Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Engineering
Click here for the English version

Engineering

Mikrofluidisk Imaging Flow Cytometry ved asymmetrisk deteksjon Time-stretch Optical Microscopy (ATOM)

Published: June 28, 2017 doi: 10.3791/55840
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, 1, 1, 2, 1, 1
1Department of Electrical and Electronic Engineering, The University of Hong Kong, 2Department of Mechanical Engineering, The University of Hong Kong

Summary

Denne protokollen beskriver implementeringen av et asymmetrisk deteksjonstidsoptisk optisk mikroskopisystem for enkelcellebilder i ultrafast mikrofluidisk strømning og dens anvendelser i bildeflowcytometri.

Abstract

Skalering av antall målbare parametere, som muliggjør flerdimensjonal dataanalyse og dermed høyere konfidens statistiske resultater, har vært hovedtrenden i den avanserte utviklingen av flytcytometri. Spesielt tillater det å legge til høyoppløselig bildebehandlingskapasitet for den komplekse morfologiske analysen av cellulære / subcellulære strukturer. Dette er ikke mulig med standard flow cytometre. Det er imidlertid verdifullt for å fremme kunnskapen om mobilfunksjoner og kan være til nytte for livsvitenskapelig forskning, klinisk diagnostikk og miljøovervåking. Ved å inkorporere bildebehandlingskapasiteter i flytcytometri, kompromitterer analysen gjennomstrømning, hovedsakelig på grunn av begrensningene i hastighet og sensitivitet i kamerateknologien. For å overvinne denne hastigheten eller gjennomstrømningsutfordringen som vender imaging flow-cytometri, samtidig som bildekvaliteten opprettholdes, har asymmetrisk deteksjonstids-optisk mikroskopi (ATOM) blitt demonstrert for å muliggjøre høy kontrast, single-celle-bildeMed subcellulær oppløsning, ved en avbildning gjennomstrømning så høy som 100.000 celler / s. Basert på bildebehandlingskonceptet med konvensjonell tidsstrekning, som avhenger av all-optisk bildekoding og gjenfinning gjennom bruk av ultrafast bredbånds laserpulser, fremmer ATOM videre bildebehandling ved å forbedre bildekontrasten til umerkede / ufarvede celler. Dette oppnås ved å få tilgang til fase-gradientinformasjonen til cellene, som er spektralkodet til single-shot bredbåndspulser. Derfor er ATOM spesielt fordelaktig i høymålinger av enkeltcellet morfologi og tekstur - informasjon som indikerer celletyper, tilstander og jevne funksjoner. Til syvende og sist kan dette bli en kraftig bildebehandlingsstrømcytometriplattform for biofysisk fenotyping av celler, som komplementerer den nåværende state-of-the-art biokjemiske markørbasert cellulær analyse. Dette arbeidet beskriver en protokoll for å etablere nøkkelmodulene til et ATOM-system (fra optisk frontend til data sProsessering og visualiseringsbackend), samt arbeidsflyten av bildebehandlingsstrømcytometri basert på ATOM, ved bruk av humane celler og mikroalger som eksemplene.

Introduction

Optisk bildebehandling presenterer et kraftig verktøy og cellebasert analyse for (nesten) ikke-invasivt å visualisere den detaljerte romlige fordeling av mange cellulære / subcellulære komponenter, og dermed avdekke en rekke morfologiske, biofysiske og biomolekylære signaturer av celler. Denne muligheten til å trekke ut høyinnholdsinformasjon fra enkeltceller har imidlertid generelt blitt kompromittert når en enorm og heterogen cellepopulasjon måtte undersøkes. Dette markerer en felles avveiing i cellebaserte analyser mellom måleutgang og innhold. Et bemerkelsesverdig eksempel er at å legge imaging evne til å flyte cytometri har resultert i en nedskalering av gjennomstrømning med minst 1-2 størrelsesordener sammenlignet med den av de klassiske ikke-avbildende strømningscytometre. Selv om det kunne tilby komplisert morfologisk enkeltcelleanalyse som ikke er mulig med standardstrømcytometre 1 , mangler bildebehandlingsstrømcytometri generelt tilstrekkelig gjennomstrømning til idInnrømme cellular heterogenitet med høy statistisk tillit. Dette er nødvendig for nye funn i biologi og for å få en forståelse av patogenesen av sykdommer. Den viktigste tekniske utfordringen ligger i den iboende hastighetsgrensen som er pålagt ved de vanlige optiske bildestrategiene: laserstråleskanning, ( f.eks. Ved galvanometriske speil) og / eller bildesensorer ( f.eks. Ladetilkoblet enhet (CCD) og komplementær metall- Oksid halvleder (CMOS)). Laserskanningshastigheten er begrenset av den mekaniske treghet av skanningsspeilene, mens rammemengden på CCD eller CMOS er begrenset av den grunnleggende avstanden mellom bildehastighet og følsomhet ( dvs. økning av rammebelastningsledningene til redusert signalvarslingsfølsomhet , og vice versa).

