ultra-fines 13 , 14 , 15 . Parmi ces techniques, on a développé une microscopie optique (ATOM) à distance de détection asymétrique pour révéler le contraste de gradient de phase (différentiel-interférence-contraste-DIC) basé sur un concept similaire à la photographie de Schlieren, Imagerie libre et à contraste élevé de cellules individuelles à une vitesse microfluidique ultra-haute (jusqu'à 10 m / s) 16 . Cet effet peut être facilement généré par détection ou illumination oblique en bloquant partiellement le chemin du faisceau codé par image ou en inclinant le faisceau avant la photodétection. Un autre avantage d'ATOM est sonAfin d'acquérir simultanément deux contrastes de gradient de phase selon des orientations opposées. La soustraction d'intensité et la sommation de deux images de contraste opposé produisent respectivement le contraste de gradient de phase différentiel et le contraste d'absorption à partir du même balayage de ligne. Ce travail présente un protocole détaillé décrivant la mise en œuvre de l'ATOM, y compris la mise en place de la configuration optique, la préparation des échantillons et l'acquisition et la visualisation des données. Plus précisément, ce travail démontre l'opération ATOM avec l'imagerie monocellulaire des cellules sanguines humaines, des cellules cancéreuses et du phytoplancton (microalgues). Cela met en évidence l'applicabilité d'ATOM à la cytométrie de flux d'imagerie, non seulement dans l'arène biomédicale, mais aussi dans la recherche marine et biocarburants 17 , 18 .

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Protocol

1. Préparation de l'échantillon

  1. Préparation de l'échantillon (cellules adhérentes, cellules MCF-7)
    1. Retirez le plat de culture cellulaire de l'incubateur et égouttez le milieu de culture.
    2. Rincer les cellules sur un plat avec 1x solution salée tamponnée au phosphate (PBS) pour éliminer le milieu de culture excessif.
    3. Ajouter 3 mL d'une solution de trypsine à 0,25% dans le plat de culture (diamètre de 100 mm) et mettre dans un incubateur à 37 ° C, 5% CO 2 pendant 4 min.
      NOTE: La trypsine dissout la protéine adhésive des cellules afin qu'elles se détachent du plat de culture.
    4. Vérifiez si toutes les cellules se sont détachées du plat de culture à l'aide d'un microscope optique (objectif 10X). Sinon, secouer doucement le plat de culture cellulaire.
    5. Ajouter 4 mL du milieu de culture standard (formulé avec 89% de milieu Eagle modifié de Dulbecco (DMEM), 10% de sérum bovin fœtal (FBS) et 1% de pénicilline-streptomycine (PS)) pour arrêter l'action de la trypsine.
    6. TRenvoyer le mélange entier (cellules dans la solution de trypsine et le milieu de culture) à un tube de centrifugation et centrifuger pendant 5 min à 200 x g.
    7. Retirez tout le fluide et ré-suspendez les cellules dans 1 mL de 1x PBS (pH: 7.4, préchauffé à 37 ° C).
  2. Préparation de l'échantillon (micro-algues cultivées)
    1. Transférer les micro-algues cultivées et le milieu de culture ( p. Ex., Eau de mer, gélose ou eau douce) à de nouveaux tubes de culture de verre (~ 15 mL) en un rapport volumique (microalgues au milieu de culture) de 1: 5 pour établir Un nouveau sous-culture moyen.
    2. Placez les tubes de culture en verre dans une chambre étanche à la poussière sous un éclairage constant par un éclairage artificiel à partir d'ampoules fluorescentes selon un cycle léger / sombre (LD) (habituellement LD 16: 8) pendant 72 à 120 h avant l'expérience.
    3. Transférer les échantillons sous-cultivés dans un tube centrifuge et bien mélanger.