Basert på en all-optisk, ultrafast bildekodingsmekanisme, har optisk tidsstrekning av bilde blitt vist som en attraktiv plattform for høy gjennomstrømningOmeters, uten behov for konvensjonelle bildesensorer eller mekanisk laserskanning 2 , 3 . Detaljert beskrivelse av arbeidsprosjektet for tidsstrengsimaging finnes i referanser 4 , 5 , 6 , 7 . Kort sagt består det av to utskiftelige kartleggingsstrinn: (i) spektralkoding (bølgelengde-rom kartlegging), hvor de spatiale koordinatene til det avbildede prøven er kartlagt til forskjellige bølgelengder over spektrumet til den lyspulserte strålen 8 , 9 , Og (ii) en dispersiv Fourier-transformasjon (bølgelengde-tidskartlegging) 9 , hvor bølgelengdekomponentene av individuelle laserpulser transformeres (strekkes) via gruppespredning (GVD) i temporære (bølgelengde-feidede) bølgeformer ( figur 1 ). En viktigFunksjon av tidstrømsavbildning er optisk forsterkning, som spiller en kritisk rolle i bekjempelse av tap av følsomhet på grunn av ultrafast fotodeteksjon og GVD-tap, og forbedrer dermed signalstøyforholdet (SNR) uten å bli forurenset av fotodetektorens støy 9 . Siden hver laserpuls koder for en linjeskanning av det avbildede prøven, som er ortogonalt for den ensrettede strømning av cellene, bestemmes en effektiv linjeskannehastighet av laserrepetisjonen, som vanligvis er over 10 MHz. Denne ultrafast operasjonen gjør det mulig å oppnå uskarpt, enkeltcellet bildeopptak ved en gjennomstrømning på 10.000-100.000 celler / s ( dvs. 10-100 ganger høyere enn konvensjonell bildebehandlingsstrømcytometri). Som et resultat av dette kunne tids-strekkbilding finne unike applikasjoner i høy gjennomstrømning, single-cell, bildebasert screening, spesielt når det er behov for å identifisere ukjent heterogenitet eller sjeldne / avvikende celler innenfor en betydelig befolkning (tusenvis til millioner av cel Ls), som sjeldne kreftcellescreening 10 eller mikroalgerklassifisering 11 .

Time-stretch-bildebehandling er hovedsakelig avhengig av bildefangst i lysfelt (BF), hvorfra bildekontrast genereres ved lysspredning og absorpsjon fra cellene 2 , 3 , 9 , 10 , 11 . Slike etikettfrie, enkeltcellebildende evner kan omgå de skadelige effekter som er forbundet med fluorescerende etiketter, slik som cytotoksisitet og fotoblekking, og likevel gi verdifull informasjon for enkelcelleanalyse basert på cellulær og subcellulær tekstur og morfologi. Disse etikettfrie parametrene har vist seg å være effektive for dypbildeklassifisering av celler, spesielt når en enorm cellepopulasjon er tilgjengelig 11 ,"Xref"> 12. Imidlertid unngår BF-bildebehandling i mange tilfeller ikke tilstrekkelig kontrast til å avsløre den detaljerte morfologien til de etikettfrie transparente cellene. Ulike etikettfrie, fasekontrast-, tidsstrengede bildemodeller har blitt utviklet for å forbedre bildekontrasten ved ultrafast rammene 13 , 14 , 15 . Blant disse teknikkene ble det utviklet asymmetrisk deteksjonstids-optisk mikroskopi (ATOM) for å avsløre fasegradienten (differensial-interferens-kontrast- (DIC) -lignende) kontrast basert på et konsept som ligner på Schlieren-fotografering, slik at etikett- Fri, høy kontrast avbildning av enkeltceller ved ultrahøy mikrofluidisk hastighet (opptil 10 m / s) 16 . Denne effekten kan lett genereres gjennom skrå gjenkjenning eller belysning ved delvis å blokkere den bildekodede strålebanen eller vippe strålen før fotodeteksjon. En annen fordel med ATOM er dens aEvne til samtidig å skaffe seg to fase-gradient kontraster langs motsatte retninger. Intensitets-subtraksjon og summering av to motsatte-kontrastbilder gir differensialfase-gradientkontrast og absorpsjonskontrast henholdsvis fra samme linjeskanning. Dette arbeidet presenterer en detaljert protokoll som beskriver implementeringen av ATOM, inkludert etableringen av det optiske oppsettet, prøveutarbeidelsen og datainnsamlingen og visualiseringen. Spesielt demonstrerer dette arbeidet ATOM-operasjonen med enkeltcellet bildebehandling av humane blodceller, kreftceller og fytoplankton (mikroalger). Dette fremhever ATOMs anvendelighet til bildebehandlingstrømcytometri, ikke bare i den biomedisinske arenaen, men også i marine- og biodrivstoffforskning 17 , 18 .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Prøveforberedelse

  1. Prøvepreparering (vedhengende celler; MCF-7 celler)
    1. Ta ut cellekulturretten fra inkubatoren og tøm kulturmediet.
    2. Skyll cellene på en tallerken med 1x fosfatbuffert saltvann (PBS) for å fjerne overdreven kulturmedium.
    3. Tilsett 3 ml av en oppløsning på 0,25% trypsin til dyrkningsretten (diameter 100 mm) og sett den i en 37 ° C, 5% CO 2 inkubator i 4 min.
      MERK: Trypsinet løser det klebende protein av cellene slik at de vil løsne seg fra kulturretten.
    4. Sjekk om alle cellene er løsrevet fra kulturretten ved hjelp av et lysmikroskop (10X objektiv). Hvis ikke, rist forsiktig cellekulturretten.
    5. Tilsett 4 ml av standardkulturmediet (formulert med 89% Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), 10% føtalt bovint serum (FBS) og 1% penicillin-streptomycin (PS)) for å stoppe virkningen av trypsinet.
    6. TAvlede hele blandingen (celler i trypsinoppløsning og kulturmedium) til et sentrifugerør og sentrifuge i 5 minutter ved 200 x g.
    7. Fjern alt væsken og resuspender cellene i 1 ml 1x PBS (pH-verdi: 7,4, forvarmet til 37 ° C).
  2. Prøveforberedelse (dyrkede mikroalger)
    1. Overfør dyrkede mikroalger og kulturmedium ( f.eks. Sjøvann, agar eller ferskvann) til nye glasskulturrør (~ 15 ml) i et volumforhold (mikroalger til kulturmedium) på 1: 5 for å etablere Et nytt subkulturmedium.
    2. Plasser glasskulturrørene i et støvtikkert kammer under konstant belysning ved kunstig belysning fra lysstoffpærer i henhold til en lys / mørk (LD) syklus (vanligvis LD 16: 8) i 72 - 120 timer før forsøket.
    3. Overfør de subkulturerte prøvene til et sentrifugerør og bland godt.

2. ATOM System Setup


Figur 1: Skjematisk av et ATOM-system. En bredbåndspulserende laser brukes til å levere ultrasnelle impulser til ( a ) en tidsstrekningsmodul og ( b ) en in-line optisk forsterkermodul. Time-stretch modulen genererer et tog av tidsmessige bølgeformer, hver av dem er kopien av bølgelengdespektret til laserkilden ( dvs. bølgelengde til tidskartlegging). Forsterkermodulen brukes til å kompensere for puls-strekk (dispersiv) tap. Den strakte puls blir deretter ( c ) romlig dispergert av et diffraksjonsgitter som danner en 1D spektral dusjbelysning hvor individuelle bølgelengdekomponenter blir relayed av et relélinsepar og fokusert av objektivlinsen på forskjellige posisjoner på den strømende celle inne i ( d) ) Mikrofluidisk chip. Dette er prosessen med spektralkoding. DeSpektralkodet lys vil igjen passere cellen gjennom en annen objektivlins og et speil, som vender tilbake til diffraksjonsgitteret og rekombinerer som en romlig ufordampet pulserende stråle. Denne bildekodede pulserende strålen er da ( E ) delt i to baner, slik at begge bjelker delvis er blokkert med ( f ) knivkanten, men fra motsatte retninger, før de kobles til fibrene. Disse to bjelkene representerer de to (motsatte) kodede fasegradientkontrastene til det endelige bildet. For samtidig gjenkjenning av begge signalkontrakter gjennomgår et av signalene ( g ) en tidsforsinkelseslinje, slik at de to signalene blir multiplexert (interleaved) i tid. En høyhastighets fotodetektor og sanntids-oscilloskop brukes til datainnsamling. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

  1. Time st Retch-modul
    1. Bruk en bredbånds femtosekund (fs) eller pikosekund (ps) pulserende laser kilde med en anbefalt senterbølgelengde i det nære infrarøde området (NIR), 800-1,500 nm.
      MERK: Den typiske nødvendige pulsbredden kan variere fra under 100 fs til noen få ps. Detaljert krav til pulserte laserkilder kan ses i referanse 4 og 5. Viktige beregninger er uthevet i tabell 1 .
      1. Forsikre deg om at laserkilden har en høy repetisjon, som skal være i megahertz-regimet ( f.eks. Titalls MHz) for å sikre ultrafast bildebehandling i ATOM. Still også toppmaksjonslaserkraften godt under skaderens strømkilde, ca. 1 kW.
      2. Sørg for god temporal og spektral stabilitet i pulserende laserkilde.
        MERK: Typisk toleranse i spektral amplitude-svingning bør holdes innenfor 1,2% 19 , 20 ,Ss = "xref"> 21, som oppnådd av fibermoduslåst laser i dette oppsettet.
        MERK: Den optiske båndbredden til laserkilden forventes å være 10-100 nm, noe som er viktig for å sikre tilstrekkelig bildefelt (FOV) i single-cell imaging 21 .
    2. Ved hjelp av en fiberkollimator kobler du den laserpulserte strålen til en enkeltdispersjonsdispersisk optisk fiber, hvor pulser strekkes ut via gruppehastighetsdispersjon (GVD) ( figur 1a ).
      MERK: Dette er prosessen hvoretter spekteret av hver puls er kortlagt på tid som en bølgelengde-feid bølgeform ( dvs. bølgelengde til tidskartlegging).
      MERK: Den totale krevde GVD skal være tilstrekkelig til å sikre at den totale ATOM-bildekonsesjonen ikke påvirkes av bølgelengde-til-tid-kartleggingsprosessen (Se diskusjonen). Typisk, i NIR-området, bør GVD være godt utover 0,1 ns / nm. For eksempel er en enkeltmodusfiber anvendt i denneS nåværende oppsett gir en total GVD på 0,38 ns / nm rundt bølgelengden på 1,060 nm (en total fiberlengde på 10 km).
  2. Spektralkodingsmodul
    1. Konstruer et optisk mikrosystem for å utføre spektralkodet bildebehandling av cellene som strømmer langs mikrofluidkanalen, som illustrert i figur 1 .
      MERK: Nøkkelkomponentene i dette optiske mikroskopet inkluderer: (1) et diffraksgitter, en teleskopisk relélinsemodul (RL1 og RL2 på figur 1 ) og to objektivlinser (Obj1 og Obj2 i Figur 1 ).
      1. Først belyser den tidsutstrakte og kollimerte strålen på et diffraksjonsgitter (transmisjonstypegitter brukes i dette oppsettet) for å generere en spektraldusj ( figur 1c ).
        MERK: Strømmen til den diffrakterte strålen ( dvs. diffraksjonseffektivitet) kan maksimeres ved å justere tHan gitterretningen stengt for Littrow-konfigurasjonen.
      2. Konfigurer de to relélinsene (RL1 og RL2) i et 4-f bildesystem ( dvs. plasser diffraksjonsgitteret på brennpunktet til RL1 og skille RL1 og RL2 med en avstand lik summen av deres brennvidder. Spektraldusjen Vil da bli avbildet på bakfokusplanet til objektivlinsen Obj1).
      3. Juster spektraldusjen nøye for å fylle Obj1, slik at spektraldusjen kan projiseres og fokuseres på mikroskopets bildeplan.
        MERK: Her er NA av objektivlinsen (Obj1 i Figur 1 ) 0.75.
      4. Plasser en annen objektivlins (Obj2 i Figur 1 ) med et lignende NA og et flyspeil ved bakåbningen på denne objektivlinsen (Obj2) slik at spektralbrønnsstrålen kan justeres for å passere bildeplanet og returnere til Diffraksjonsgitter.
      5. JustereParet av objektive linser (Obj1 og Obj2) slik at deres fokusplaner overlapper hverandre. Kontroller om spektraldusjen dobbeltkaster bildeplanet på samme sted og vender tilbake til gitteret etter samme vei. Hvis ikke, utfør ytterligere justering og innstilling av det optiske systemet.
        MERK: Det returnerte lyset skal passere gjennom en ekstra strålesplitter, slik at lyset kan overføres til en asymmetrisk deteksjonsmodul.
      6. Juster den optiske forsterkerøkningen på et passende nivå slik at det resulterende signalet kan detekteres av fotodetektoren med en god SNR, som typisk er> 10 dB.
      7. Plasser og juster plasseringen av mikrofluidisk brikke på prøveplattformen og sørg for at spektraldusjen, og dermed avbildningsområdet, plasseres over mikrofluidkanalen ( figur 1d ).
        MERK: Spektraldusjen er opplyst ortogonalt til strømningsretningen til fluidene inne i mMikrofluidisk chip, slik at den flytende bevegelsen automatisk utfører todimensjonale (2D) skanninger.
  3. Asymmetrisk deteksjonsmodul
    1. Plasser en ekstra strålesplitter for å skille den avbildede kodede strålen i to ( Figur 1e ).
      MERK: Hver stråle replika er delvis blokkert av en knivkant.
    2. Mål og ta opp den optiske effekten av strålen før stråleblokken. Deretter plasserer du knivkanterne manuelt (montert på en lineær oversettelsestrinn) slik at de grovt blokkerer halvparten av strålen (ved visuell inspeksjon). Deretter bruker du den optiske effektmåleren til å overvåke strålekraften mens du finjusterer posisjonen til knivkanten ved å oversette dem over bjelken.
      MERK: Det foreslås at den optimale posisjonen er hvor kraften reduseres med ~ 50% av den opprinnelige verdien ( dvs. det ulåste tilfellet). Dette er betingelsen som gir den beste kombinasjonen av bildesignalStyrke og bildekontrastforbedring.
    3. Gjenta trinn 2.3.2 for en annen strålereplikat. Legg merke til at orienteringen til den delvise stråleblokken for en stråle skal være motsatt i forhold til den andre strålen ( figur 1f ).
    4. Koble de to delvis blokkerte bjelkene inn i to separate, single-mode fiberarmer gjennom to-fiberkollimatorer.
      MERK: En av armene har en ekstra fiberlengde som tjener som en fiberbasert forsinkelseslinje, for å introdusere en tidsforsinkelse med hensyn til den andre kopien (uten forsinkelseslinjen) ( figur 1g ). Begge er rettet til en enkelt fiber av en fiberkopler før fotodeteksjon. Tidsforsinkelsen bør være lang nok til å temporært separere de to replikene og kort nok til å unngå temporal overlapping med neste bølgeform ( dvs. de to replikene er alltid tidsinterleaved og tidsmultiplexert i en enkelt fiber før deteksjonen ( figur 2a )).
    5. LokkTure og digitalisere de oppdagede optiske signalene med sanntids-oscilloskopet. Merk at båndbredden og dermed prøvetakningsgraden til oscilloskopet skal være tilstrekkelig høy til å sikre at de ikke påvirker den endelige bildeoppløsningen (Se diskusjonen).
      MERK: Her med GVD på 0,38 ns / nm, er det nødvendig med en oppkjøpsbåndbredde og samplingshastighet på henholdsvis> 20 GHz og> 40 GSa / s.