2. Configuration du système ATOM


Figure 1: schéma d'un système ATOM. Un laser pulsé à large bande est utilisé pour délivrer des impulsions ultra-rapides pour ( a ) un module d'étirement du temps et ( b ) un module d'amplificateur optique en ligne. Le module d'étirement temporel génère un train de formes d'ondes temporelles, dont chacune est la réplique du spectre de longueur d'onde de la source laser ( c'est -à-dire la cartographie en longueur d'onde). Le module amplificateur est utilisé pour la compensation de perte d'impulsion (dispersion). L'impulsion étirée est alors ( c ) dispersée spatialement par un réseau de diffraction, formant un éclairage de douche spectral 1D dans lequel des composantes individuelles de longueur d'onde sont relayées par une paire de lentille de relais et focalisées par la lentille d'objectif sur différentes positions sur la cellule d'écoulement à l'intérieur du ( d ) Puce microfluidique. C'est le processus de codage spectral. leLa lumière encodée de manière spectrale passera de nouveau la cellule à travers une autre lentille d'objectif et un miroir, en revenant au réseau de diffraction et en se recombinant comme un faisceau pulsé spatialement non dispersé. Ce faisceau pulsé codé par image est alors ( E ) se divisent en deux chemins, de sorte que les deux faisceaux sont partiellement bloqués avec ( f ) le bord du couteau, mais par des directions opposées, avant d'être couplés dans les fibres. Ces deux faisceaux représentent les deux contrastes déphasés codés (opposés) de l'image finale. Pour la détection simultanée des deux contrastes de signal, l'un des signaux subit ( g ) une ligne temporelle, de sorte que les deux signaux sont multiplexés (entrelacés) dans le temps. Un photodétecteur à grande vitesse et un oscilloscope en temps réel sont utilisés pour l'acquisition de données. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