3. Eksperimentelle prosedyrer

  1. Prøvebelastning
    1. Utfør celletelling under et konvensjonelt fasekontrastmikroskop i et standardhemocytometer.
    2. Juster celletettheten ved å fortynne med 1x PBS (med kildevann for mikroalger) og bland godt med en pipette.
      MERK: Den foreslåtte konsentrasjonen er fra 10 5 til 10 6 celler / ml.
    3. Monter den mikrofluidiske brikken på prøveplattformen til det optiske bildesystemet.
      MERK: Den mikrofluidiskeChippen er først og fremst laget av polydimetylsiloksan (PDMS) og er fremstilt ved bruk av standard replikstøping. Den mikrofluidiske kanalen er utformet med en asymmetrisk buet kanal for å generere den inertielle strømningsfokuseringseffekten slik at cellene kan strømme i en enkelt fil i bildeseksjonen (med en dimensjon på 80 μm x 80 μm (høyde x bredde)) med høy hastighet .
    4. Overfør tetthetsjustert celleoppløsning til en 10 ml sprøyte.
    5. Koble sprøyten til innløpet til mikrofluidic-brikken og et sentrifugalrør til utløpet av mikrofluidisk brikke for avhending.
    6. Monter sprøyten på en sprøytepumpe og sett en passende strømningshastighet for å gi ønskelig gjennomstrømning og unngå å påføre overdreven skjærkraft mellom cellene og kanalen.
      MERK: Prøvens lineære hastighet skal ligge innenfor 0,5 og 10 m / s. Vær oppmerksom på at det før det faktiske bildeopptaket, er ofte nødvendig å finjustere systemet, når det gjelder å maksimereBilde signalstyrke og optimalisere bildefokusering ved å gjenta trinn 2.2.1.4-2.2.1.6.

4. Dataoppkjøp

  1. Angi et passende antall datapunkter som skal lagres for hvert eksperiment. Antall datapunkter som skal lagres, avhenger av størrelsen og strømningshastigheten til prøvene.
    MERK: Det er vanligvis satt til 8-16 millioner prøvepunkter under en samplingshastighet på 80 GSa / s.
  2. Oppbevar og lagre dataene i en batchmodus ved hjelp av oscilloskopet.

5. Backend Processing

Figur 2
Figur 2: Rekonstruksjon av ATOM-bilder fra Line Scan Time Trace. For å rekonstruere ATOM-bildene med absorpsjonskontrast og differensial (forbedret) fase-gradientkontrast, trekkes to sett med tidsutstrakte pulser (se lilla og grønne pulser) fra( A ) det tidsmultiplexerte temporære bølgeformsporet og deretter digitalt segmentert og stablet for å danne ( b ) to 2D-bilder som viser de to motsatte fasegradientkontrastene. Legg merke til at det kreves en skjæringsoperasjon for å danne ( c ) de forvrengningsfrie bildene ved å kompensere for delindeksskiftet på grunn av avrullingsfeilen i estimeringen av laserrepetisjonen. Ved å subtrahere ( d ) raw line-scan fra laserkildens spektralintensitetskonvolutt, kan bakgrunnen til bildene fjernes. ( G ) Et absorpsjonskontrastbilde kan oppnås ved hjelp av en pixel-for-pixelintensitetssammendrag av bilder ( e ) og ( f ), mens ( h ) en differensiell fase-gradient kontrastbilde kan oppnås ved subtraksjon av bilder (e ) Og (f). Vennligst klikk her for å se en større versjonAv denne figuren.