  1. Temps st Module retch
    1. Employez une source laser pulsée femtoseconde à large bande (fs) ou picoseconde (ps) avec une longueur d'onde centrale recommandée dans la gamme infrarouge proche (NIR), 800-1 500 nm.
      REMARQUE: La largeur d'impulsion requise typique peut aller de 100 sous-100 à quelques ps. Les exigences détaillées des sources laser pulsées peuvent être vues dans les références 4 et 5. Les paramètres importants sont mis en évidence dans le tableau 1 .
      1. Assurez-vous que la source laser a un taux de répétition élevé, qui devrait être dans le régime de mégahertz ( par exemple, des dizaines de MHz) pour assurer une imagerie ultra-rapide dans ATOM. De plus, réglez la puissance du laser de sortie de crête bien au-dessous du seuil de puissance de dégagement de la cavité de fibre, environ 1 kW.
      2. Assurez-vous une bonne stabilité temporelle et spectrale de la source laser pulsée.
        NOTE: La tolérance typique dans la fluctuation de l'amplitude spectrale devrait être maintenue dans les 1,2% 19 , 20 ,Ss = "xref"> 21, tel que réalisé par le laser verrouillé en mode fibre dans cette configuration.
        REMARQUE: la largeur de bande optique de la source laser devrait être de 10 à 100 nm, ce qui est essentiel pour garantir un champ de vision d'image (FOV) suffisant dans l'imagerie à une seule cellule 21 .
    2. Grâce à un collimateur à fibre, couplez le faisceau pulsé au laser à une fibre optique dispersive monomode, dans laquelle les impulsions sont étirées par dispersion de vitesse de groupe (GVD) ( Figure 1a ).
      NOTE: Ceci est le processus après lequel le spectre de chaque impulsion est mappé sur le temps comme une forme d'onde balayée en longueur d'onde ( c. -à-d., Cartographie longueur d'onde).
      REMARQUE: Le GVD nécessaire total doit être suffisant pour que la résolution d'image ATOM globale ne soit pas affectée par le processus de cartographie de longueur d'onde (voir la discussion). Typiquement, dans la gamme NIR, le GVD devrait être bien au-delà de 0,1 ns / nm. Par exemple, une fibre mono-mode utilisée dansL'installation actuelle de l'installation fournit un GVD total de 0,38 ns / nm autour de la longueur d'onde de 1 060 nm (une longueur totale de fibre de 10 km).
  2. Module de codage spectral
    1. Construire un système de microscope optique pour effectuer l'imagerie codée spectralement des cellules qui circulent le long du canal microfluidique, comme illustré à la figure 1 .
      REMARQUE: Les composants clés de ce microscope optique comprennent: (1) un réseau de diffraction, un module de lentille relais télescopique (RL1 et RL2 sur la Figure 1 ) et deux lentilles d'objectif (Obj1 et Obj2 sur la Figure 1 ).
      1. Tout d'abord, illuminez le faisceau étiré et collimaté sur un réseau de diffraction (le réseau de transmission est utilisé dans cette configuration) pour générer une douche spectrale ( Figure 1c ).
        NOTE: La puissance du faisceau diffracté ( c.-à-d. L' efficacité de la diffraction) peut être optimisée en ajustant tL'orientation de la grille est fermée à la configuration de Littrow.
      2. Configurez les deux lentilles de relais (RL1 et RL2) dans un système d'imagerie 4-f ( c.-à-d., Placez le réseau de diffraction sur le plan focal de RL1 et séparez RL1 et RL2 d'une distance égale à la somme de leurs focales. La douche spectrale Sera ensuite imagé sur le plan focal arrière du objectif Obj1).
      3. Alignez soigneusement la douche spectrale pour remplir l'ouverture arrière de l'Obj1, de sorte que la douche spectrale puisse être projetée et concentrée sur le plan d'image du microscope.
        NOTE: Ici, la NA de l'objectif (Obj1 de la figure 1 ) est de 0,75.
      4. Placez une autre lentille d'objectif (Obj2 dans la Figure 1 ) avec un NA similaire et un miroir plat à l'ouverture arrière de cette lentille d'objectif (Obj2), de sorte que le faisceau de douche spectral peut être aligné pour passer le plan de l'image et revenir à la réseau de diffraction.
      5. RéglerLa paire de lentilles objectives (Obj1 et Obj2) de sorte que leurs plans focaux se chevauchent. Vérifiez si la douche spectrale passe le plan de l'image au même emplacement et retourne au réseau suivant le même chemin. Sinon, effectuez un alignement et un réglage supplémentaires du système optique.
        REMARQUE: La lumière retournée doit passer à travers un séparateur de faisceau supplémentaire, de sorte que la lumière peut être transmise à un module de détection asymétrique.
      6. Réglez le gain de l'amplificateur optique à un niveau approprié, de sorte que le signal résultant peut être détecté par le photodétecteur avec un bon SNR, qui est généralement de> 10 dB.
      7. Placez et ajustez la position de la puce microfluidique sur la plate-forme d'échantillonnage et assurez-vous que la douche spectrale, et donc la zone d'imagerie, est placée sur le canal microfluidique ( Figure 1d ).
        NOTE: La douche spectrale est éclairée orthogonalement à la direction d'écoulement des fluides à l'intérieur du mChip icrofluidic, de sorte que le mouvement d'écoulement effectue automatiquement des balayages bidimensionnels (2D).
  3. Module de détection asymétrique
    1. Placez un diviseur de faisceau supplémentaire pour séparer le faisceau codé par image en deux ( Figure 1e ).
      REMARQUE: Chaque réplique de faisceau est partiellement bloquée par un bord de couteau.
    2. Mesurez et enregistrez la puissance optique du faisceau avant le bloc de faisceau. Ensuite, positionnez manuellement les bords du couteau (montés sur un étage de translation linéaire) afin de bloquer à peu près la moitié du faisceau (par inspection visuelle). Ensuite, utilisez le compteur d'énergie optique pour surveiller l'intensité du faisceau tout en affinant la position des arêtes des couteaux en les traduisant sur le faisceau.
      REMARQUE: Il est suggéré que la position optimale soit la puissance diminuée de ~ 50% de la valeur d'origine ( c.-à-d. Le boîtier non bloqué). C'est la condition qui fournit la meilleure combinaison de signal d'imageRenforcement de la force et du contraste de l'image.
    3. Répétez l'étape 2.3.2 pour une autre réplique de faisceau. Notez que l'orientation du bloc de faisceau partiel pour un faisceau doit être opposée par rapport à l'autre faisceau ( figure 1f ).
    4. Associez les deux faisceaux partiellement bloqués en deux bras de fibre mono-mode séparés à travers des collimateurs à deux fibres.
      REMARQUE: L'un des bras a une longueur supplémentaire de fibre, servant de ligne à retard basée sur les fibres, pour introduire un retard de temps par rapport à l'autre réplique (sans la ligne à retard) ( Figure 1g ). Les deux sont dirigés vers une seule fibre par un coupleur de fibre avant la photodétection. La temporisation devrait être suffisamment longue pour séparer temporairement les deux répliques et suffisamment courtes pour éviter le chevauchement temporel avec la forme d'onde suivante ( c'est-à-dire que les deux répliques sont toujours intercalées dans le temps et multiplexées dans une seule fibre avant la détection ( Figure 2a )).
    5. CasquetteTure et numérise les signaux optiques détectés avec l'oscilloscope en temps réel. Notez que la bande passante et donc le taux d'échantillonnage de l'oscilloscope devraient être suffisamment élevés pour s'assurer qu'ils n'influencent pas la résolution finale de l'image (voir la discussion).
      REMARQUE: Ici, avec le GVD de 0,38 ns / nm, une bande passante d'acquisition de l'arrière-plan et un taux d'échantillonnage de> 20 GHz et> 40 GSa / s, respectivement, sont nécessaires.

3. Procédures expérimentales

  1. Chargement des spécimens
    1. Effectuer le comptage des cellules sous un microscope à contraste de phase conventionnel dans un hémocytomètre standard.
    2. Réglez la densité de la cellule en diluant avec 1x PBS (avec de l'eau de source pour les micro-algues) et mélangez bien avec une pipette.
      NOTE: La concentration suggérée est de 10 5 à 10 6 cellules / mL.
    3. Monter la puce microfluidique sur la plate-forme d'échantillonnage du système d'imagerie optique.
      NOTE: Le microfluidiqueLa puce est principalement constituée de polydiméthylsiloxane (PDMS) et est fabriquée en utilisant la méthode de moulage réplique standard. Le canal microfluidique est conçu avec un canal incurvé asymétrique pour générer l'effet de focalisation du flux inertiel, de sorte que les cellules peuvent circuler en un seul fichier dans la section d'imagerie (avec une dimension de 80 μm x 80 μm (hauteur x largeur)) à grande vitesse .
    4. Transférer la solution cellulaire ajustée en fonction de la densité à une seringue de 10 mL.
    5. Raccorder la seringue à l'entrée de la puce microfluidique et un tube centrifuge à la sortie de la puce microfluidique pour la collecte de l'élimination.
    6. Monter la seringue sur une pompe à seringue et régler un débit approprié pour donner un débit souhaitable et éviter d'imposer une force de cisaillement excessive entre les cellules et le canal.
      REMARQUE: la vitesse linéaire des échantillons devrait être comprise entre 0,5 et 10 m / s. Notez qu'avant l'enregistrement réel de l'image, il est souvent nécessaire d'affiner davantage le système, en termes de maximisationLa puissance du signal d'image et l'optimisation de la focalisation de l'image en répétant les étapes 2.2.1.4-2.2.1.6.

4. Acquisition de données

  1. Définissez un nombre approprié de points de données à sauver pour chaque expérience. Le nombre de points de données à sauvegarder dépend de la taille et du débit des échantillons.
    NOTE: Généralement, il est fixé à 8 à 16 millions de points d'échantillonnage sous un taux d'échantillonnage de 80 GSa / s.
  2. Acquérir et enregistrer les données en mode batch en utilisant l'oscilloscope.

5. Traitement de backend

Figure 2
Figure 2: Reconstruction des images ATOM à partir du tracé du temps de balayage de ligne. Pour reconstruire les images ATOM avec le contraste d'absorption et le contraste de gradient de phase (amélioré), deux ensembles d'impulsions étirées dans le temps (voir les impulsions violet et vert) sont extraits de(A) la trace de la forme de l'onde temporelle multiplexée dans le temps et sont ensuite segmentées et empilées numériquement pour former ( b ) deux images 2D montrant les deux contrastes de gradient de phase opposés. Notez qu'une opération de cisaillement est nécessaire pour former ( c ) les images sans distorsion en compensant le changement de sous-index en raison de l'erreur de redondance dans l'estimation du taux de répétition laser. En soustrayant ( d ) l'analyse de ligne brute de l'enveloppe d'intensité spectrale de la source laser, l'arrière-plan des images peut être supprimé. ( G ) Une image de contraste d'absorption peut être obtenue par une sommation d'intensité de pixel par pixel des images ( e ) et ( f ), alors que ( h ) une image de contraste de gradient de phase différentielle peut être obtenue à partir de la soustraction d'images (e ) Et (f). Cliquez ici pour voir une version plus grandeDe ce chiffre.