  1. Overfør dataene fra oscilloskopet til datamaskinene for offline bildeoppbygging.
    MERK: Her lagres dataene i en bærbar harddisk og overføres manuelt mellom oscilloskopet og prosessdatamaskinene. Kapasiteten til harddisken skal være over 500 GB for hvert eksperiment.
    1. Bruk nøkkelbildeoppbyggingsrutinen til å stables line-scanene digitalt for å danne et 2D-bilde ( figur 2 ).
      MERK: Det tilpassede programmet (i MATLAB) produserer deretter to asymmetriske gjenkjenningsbilder ved å separere de to tidsmultiplexerte datasettene (lilla og grønne bølgeformer i figur 2 ).
      1. Hent et differensial fasegradientkontrastbilde ved å subtrahere intensiteten til de to asymmetriske gjenkjenningsbildene; Et absorpsjonskontrastbilde kan oppnås ved å legge til de to asymmetriske gjenkjenningsbildene. Se utvalgte bilder av MCF-7 og mikroalger iFigur 3 . Merk at bakgrunnsprofilene til de enkelte bildene først skal elimineres, og intensiteten skal normaliseres før bildesummering og subtraksjonsoperasjoner.
    2. Generer et bibliotek med parametere avledet fra bildene, for eksempel cellevolum, sirkularitet og absorpsjonsdensitet, etc. for videre analyse.
  2. Skriv inn databiblioteket i datavisualiseringsplattformen ( Figur 4 ).
    1. Last inn biblioteket med parametere og de tilsvarende rekonstruerte bildene til visualiseringsgrensesnittplattformen.
    2. Still aksene som parametere av interesse.
      MERK: Parametrene er problemspesifikke og defineres av brukeren. De er avledet fra ATOM-bildene ved MATLAB-programmet. Her er den optiske absorpsjonsdensiteten til cellen, celleområdet, cellevolumet og celle-sirkulariteten tilgjengelig for seleksjon. Velg datasettet som skal vises slik at hvert cellebilde kan visualiseres som et annet datapunkt på scatterplottet.
    3. Flytt musepekeren til hvert punkt, slik at det tilsvarende bildet og andre parametere vises i et flytende undervindu.
      MERK: Axene kan endres mellom lineære og logaritmiske skalaer på en interaktiv måte.
    4. Utfør ytterligere analyse av eventuelle undergrupper av datasettet ved å manuelt gating på scatter plot.
      MERK: Histogrammet i hver parameter i gatedundersettet kan plottes mot det hele biblioteket. De separate histogrammene vises i et annet flytende undervindu.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Dette arbeidet illustrerer to single-cell imaging demonstrasjoner av ATOM: ett med pattedyrceller (humant perifert blod mononukleær celle s (PBMC) og brystkreftceller (MCF-7)) og en annen med fytoplankton s (Scenedesmus og Chlamydomonas). Det første forsøket ble motivert av den økende interessen for væskebiotikk for detektering, oppregning og karakterisering av sirkulerende tumorceller (CTC) i blodet 23 . Evnen til å måle CTC som spredes fra primære svulststeder til blodstrømmen, muliggjør undersøkelse av metastatisk kreftprogresjon 24 , 25 . Utfordringer eksisterer imidlertid i CTC analyse: (i) CTC-tellingen er betydelig lavere enn den ublu mengden blodceller i helblod. Nåværende metoder for å identifisere og gjenvinne CTCs involverer for det meste celleberigelse og separasjonstrinn Class = "xref"> 26 , 27 , 28 . Imidlertid forblir den forurensende bakgrunnen fra blodceller og / eller levedyktigheten til de berikede CTCene en bekymring for etterfølgende molekylær analyse ( f.eks. RNA-sekvensering) 29 . (Ii) CTC er svært heterogene med hensyn til både biofysiske og biomolekylære signaturer, og begrenser effektiviteten av CTC-anrikningen og deteksjonen. For dette formål er etikettfritt bildebehandlingsstrømcytometri med høyt bildefremmende gjennomslag et attraktivt verktøy som muliggjør direkte imaging og identifikasjon av CTC i en enorm populasjon av blodceller, minimerer eller til og med omkjører anrikningstrinnene.

Det andre eksperimentet er spesielt relevant for storskala fytoplankton karakterisering, noe som kan påvirke fremskritt innen miljøvitenskap ( f. Eks. Påvisning av skadelige algblomstrende (HAB) arterS = "xref"> 29 og identifisering av mikroalgiske arter som fornybare biodieselkilder) 17 . Aktivert av ATOM, muligheten for høy gjennomstrømning og høy kontrast single-cell imaging av fytoplankton kan være verdifull for å avsløre komplekse heterogeniteten i størrelse, tekstur og morfologi over forskjellige slekt og arter.

Figur 3 viser bilder av pattedyrceller, MCF-7 og PBMC (flyter med en hastighet på ~ 10 m / s), samt mikroalger, Scenedesmus og Chlamydomonas (flyter med en hastighet på ~ 2 m / s), fanget av ATOM . I alle fire tilfeller ble de to motsatte fasegradientkontrasten oppnådd ved de to tidsmultiplexerte, asymmetriske detekterte signalene (beskrevet i trinn 2.3). De viser begge et pseudo-tredimensjonalt utseende, som ligner DIC-bildene, som hver viser to motsatte skyggingsretninger (kolonne 1 og 2 i figur 3a dvs. kun absorpsjons-bare og forbedrede differensielle fase-gradientkontraster, kolonne 3 og 4 i figur 3a -d ). Vær oppmerksom på at ikke bare ATO-etiketten kan vise utrykkfrie enkeltcellebilder, men også karakterisere mobilstrukturer med høy kontrast. Spesielt kan vakuolene, pyrenoidene og flagellaen i mikroalgerene tydeligvis visualiseres i figur 3 . Dette bildeattributtet muliggjør kritisk utvinning av et rikt sett med identifikatorer avledet fra de inneboende cellulære og subcellulære teksturer / morfologier for automatisert bildebasert klassifisering.