  1. Transférer les données de l'oscilloscope sur les ordinateurs pour la reconstruction d'image hors ligne.
    REMARQUE: Ici, les données sont stockées dans un disque dur portatif et transférées manuellement entre l'oscilloscope et les ordinateurs de traitement. La capacité du disque dur devrait être supérieure à 500 Go pour chaque expérience.
    1. Utilisez la routine de reconstruction d'image clé pour piloter numériquement les balayages de ligne pour former une image 2D ( Figure 2 ).
      REMARQUE: le programme personnalisé (dans MATLAB) produit alors deux images de détection asymétriques en séparant les deux ensembles de données multiplexées dans le temps (formes d'onde violet et vert de la figure 2 ).
      1. Obtenir une image différentielle de contraste de gradient de phase en soustrayant les intensités des deux images de détection asymétriques; Une image de contraste d'absorption peut être obtenue en ajoutant les deux images de détection asymétrique. Voir les images sélectionnées de MCF-7 et micro-algues dansFigure 3 . Notez que les profils d'arrière-plan des images individuelles devraient d'abord être éliminés et que leurs intensités devraient être normalisées avant les opérations de sommation et de soustraction d'image.
    2. Générer une bibliothèque de paramètres dérivés des images, telles que le volume de la cellule, la circularité et la densité d'absorption, etc. pour une analyse plus approfondie.
  2. Entrez la bibliothèque de données dans la plate-forme de visualisation de données ( Figure 4 ).
    1. Chargez la bibliothèque de paramètres et les images reconstruites correspondantes sur la plate-forme d'interface de visualisation.
    2. Définissez les axes comme paramètres d'intérêt.
      REMARQUE: les paramètres sont spécifiques au problème et sont définis par l'utilisateur. Ils sont dérivés des images ATOM par le programme MATLAB. Ici, la densité d'absorption optique de la cellule, la surface cellulaire, le volume cellulaire et la circularité cellulaire sont disponibles pour la sélection. Sélectionnez l'ensemble de données à afficher, de sorte que chaque image de cellule puisse être visualisée comme un point de données différent sur le diagramme de dispersion.
    3. Déplacez le curseur de la souris sur chaque point, de sorte que l'image correspondante et d'autres paramètres soient affichés dans une sous-fenêtre flottante.
      REMARQUE: Les axes peuvent être modifiés entre les échelles linéaire et logarithmique d'une manière interactive.
    4. Effectuez une analyse plus approfondie de tout sous-ensemble de l'ensemble de données en cliquant manuellement sur le diagramme de dispersion.
      REMARQUE: L'histogramme dans chaque paramètre du sous-ensemble gated peut être tracé par rapport à ceux de la bibliothèque entière. Les histogrammes séparés sont affichés dans une autre sous-fenêtre flottante.

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Representative Results

Ce travail illustre deux démonstrations d'imagerie mono-cellulaire par ATOM: une avec des cellules de mammifères (cellules mononucléaires de sang périphérique humain (PBMC) et cellules de cancer du sein (MCF-7)) et une autre avec phytoplancton (Scenedesmus et Chlamydomonas). La première expérience a été motivée par l'intérêt croissant pour la biopsie liquide pour la détection, l'énumération et la caractérisation des cellules tumorales circulantes (CTC) dans le sang 23 . La capacité de mesurer les CTC diffusés à partir des sites de tumeurs primaires vers le flux sanguin permet l'examen de la progression du cancer métastatique 24 , 25 . Cependant, des défis existent dans l'analyse CTC: (i) le nombre de CTC est significativement inférieur à la quantité exorbitante de cellules sanguines dans le sang total. Les méthodes actuelles d'identification et de récupération des CTC impliquent principalement des étapes d'enrichissement cellulaire et de séparation Class = "xref"> 26 , 27 , 28 . Cependant, les antécédents contaminants des cellules sanguines et / ou la viabilité des CTC enrichis demeurent une préoccupation pour une analyse moléculaire ultérieure ( p. Ex. Séquençage de l'ARN) 29 . (Ii) Les CTC sont très hétérogènes en termes de signatures biophysiques et biomoléculaires, limitant l'efficacité de l'enrichissement et de la détection de la CTC. À cette fin, la cytométrie de flux d'imagerie sans étiquette avec un débit élevé d'imagerie est un outil attrayant qui permet l'imagerie directe et l'identification des CTC dans une énorme population de cellules sanguines, minimisant ou même contournant les étapes d'enrichissement.

La deuxième expérience est particulièrement pertinente pour la caractérisation à grande échelle du phytoplancton, ce qui peut avoir une incidence sur les progrès dans les sciences de l'environnement ( p. Ex., La détection d'espèces nuisibles de prolifération des algues (HAB)S = "xref"> 29 et l'identification des espèces de microalgues comme sources de biodiesel renouvelables) 17 . Activé par ATOM, la capacité de l'imagerie monocellulaire à haut débit et à contraste élevé du phytoplancton pourrait être utile pour révéler l'hétérogénéité complexe en taille, en texture et en morphologie à travers différents genres et espèces.

La figure 3 montre les images de cellules de mammifères, de MCF-7 et de PBMC (débit à une vitesse de ~ 10 m / s), ainsi que des microalgues, Scenedesmus et Chlamydomonas (débitant à une vitesse de ~ 2 m / s) capturés par ATOM . Dans les quatre cas, les deux contrastes de gradient de phase opposés ont été obtenus par les deux signaux détectés asymétriquement multiplexés dans le temps (décrits à l'étape 2.3). Ils présentent tous deux une apparence pseudo-tridimensionnelle, ressemblant aux images DIC, dont chacune présente deux orientations d'observation opposées (colonnes 1 et 2 de la figure 3a c'est-à-dire les contrastes déphasés différentiels à absorption uniquement et améliorés, les colonnes 3 et 4 de la figure 3a -d ). Notez que non seulement l'ATOM sans étiquette révèle les images sans cellule sans flou, mais aussi les structures cellulaires avec un contraste élevé. Notamment, les vacuoles, les pyrénoïdes et les flagelles dans les micro-algues peuvent être clairement visualisés à la figure 3 . Cet attribut d'imagerie permet de créer de manière critique l'extraction d'un ensemble riche d'identificateurs dérivés des textures / morphologies intrinsèques cellulaires et subcellulaires pour la classification automatisée basée sur l'image.

Ce travail démontre que les propriétés biophysiques, telles que la circularité cellulaire et la taille des cellules, peuvent être utilisées pour R la classification de MCF-7 et PBMC. Notez que deux grappes sont observées dans l'échantillon MCF-7. La disponibilité d'images à contraste élevé pour tous les points de données nous permet de contrôler que l'un des grappes correspond à des fragments / débris ( Figure 4a ). Une classification similaire entre deux espèces de phytoplancton basé sur des images ATOM a également été réalisée. Ici, les résultats de la classification sont présentés sous la forme d'un diagramme de diffusion 2D visualisé par l'interface utilisateur personnalisée ( Figure 4 ). Chaque point de données annoté dans le diagramme de dispersion, correspondant à chaque cellule, peut être exploré avec différents paramètres dérivés d'ATOM. L'image ATOM correspondante peut également être affichée directement sur l'intrigue. Le gating manuel est également pris en charge dans cette interface de visualisation pour faciliter la classification et l'analyse.

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Figure 3: ATOM Image Galley des micro-algues et des cellules de mammifères à une vitesse de flux ultra-rapide (~ 2-10 m / s). (A) Scenedesmus; ( B ) Chlamydomonas; ( C ) cellules de cancer du sein, MCF-7; Et ( d ) PBMC humaine. Le Scenedesmus et les Chlamydomonas sont écoulés à ~ 2 m / s, tandis que MCF-7 et PBMC sont écoulés à 10 m / s. Les deux colonnes de gauche (colonnes 1 et 2) pour chaque type de cellule représentent deux contrastes opposés de gradient de phase. Les colonnes 3 et 4 représentent respectivement le contraste d'absorption et le contraste de gradient différentiel (amélioré). Barres d'échelle = 20 μm (en rouge). Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 4
FiGure 4: Une interface utilisateur graphique pour l'analyse cytométrique basée sur les images ATOM. Dans cette interface, l'utilisateur peut effectuer une classification et une analyse de type cellulaire en définissant différents paramètres de cellule ( par exemple, taille de cellule, circularité, densité d'absorption, etc. ) dérivés des images ATOM. Le résultat peut être représenté dans un diagramme de dispersion affiché dans le panneau central. L'accès et le contrôle de différentes options d'affichage, qui incluent la modification des paramètres et la mise à l'échelle des axes x et y (boutons de paramètres de l'axe Y et X) et la commutation entre les jeux de données (bouton Dataset), sont possibles. Les informations détaillées sur les cellules (onglet Informations sur la cellule) peuvent être lues en planant sur un point de données spécifique. Pour permettre une navigation rapide, l'utilisateur peut passer à un autre mode de visualisation et afficher simultanément toutes les images sur le diagramme de dispersion dans le panneau central (bouton de mode d'affichage). Le contrôle manuel peut également être effectué pour une analyse plus approfondie. Les points de données jaunes représentent l'échantillon de cellule MCF-7 (dans ( a </ Strong>)) et Scenedesmus (SCE) (dans ( b )), alors que les points de données rouges représentent l'échantillon humain de PBMC (dans (a)) et Chlamydomonas (CHA) (dans (b)). Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