Dette arbeidet viser at biofysiske egenskaper, som cellesirkularitet og cellestørrelse, kan brukes for R klassifiseringen av MCF-7 og PBMC. Merk at to klynger observeres i MCF-7-prøven. Tilgjengeligheten av bilder med høy kontrast for alle datapunkter gjør det mulig å undersøke at en av klusene tilsvarer fragmenter / rusk ( figur 4a ). En lignende klassifisering mellom to arter av fytoplankton basert på ATOM-bilder ble også utført. Her blir klassifikasjonsresultatene presentert i en form av et 2D-scatterplot visualisert av det tilpassede brukergrensesnittet ( figur 4 ). Hvert annotert datapunkt i scatterplot, som svarer til hver celle, kan undersøkes videre med forskjellige parametere avledet fra ATOM. Det tilsvarende ATOM-bildet kan også vises interaktivt direkte på plottet. Manuell gating støttes også i dette visualiseringsgrensesnittet for å lette videre klassifisering og analyse.

Iles / ftp_upload / 55840 / 55840fig3.jpg "/>
Figur 3: ATOM Image Galley av mikroalger og mammale celler ved en ultrafast flytende hastighet (~ 2-10 m / s). ( A ) Scenedesmus; ( B ) klamydomonas; ( C ) brystkreftceller, MCF-7; Og ( d ) human PBMC. Scenedesmus og Chlamydomonas strømmer ved ~ 2 m / s, mens MCF-7 og PBMC strømmer ved 10 m / s. De to venstre kolonnene (kolonne 1 og 2) for hver celletype representerer to motsatte fasegradientkontraster. Kolonn 3 og 4 representerer henholdsvis absorpsjonskontrast og differensial (forbedret) fase-gradientkontrast. Skalestenger = 20 μm (i rødt). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 4
FiGure 4: Et grafisk brukergrensesnitt for cytometrisk analyse basert på ATOM-bilder. I dette grensesnittet kan brukeren utføre celleklassifisering og analyse ved å definere forskjellige celleparametere ( f.eks. Cellestørrelse, sirkularitet, absorpsjonsdensitet, etc. ) avledet fra ATOM-bildene. Resultatet kan representeres i et spredningsdiagram som vises i midtpanelet. Tilgang til og kontroll av ulike skjermalternativer, som inkluderer endring av parametere og skalering for x- og y-aksen (X- og Y-aksens parameterknapper) og bytte mellom datasett (Datasett-knapp), er mulig. Detaljert celleinformasjon (Celleinformasjon-fanen) kan leses ved å svinge på et bestemt datapunkt. For å aktivere rask navigasjon, kan brukeren bytte til en annen visningsmodus og samtidig vise alle bilder på scatterplot i midtpanelet (Vise modus-knapp). Manuell gating kan også utføres for videre analyse. Gule datapunkter representerer MCF-7 celleprøven (i ( a </ B )), mens de røde datapunktene representerer det humane PBMC-prøven (i (a)) og Chlamydomonas (CHA) (i (b)). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Det er flere tekniske detaljer som krever spesiell oppmerksomhet under ATOM-systemoppsettet. For det første er det viktig å merke seg at asymmetrisk / skrå spektralkodet belysning kunne introdusere resterende fase-gradientkomponenter ( dvs. skyggingseffekten) i absorpsjonskontrasten og påvirke forsterkningen av fasegradientkontrast i ATOM. Derfor bør denne effekten av skrå belysning minimeres. For det andre bør det understrekes at tidsmultiplekserings- eller tidsinterleaving-ordningen med to replikaer ikke resulterer i noe signifikant kompromiss på bildehastigheten ( dvs. linjeskannehastigheten på> MHz kan fortsatt opprettholdes), gitt at den totale temporale bredden Av to stråle-replikaer overstiger ikke en linje-scan periode. For det tredje avhenger den optimale konfigurasjonen av den integrerte modulen av dispersiv fiber og forsterkere av den målrettede forsterkningen som spesifikasjonen av de tilgjengelige forsterkere. Optisk forsterkning er essentiaJeg går i tidsprosessen for å bekjempe det optiske tapet som er forbundet med GVD 22 . I prinsippet kan den implementeres av en hvilken som helst type optisk forsterker, fortrinnsvis i fiberformatet, slik at den er kompatibel med den fiberbaserte, tidsstrekningsprosessen ( figur 1b ). Praktiske eksempler på optiske fiberbaserte optiske forsterkere inkluderer erbiumdopede fiberforsterkere (EDFA, for operasjonsbølgelengder på ~ 1500-1,600 nm), ytterbiumdopede forsterkere (YDFA, for operasjonsbølgelengder på 1,060 nm), fiberramanforsterkere, Og fiberoptiske parametriske forsterkere (FOPA; for en hvilken som helst operasjonsbølgelengde, i prinsippet så lenge en pumpelaserkilde er tilgjengelig). Forsterkerens støy må også vurderes nøye i modulutformingen. Detaljert teori kan ses i referanse 8. En vanlig konfigurasjon kan innebære flere / kaskadefiberforsterkere som er satt inn mellom flere dispersive fibersegmenter (hver har en lengde på noen få km). For ATOM aNd tidstrekning av bilder generelt, bør den typiske on-off optisk effektforsterkning være rundt 20-30 dB. Det skal bemerkes at operasjonsbølgelengdeområdet vanligvis er begrenset til ~ 800-1,550 nm, hovedsakelig på grunn av det overordentlig høye optiske fibertapet ved kortere bølgelengder ( dvs. synlige bølgelengder). Derfor, på samme måte som flertallet av tidstreningsbildedemonstrasjonene, vil fiberbasert ATOM ikke være umiddelbart anvendelig for fluorescensbilder der synlig lysoperasjoner fortsatt er vanlig. Ikke desto mindre må du være oppmerksom på at et fri- puls-strømmende konsept som ligner tidsstrekning, kalles fritt plass vinkelkirpforsterket forsinkelse (FACED), har nylig blitt brukt til ultrasnabb laserskanning i ATOM, samt for fluorescensbilder Ved synlige bølgelengder 30 .