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Discussion

Il existe plusieurs détails techniques qui nécessitent une attention particulière pendant la configuration du système ATOM. Tout d'abord, il est essentiel de noter que l'éclairage asymétrique / oblique encodé par spectralité pourrait introduire des composantes résiduelles de gradient de phase ( c'est-à-dire l'effet d'ombrage) dans le contraste d'absorption et influencer l'amélioration du contraste de gradient de phase dans ATOM. Par conséquent, cet effet d'illumination oblique devrait être réduit au minimum. Deuxièmement, il convient de souligner que le système de multiplexage temporel ou d'entrelacement de temps impliquant deux répliques n'entraîne aucun compromis significatif sur la vitesse d'imagerie ( c'est-à-dire que le taux de balayage de ligne de> MHz peut encore être maintenu), étant donné que la largeur temporelle totale De deux répliques de faisceau n'excède pas une période de balayage de ligne. Troisièmement, la configuration optimale du module intégré de fibres dispersives et d'amplificateurs dépend du gain ciblé comme spécification des amplificateurs disponibles. L'amplification optique est essentielleL au processus d'étirement du temps pour combattre la perte optique associée à GVD 22 . En principe, il peut être implémenté par n'importe quel type d'amplificateur optique, de préférence dans le format de fibre, de sorte qu'il soit compatible avec le processus d'étirement en fonction des fibres ( Figure 1b ). Des exemples pratiques d'amplificateurs optiques à base de fibres optiques incluent des amplificateurs à fibre dopée à l'erbium (EDFA, pour des longueurs d'ondes de fonctionnement de 1 500 à 1 600 nm), des amplificateurs à fibre dopée de Ytterbium (YDFA, pour des longueurs d'onde de fonctionnement de ~ 1 060 nm), des amplificateurs Raman à fibres, Et des amplificateurs paramétriques à fibre optique (FOPA, pour toute longueur d'onde de fonctionnement, en principe, tant qu'une source laser à pompe est disponible). Le bruit de l'amplificateur doit également être soigneusement pris en compte dans la conception du module. La théorie détaillée peut être vue dans la référence 8. Une configuration commune pourrait impliquer des amplificateurs de fibre multiples / en cascade insérés entre plusieurs segments de fibres dispersives (chacun a une longueur de quelques kilomètres). Pour ATOM aL'amplification du temps et du temps, en général, le gain de puissance optique typique de l'on-off devrait être d'environ 20 à 30 dB. Il convient de noter que la plage de longueur d'onde de fonctionnement est généralement limitée à ~ 800-1,550 nm, principalement en raison de la perte de fibre optique extrêmement élevée à des longueurs d'onde plus courtes ( c'est-à-dire des longueurs d'onde visibles). Par conséquent, de la même façon que la majorité des démonstrations d'imagerie étirable, l'ATOM à base de fibres ne sera pas immédiatement applicable à l'imagerie par fluorescence où les opérations de lumière visible sont encore courantes. Néanmoins, notez qu'un concept d'étirement de l'impulsion de l' espace libre ressemblant à un étirement du temps, appelé délai accéléré angulaire de l'espace libre (FACED), a récemment été utilisé pour l'imagerie ultra-rapide à balayage laser dans ATOM, ainsi que pour l'imagerie par fluorescence À des longueurs d'onde visibles 30 .