En annen viktig parameter som krever subtile design hensyn er bildeoppløsning. I motsetning til klassisk lysmikroskopi, bildetOppløsning av ATOM og generell tidsstrekning imellom spektral dusjakse styres av tre begrensningsregimer 22 : (i) den spatial-dispersjonsbegrensede oppløsning som er relatert til spektraloppløsningen av diffraksjonsgitteret betegnet som δ x romlig ; (Ii) den stasjonære fase tilnærming grensen, som er definert som tvetydigheten av bølgelengde-tids kartlegging prosess δ x SPA , som omvendt skalerer med kvadratroten av GVD 22 ; Og (iii) fotodetektorbegrenset oppløsning δ x det , som beskriver den endelige båndbredden til fotodetektoren som også kan påvirke den endelige romlige oppløsningen. Generelt er den største verdien blant disse tre parametrene definert som bildeoppløsningen til ATOM, δ x ( dvs. δ x = maks { δ x romlig , δ SPA , δ x det }). Det er alltid ønskelig å sikre at den endelige oppløsningen er romlig-spredningsbegrenset ( dvs. δ x = δ x romlig > δ x SPA > δ x det ). Derfor må både GVD (trinn 2.2.1.1) og båndbredden (trinn 2.3.5) av fotodetektoren være tilstrekkelig høy til å tilfredsstille denne tilstanden. På den annen side blir bildeoppløsningen langs strømningsretningen evaluert av diffraksjonsgrensen. Dette er bare sant når Nyquists prøvetilstand er tilfredsstilt (det vil si at repeteringshastigheten til laseren (R, i Hz) og strømningshastigheten til cellene (F, i m / s) skal settes slik at pikselstørrelsen i Strømningsretningen er F / R <2 δ y, hvor δ y er diffraksjonsbegrenset oppløsning langs strømningsretningen). Legg merke til at gitterets spesifikasjoner ( f.eks. </ Em> groove density) og objektivlinsen ( f.eks. Den numeriske blenderåpningen (NA)) skal være nøye utformet for å matche den målrettede oppløsningen.

Mens den nåværende ATOM-demonstrasjonen og protokollen viser at datainnsamlingen er utført av oscilloskop, og databehandlingen blir fulgt frakoblet, er det mer gunstig å oppnå sanntids kontinuerlig datainnsamling, prosessering og til og med analyse, spesielt ved å utnytte evnen til å oppnå De ultrafaste og høykontrastbaserte bildeopptakene som er tatt med av ATOM. Til dette formål bør en høyytelses-og høy-gjennomgående signalbehandlingsenhet vedtas, for eksempel en grafisk behandlingsenhet (GPU) og / eller en feltprogrammerbar gate-array (FPGA) som har blitt vist å ha evne til å Oppnå en dataprosessering så høy som ~ 1-10 GB / s. Dette er kompatibelt med ATOMs ultrafrekvente prøvetakingsevne ( dvs. ~ 10 GSa / s). Integrasjonen av ATOM og en high-throughput databehandling aCcelerator muliggjør et nytt paradigme i data-drevne biologiske studier, spesielt i å unraveling den ukjente heterogeniteten mellom forskjellige enkeltceller i en enorm befolkning. Slik teknologi kan også gi en ny generasjon klinisk forskning, hvor sjeldne, avvikende celler i sykdomsprosessen kan kvantifiseres på en etikettfri måte.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Vi takker Mr. P. Yeung for å lage MCF-7 for oss. Dette arbeidet ble delvis støttet av bevilgninger fra Research Grant Council i Hong Kong Spesial Administrasjonsregion, Kina (Prosjekt nr. 17259316, 17207715, 17207714, 17205215 og HKU 720112E), Innovasjons- og teknologistøtteprogrammet (ITS / 090/14 ), Og HKUs utviklingsfond.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Nikon Plan Fluorite Physiology Objectives 40X Nikon MRF07420 Objective lens (Obj2)
Olympus Plan Fluorite Objective, 0.75 NA, 0.51 mm WD, 40X Olympus RMS40X-PF Objective lens (Obj1)
N-BK7 Plano-Convex Lenses Thorlabs LA1145-C For relaying spectral shower
FC/APC Fiber Collimation Package Thorlabs F220APC-1064 For outputing and collecting laser pulses
Pellicle beamsplitter Thorlabs BP145B3 For making beam replica
Protected silver mirror Thorlabs PF10-03-P01 For reflecting light
800-1650nm 12GHz single mode DC-coupled NIR Photoreceiver Newport 1544-B For converting light into electrical signal
Infiniium High-Performance Oscilloscope Agilent DSOX91604A To save the light-converted electrical signals
HI1060 optical fiber Corning HI1060 Optical fiber for time-stretch
YTTERBIUM DOPED FIBER AMPLIFIER Keopsys KPS-STD-BT-YFA-37-BO-SM-111-FA-FA Optical in-line amplifier
Holographic grating Wasatch Photonics 020305-6 Grating
Infuse/Withdraw Syringe Pumps Harvard Apparatus PHD 2000 Syringe pump for sample loading in micro-fluidic channels