Un autre paramètre important nécessitant une considération de conception subtile est la résolution d'image. Contrairement au microscope optique classique, l'imageLa résolution de l'ATOM et l'imagerie à durée déterminée sur l'axe de la douche spectrale sont régies par trois régimes limitants 22 : (i) la résolution limitée par dispersion spatiale, qui est liée à la résolution spectrale du réseau de diffraction, désigné par δ x spatial ; (Ii) la limite d'approximation de la phase stationnaire, qui est définie comme l'ambiguïté du processus de cartographie de la longueur d'onde δ x SPA , qui varie inversement avec la racine carrée de GVD 22 ; Et (iii) la résolution limitée au photodétecteur δ x det , qui décrit la bande passante finie du photodétecteur qui pourrait également influencer la résolution spatiale finale. En général, la plus grande valeur parmi ces trois paramètres est définie comme la résolution d'image d'ATOM, δ x ( c'est-à-dire δ x = max { δ x spatial , δ SPA , δ x det }). Il est toujours souhaitable de s'assurer que la résolution finale est limitée à la dispersion spatiale ( c'est -à- dire δ x = δ x spatial > δ x SPA > δ x det ). Par conséquent, le GVD (étape 2.2.1.1) et la bande passante (étape 2.3.5) du photodétecteur doivent être suffisamment élevés pour satisfaire cette condition. D'autre part, la résolution d'image le long du sens d'écoulement est évaluée par la limite de diffraction. Ce n'est vrai que lorsque la condition d'échantillonnage du Nyquist est satisfaite ( c.-à-d., Le taux de répétition du laser (R, en Hz) et le débit des cellules (F, en m / s) doit être réglé de sorte que la taille du pixel dans La direction d'écoulement est F / R <2 δ y, où δ y est la résolution limitée par diffraction le long du sens d'écoulement). Notez que les spécifications de la grille ( p. Ex., </ Em> densité de rainure) et lentille d'objectif ( par exemple, l'ouverture numérique (NA)) doit être soigneusement conçue pour correspondre à la résolution ciblée.

Alors que la démonstration et le protocole ATOM actuels montrent que l'acquisition de données se fait par oscilloscope et que le traitement des données est suivi hors ligne, il est plus favorable d'obtenir des données, des process et même des analyses continues en temps réel, notamment en optimisant la capacité de réaliser Les capacités de capture d'image ultra-rapide et à contraste élevé apportées par ATOM. À cette fin, une unité de traitement de signal haute performance et haut débit devrait être adoptée, comme une unité de traitement graphique (GPU) et / ou une grille de grille programmable sur le terrain (FPGA), dont on a démontré qu'elle était capable de Atteindre un débit de traitement de données aussi élevé que ~ 1-10 Go / s. Ceci est compatible avec la capacité d'échantillonnage ultra-rapide d'ATOM ( c.-à-d., ~ 10 GSa / s). L'intégration d'ATOM et un traitement de données à haut débitCcelerator permet un nouveau paradigme dans les études biologiques basées sur les données, en particulier pour démêler l'hétérogénéité inconnue entre différentes cellules individuelles dans une population énorme. Une telle technologie pourrait également permettre une nouvelle génération de recherche clinique, dans laquelle des cellules aberrantes et rarissimes pendant le processus de la maladie peuvent être quantifiées de manière sans étiquette.

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Disclosures

Les auteurs n'ont rien à dévoiler.

Acknowledgments

Nous remercions M. P. Yeung pour avoir préparé le MCF-7 pour nous. Ce travail a été partiellement soutenu par des subventions du Conseil de la subvention de recherche de la Région d'administration spéciale de Hong Kong, en Chine (projets n ° 17259316, 17207715, 17207714, 17205215 et HKU 720112E), le Programme d'aide à l'innovation et à la technologie (ITS / 090/14 ), Et le Fonds de développement universitaire de HKU.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Nikon Plan Fluorite Physiology Objectives 40X Nikon MRF07420 Objective lens (Obj2)
Olympus Plan Fluorite Objective, 0.75 NA, 0.51 mm WD, 40X Olympus RMS40X-PF Objective lens (Obj1)
N-BK7 Plano-Convex Lenses Thorlabs LA1145-C For relaying spectral shower
FC/APC Fiber Collimation Package Thorlabs F220APC-1064 For outputing and collecting laser pulses
Pellicle beamsplitter Thorlabs BP145B3 For making beam replica
Protected silver mirror Thorlabs PF10-03-P01 For reflecting light
800-1650nm 12GHz single mode DC-coupled NIR Photoreceiver Newport 1544-B For converting light into electrical signal
Infiniium High-Performance Oscilloscope Agilent DSOX91604A To save the light-converted electrical signals
HI1060 optical fiber Corning HI1060 Optical fiber for time-stretch
YTTERBIUM DOPED FIBER AMPLIFIER Keopsys KPS-STD-BT-YFA-37-BO-SM-111-FA-FA Optical in-line amplifier
Holographic grating Wasatch Photonics 020305-6 Grating
Infuse/Withdraw Syringe Pumps Harvard Apparatus PHD 2000 Syringe pump for sample loading in micro-fluidic channels

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References

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Cytométrie de flux d&#39;imagerie microfluidique par détection asymétrique Microscopie optique à temps-étirement (ATOM)
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