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lau, A. K. S., Wong, T. T. W., Shum, H. C., Wong, K. K. Y., Tsia, K. K. Imaging Flow Cytometry: Methods and Protocols. Barteneva, N. S., Vorobjev, I. A. , Springer New York. New York, NY. 23-45 (2016).
  2. Goda, K., Tsia, K. K., Jalali, B. Serial time-encoded amplified imaging for real-time observation of fast dynamic phenomena. Nature. 458 (7242), 1145-1149 (2009).
  3. Goda, K., Jalali, B. Dispersive Fourier transformation for fast continuous single-shot measurements. Nat Photon. 7 (2), 102-112 (2013).
  4. Lau, A. K., Shum, H. C., Wong, K. K., Tsia, K. K. Optofluidic time-stretch imaging - an emerging tool for high-throughput imaging flow cytometry. Lab Chip. 16 (10), 1743-1756 (2016).
  5. Lau, A. K. S., Tang, A. H. L., Xu, J., Wong, X. W., Y, K. K., Tsia, K. K. Optical Time Stretch for High-Speed and High-Throughput Imaging - From Single-Cell to Tissue-Wide Scales. IEEE J. Sel. Top. in Quant. Electron. 22 (4), (2016).
  6. Lei, C., Guo, B., Cheng, Z., Goda, K. Optical time-stretch imaging: Principles and applications. Appl Phys Rev. 3 (1), 011102 (2016).
  7. Lei, C., Guo, B., Cheng, Z., Goda, K. Optical time-stretch imaging: Principles and applications. Applied Physics Reviews. 3 (011102), (2016).
  8. Goda, K., et al. High-throughput single-microparticle imaging flow analyzer. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (29), 11630-11635 (2012).
  9. Goda, K., Solli, D. R., Tsia, K. K., Jalali, B. Theory of amplified dispersive Fourier transformation. Physical Review A. 80 (4), 043821 (2009).
  10. Goda, K., et al. High-throughput single-microparticle imaging flow analyzer. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (29), 11630-11635 (2012).
  11. Lai, Q. T. K., et al. High-throughput time-stretch imaging flow cytometry for multi-class classification of phytoplankton. Opt. Express. 24 (25), 28170-28184 (2016).
  12. Chen, C. L., et al. Deep Learning in Label-free Cell Classification. Sci Rep. 6, 21471 (2016).
  13. Fard, A. M., et al. Nomarski serial time-encoded amplified microscopy for high-speed contrast-enhanced imaging of transparent media. Biomed Opt Express. 2 (12), 3387-3392 (2011).
  14. Lau, A. K., et al. Interferometric time-stretch microscopy for ultrafast quantitative cellular and tissue imaging at 1 mum. J Biomed Opt. 19 (7), 76001 (2014).
  15. Mahjoubfar, A., Chen, C., Niazi, K. R., Rabizadeh, S., Jalali, B. Label-free high-throughput cell screening in flow. Biomed Opt Express. 4 (9), 1618-1625 (2013).
  16. Wong, T. T., et al. Asymmetric-detection time-stretch optical microscopy (ATOM) for ultrafast high-contrast cellular imaging in flow. Sci Rep. 4, 3656 (2014).
  17. Mata, T. M., Martins, A. A., Caetano, N. S. Microalgae for biodiesel production and other applications: A review. Renew Sustainable Energy Rev. 14 (1), 217-232 (2010).
  18. Irigoien, X., Huisman, J., Harris, R. P. Global biodiversity patterns of marine phytoplankton and zooplankton. Nature. 429 (6994), 863-867 (2004).
  19. Wei, X., et al. Coherent Laser Source for High Frame-Rate Optical Time-Stretch Microscopy at 1.0 µm. IEEE J. Sel. Top. Quantum Electron. 20 (5), 384-389 (2014).
  20. Wei, X., et al. Breathing laser as an inertia-free swept source for high-quality ultrafast optical bioimaging. Opt. Lett. 39 (23), 6593-6596 (2014).
  21. Xu, Y., Wei, X., Ren, Z., Wong, K. K. Y., Tsia, K. K. Ultrafast measurements of optical spectral coherence by single-shot time-stretch interferometry. Sci Rep. 6, 27937 (2016).
  22. Tsia, K. K., Goda, K., Capewell, D., Jalali, B. Performance of serial time-encoded amplified microscope. Opt. Express. 18 (10), 10016-10028 (2010).
  23. Alix-Panabières, C., Pantel, K. Challenges in circulating tumour cell research. Nat Rev Cancer. 14 (9), 623-631 (2014).
  24. Kling, J. Beyond counting tumor cells. Nat Biotech. 30 (7), 578-580 (2012).
  25. Hodgkinson, C. L., et al. Tumorigenicity and genetic profiling of circulating tumor cells in small-cell lung cancer. Nat Med. 20 (8), 897-903 (2014).
  26. Ozkumur, E., et al. Inertial focusing for tumor antigen-dependent and -independent sorting of rare circulating tumor cells. Sci Transl Med. 5 (179), (2013).
  27. Hou, H. W., et al. Isolation and retrieval of circulating tumor cells using centrifugal forces. Scientific Reports. 3, 1259 (2013).
  28. Karabacak, N. M., et al. marker-free isolation of circulating tumor cells from blood samples. Nat. Protocols. 9 (3), 694-710 (2014).
  29. Krebs, M. G., et al. Molecular analysis of circulating tumour cells-biology and biomarkers. Nat Rev Clin Oncol. 11 (3), 129-144 (2014).
  30. Wu, J., et al. Ultrafast Laser-Scanning Time-Stretch Imaging at Visible Wavelengths. Light Sci Appl. , (2016).

Tags

Engineering Utgave 124 Mikroskopi bildebehandlingsstrømcytometri mikrofluidisk tidsstrengsimaging høy gjennomstrømnings screening single-cell analyse
Mikrofluidisk Imaging Flow Cytometry ved asymmetrisk deteksjon Time-stretch Optical Microscopy (ATOM)
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Tang, A. H. L., Lai, Q. T. K.,… More

Tang, A. H. L., Lai, Q. T. K., Chung, B. M. F., Lee, K. C. M., Mok, A. T. Y., Yip, G. K., Shum, A. H. C., Wong, K. K. Y., Tsia, K. K. Microfluidic Imaging Flow Cytometry by Asymmetric-detection Time-stretch Optical Microscopy (ATOM). J. Vis. Exp. (124), e55840, doi:10.3791/55840 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter