Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Engineering
Click here for the English version

Engineering

Микрофлюидная имитационная проточная цитометрия с помощью асимметричного детектирования оптической микроскопии с временным растяжением (ATOM)

Published: June 28, 2017 doi: 10.3791/55840
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, 1, 1, 2, 1, 1
1Department of Electrical and Electronic Engineering, The University of Hong Kong, 2Department of Mechanical Engineering, The University of Hong Kong

Summary

В этом протоколе описывается внедрение системы оптической микроскопии с временным растяжением асимметричного детектирования для одноэлементной визуализации в сверхбыстрой микрожидкостной среде и ее применениях в цитометрии изображений.

Abstract

Масштабирование числа измеряемых параметров, что позволяет проводить многомерный анализ данных и, таким образом, статистические результаты с более высокой достоверностью, является основной тенденцией в развитии технологии проточной цитометрии. Примечательно, что добавление изображений высокой четкости позволяет комплексный морфологический анализ сотовых / субклеточных структур. Это невозможно для стандартных проточных цитометров. Тем не менее, это полезно для продвижения наших знаний о клеточных функциях и может принести пользу исследованиям в области естественных наук, клинической диагностике и мониторингу окружающей среды. Включение возможностей визуализации в проточную цитометрию ставит под угрозу пропускную способность анализа, в первую очередь из-за ограничений скорости и чувствительности в технологиях камеры. Было показано, что для преодоления этой проблемы скорости или пропускной способности, связанной с цитометрией потока изображений, при сохранении качества изображения, была продемонстрирована асимметричная оптическая микроскопия с временным растяжением (АТОМ), позволяющая высококонтрастный однокамерный образС разрешением до соты, при пропускной способности изображения до 100 000 ячеек / с. Основываясь на концепции визуализации обычного времени-растяжения, которая опирается на все-оптическое кодирование и извлечение изображений с использованием ультрабыстрого широкополосного лазерного импульса, ATOM еще больше повышает производительность изображения за счет усиления контрастности изображения немаркированных / неокрашенных ячеек. Это достигается путем доступа к информации фазового градиента ячеек, которая спектрально кодируется в одноканальные широкополосные импульсы. Следовательно, ATOM особенно выгодна при высокопроизводительных измерениях одноклеточной морфологии и текстуры - информации, указывающей типы клеток, состояния и четные функции. В конечном счете, это может стать мощной платформой для картирования проточной цитометрии для биофизического фенотипирования клеток, дополняющего текущий современный клеточный анализ на основе биохимических маркеров. В этой работе описывается протокол для установления ключевых модулей системы ATOM (от оптического интерфейса до данных pОбработка и визуализация), а также рабочий процесс цитометрии изображений на основе ATOM с использованием в качестве примеров человеческих клеток и микроводорослей.

Introduction

Оптическая визуализация представляет собой мощный инструмент и анализ на основе клеток для (почти) неинвазивной визуализации подробного пространственного распределения многих клеточных / субклеточных компонентов, тем самым раскрывая множество морфологических, биофизических и биомолекулярных сигнатур клеток. Однако эта способность извлекать информацию с высоким содержанием из отдельных ячеек, как правило, была скомпрометирована, когда нужно было исследовать огромную и гетерогенную популяцию клеток. Это указывает на общий компромисс в анализах на основе клеток между пропускной способностью измерения и контентом. Примечательным примером является то, что добавление возможности обработки изображений в проточную цитометрию привело к уменьшению пропускной способности по меньшей мере на 1-2 порядка по сравнению с классическими неотображающими проточными цитометрами. Хотя он мог бы предложить комплексный морфологический одноэлементный анализ, который невозможен со стандартными проточными цитометрами 1 , цитометрия с изображением потока обычно не имеет достаточной пропускной способности для идентификатораВлекут за собой клеточную гетерогенность с высокой статистической достоверностью. Это необходимо для новых открытий в биологии и для получения понимания патогенеза заболеваний. Ключевая техническая задача заключается в присущем ограничению скорости, налагаемому общими стратегиями оптического изображения: сканирование лазерного луча ( например, гальванометрическими зеркалами) и / или датчики изображения ( например, устройство с зарядовой связью (CCD) и комплементарный металл- Оксидный полупроводник (CMOS)). Скорость лазерного сканирования внутренне ограничена механической инерцией сканирующих зеркал, тогда как частота кадров CCD или CMOS ограничена фундаментальным компромиссом между скоростью обработки изображения и чувствительностью ( т. Е. Увеличение частоты кадров приводит к снижению чувствительности обнаружения сигнала , и наоборот).

Основываясь на полностью оптическом, сверхбыстром механизме кодирования изображений, оптическая обработка с растяжением по времени была продемонстрирована как привлекательная платформа для высокопроизводительного потока изображений cytOmeters, без необходимости использования обычных датчиков изображения или механического лазерного сканирования 2 , 3 . Подробное описание рабочего принципа долговременной визуализации можно найти в ссылках 4 , 5 , 6 , 7 . Вкратце, он состоит из двух взаимозаменяемых этапов отображения: (i) спектральное кодирование (отображение длины волны), в котором пространственные координаты изображенного образца отображаются на разные длины волн по спектру светоимпульсного пучка 8 , 9 , И (ii) дисперсионное преобразование Фурье (отображение времени по длине волны) 9 , в котором компоненты длины волны отдельных лазерных импульсов преобразуются (растягиваются) через групповую дисперсию скорости (ГВД) во временные колебания с волной ( рис. 1 ). ВажноОсобенностью долговременного изображения является оптическое усиление, которое играет критическую роль в борьбе с потерей чувствительности из-за сверхбыстрого фотодетектора и потери GVD, тем самым усиливая отношение сигнал / шум изображения (SNR), не загрязняясь шумом фотодетектора 9 , Поскольку каждый лазерный импульс кодирует сканирование линии изображения, который ортогонален однонаправленному потоку ячеек, эффективная скорость сканирования линии определяется скоростью повторения лазера, которая обычно превышает 10 МГц. Эта сверхбыстрая операция позволяет осуществлять размытие изображений с одной ячейкой с пропускной способностью 10 000-100 000 ячеек / с ( т. Е. В 10-100 раз выше, чем обычная цитометрия изображения). В результате изображение с растяжением по времени может найти уникальные приложения в высокопроизводительном, односетевом скрининге на основе изображений, особенно когда необходимо идентифицировать неизвестную гетерогенность или редкие / аберрантные клетки в пределах значительной популяции (от тысяч до миллионов чел Ls), например, скрининг редких раковых клеток 10 или классификация микроводорослей 11 .

Временно-растягивающая визуализация преимущественно основана на захвате изображения яркого поля (BF), из которого контраст изображения генерируется путем рассеяния света и поглощения из ячеек 2 , 3 , 9 , 10 , 11 . Такие возможности без ярлыков, однокамерные изображения могут обойти вредные эффекты, связанные с флуоресцентными метками, такие как цитотоксичность и фотообесцвечивание, и тем не менее предоставить ценную информацию для одноцелевого анализа на основе клеточной и субклеточной текстуры и морфологии. Доказано, что эти без метки параметры эффективны для глубокой классификации изображений клеток, особенно когда имеется огромная популяция клеток 11 ,"Xref"> 12. Однако во многих случаях BF-изображение не обеспечивает достаточного контраста, чтобы выявить подробную морфологию прозрачных клеток без этикетки. Для повышения контрастности изображения при сверхбыстрых частотах кадров 13 , 14 , 15 были разработаны различные методы визуализации без метки, фаза-контраст, время-растяжение. Среди этих методов была разработана асимметричная детектируемая по времени оптическая микроскопия (АТОМ), чтобы выявить контраст фазового градиента (дифференциальный интерференционный контраст (DIC)), основанный на концепции, подобной фотографии Шлирен, Высококонтрастное изображение одиночных клеток при сверхвысокой микрофлюидной скорости (до 10 м / с) 16 . Этот эффект можно легко сгенерировать посредством наклонного детектирования или освещения путем частичной блокировки траектории луча с кодированием изображения или наклона луча до фотодетекции. Еще одним преимуществом ATOM является егоЧтобы одновременно получить два контраста с фазовым градиентом вдоль противоположных ориентаций. Вычитание интенсивности и суммирование двух противоположно-контрастных изображений дают дифференциальный градиент фазового градиента и контраст поглощения соответственно от одного и того же сканирования линии. В этой работе представлен подробный протокол, описывающий реализацию ATOM, включая установление оптической установки, подготовку образца и сбор данных и визуализацию. В частности, эта работа демонстрирует работу ATOM с одноклеточной визуализацией клеток крови человека, раковых клеток и фитопланктона (микроводорослей). Это подчеркивает применимость АТОМ к визуализации проточной цитометрии не только на биомедицинской арене, но также в исследованиях морских и биотопливных 17 , 18 .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Подготовка образца

  1. Подготовка образца (адгезивные клетки, клетки MCF-7)
    1. Выньте блюдо для культивирования клеток из инкубатора и слейте культуральную среду.
    2. Промойте клетки на блюде 1х фосфатно-буферным солевым раствором (PBS) для удаления избыточной культуральной среды.
    3. Добавьте 3 мл раствора 0,25% трипсина в культуральную чашку (диаметр 100 мм) и поместите в инкубатор на 37 ° С, 5% СО 2 в течение 4 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Трипсин растворяет клеточный белок клеток, чтобы они отделились от культуральной тарелки.
    4. Проверьте, все ли клетки отделились от блюд культуры, используя световой микроскоп (объектив 10X). Если нет, осторожно встряхните блюдо для культуры клеток.
    5. Добавьте 4 мл стандартной культуральной среды (в состав которой входят 89% модифицированной среды Dulbecco Eagle Medium (DMEM), 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) и 1% пенициллин-стрептомицина (PS)), чтобы остановить действие трипсина.
    6. TПеренесите всю смесь (клетки в растворе трипсина и культуральную среду) в центрифужную пробирку и центрифугируйте в течение 5 минут при 200 × g.
    7. Удалите всю жидкость и повторно суспендируйте клетки в 1 мл 1x PBS (значение pH: 7,4, предварительно нагретое до 37 ° C).
  2. Подготовка проб (культивируемые микроводоросли)
    1. Перенесите культивируемые микроводоросли и культуральную среду ( например, морскую воду, агар или пресную воду) в новые стеклянные культуральные пробирки (~ 15 мл) в объемном отношении (микроводоросли и культуральную среду) 1: 5, чтобы установить Новый субкультурный носитель.
    2. Поместите стеклянные культуральные трубки в пыленепроницаемую камеру под постоянным освещением искусственным освещением от флуоресцентных ламп в соответствии со световым / темным (LD) циклом (обычно LD 16: 8) за 72 - 120 часов перед экспериментом.
    3. Перенесите субкультурные образцы в центрифужную пробирку и хорошо перемешайте.

2. Настройка системы ATOM


Рисунок 1: Схема системы ATOM. Широкополосный импульсный лазер используется для доставки сверхбыстрых импульсов в ( a ) модуль растяжения во времени и ( b ) модуль линейного оптического усилителя. Модуль растяжения времени генерирует последовательность временных сигналов, каждая из которых является репликой спектра длины волны лазерного источника ( т. Е. Отображение длины волны к времени). Модуль усилителя используется для компенсации потерь при растяжении (диспергировании). Затем растянутый импульс ( c ) пространственно диспергируется с помощью дифракционной решетки, образуя 1D спектральную ливневую подсветку, в которой отдельные компоненты длины волны передаются с помощью пары релейных линз и фокусируются линзой объектива на разные положения на проточной ячейке внутри ( d ) Микрожидкостной чип. Это процесс спектрального кодирования.Спектрально закодированный свет снова пройдет ячейку через другую линзу объектива и зеркало, возвращаясь к дифракционной решетке и рекомбинируя в виде пространственно нераспределенного импульсного пучка. Этот импульсный пучок с кодированием изображения затем ( E ) разделены на два пути, так что оба пучка частично блокируются ( f ) краем ножа, но с противоположных направлений, прежде чем соединяться с волокнами. Эти два луча представляют собой два (противоположных) закодированных контраста фазового градиента конечного изображения. Для одновременного обнаружения обоих сигнальных контрастов один из сигналов претерпевает ( g ) линию задержки времени, так что два сигнала мультиплексируются (чередуются) во времени. Для сбора данных используются высокоскоростной фотоприемник и осциллограф в реальном времени. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

  1. Время Повторный модуль
    1. Используйте широкополосный фемтосекундный (fs) или пикосекундный (ps) импульсный лазерный источник с рекомендованной центральной длиной волны в ближнем инфракрасном диапазоне (NIR), 800-1,500 нм.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Типичная требуемая ширина импульса может варьироваться от менее 100 фс до нескольких пс. Подробные требования к импульсным лазерным источникам можно увидеть в ссылках 4 и 5. Важные показатели выделены в таблице 1 .
      1. Убедитесь, что источник лазера имеет высокую частоту повторения, которая должна быть в мегагерцовом режиме ( например, десятки МГц), чтобы обеспечить сверхбыструю визуализацию в ATOM. Кроме того, установите мощность пикового выходного лазера значительно ниже порога мощности повреждения полости волокна, приблизительно 1 кВт.
      2. Обеспечьте хорошую временную и спектральную стабильность импульсного лазерного источника.
        ПРИМЕЧАНИЕ. Типичный допуск флуктуации спектральной амплитуды должен поддерживаться в пределах 1,2% 19 , 20 ,Ss = "xref"> 21, что достигается лазером с синхронизацией волокон в этой установке.
        ПРИМЕЧАНИЕ. Ожидается, что оптическая ширина полосы лазерного источника будет составлять 10-100 нм, что необходимо для обеспечения достаточного поля обзора изображения (FOV) в одноэлементной визуализации 21 .
    2. Через волоконный коллиматор соединяйте лазерный импульсный луч с одномодовым дисперсионным оптическим волокном, в котором импульсы растягиваются через групповую дисперсию скорости (GVD) ( рис. 1а ).
      ПРИМЕЧАНИЕ. Это процесс, после которого спектр каждого импульса отображается во времени как форма волны с волной ( т. Е. Отображение длины волны к времени).
      ПРИМЕЧАНИЕ. Общая требуемая GVD должна быть достаточной, чтобы гарантировать, что полное разрешение изображения ATOM не зависит от процесса отображения длины волны от времени (см. Обсуждение). Как правило, в диапазоне NIR GVD должен быть значительно больше 0,1 нс / нм. Например, одномодовое волокно, используемое вS обеспечивает полную ГВД 0,38 нс / нм вокруг длины волны 1060 нм (общая длина волокна 10 км).
  2. Модуль спектрального кодирования
    1. Построить оптическую микроскопическую систему для выполнения спектрально кодированного изображения клеток, протекающих по микрожидкостному каналу, как показано на рисунке 1 .
      ПРИМЕЧАНИЕ. Ключевыми компонентами этого оптического микроскопа являются: (1) дифракционная решетка, телескопический модуль реле-линзы (RL1 и RL2 на рисунке 1 ) и две объектива (Obj1 и Obj2 на рисунке 1 ).
      1. Во-первых, осветить растянутый по времени и коллимированный пучок на дифракционную решетку (решетка типа передачи используется в этой установке) для создания спектрального ливня ( рис. 1в ).
        ПРИМЕЧАНИЕ. Мощность дифрагированного пучка ( т. Е. Эффективность дифракции) может быть максимизирована путем регулирования tОн закрывает ориентацию, закрытую конфигурацией Литтроу.
      2. Сконфигурируйте две релейные линзы (RL1 и RL2) в 4-f-системе формирования изображения ( т. Е. Поместите дифракционную решетку на фокальную плоскость RL1 и отделите RL1 и RL2 на расстояние, равное сумме их фокусных расстояний. Будет отображаться на заднюю фокальную плоскость объектива Obj1).
      3. Тщательно выровняйте спектральный ливень, чтобы заполнить заднюю апертуру Obj1, чтобы спектральный ливень мог проецироваться и фокусироваться на плоскости изображения микроскопа.
        ПРИМЕЧАНИЕ. Здесь NA объектива (Obj1 на рисунке 1 ) составляет 0,75.
      4. Поместите еще одну объективу (Obj2 на рисунке 1 ) с аналогичным NA и плоским зеркалом на заднюю апертуру объектива (Obj2), так что луч спектрального душа может быть выровнен для двухпроходной плоскости изображения и вернуться к Дифракционная решетка.
      5. регулироватьПара объективных линз (Obj1 и Obj2), так что их фокальные плоскости накладываются друг на друга. Убедитесь, что спектральный душ дважды пропускает плоскость изображения в одном месте и возвращается к решетке по тому же пути. Если нет, выполните дальнейшее выравнивание и настройку оптической системы.
        ПРИМЕЧАНИЕ. Возвращенный свет должен проходить через дополнительный разделитель лучей, так что свет может передаваться в асимметричный модуль обнаружения.
      6. Отрегулируйте коэффициент усиления оптического усилителя на подходящем уровне, чтобы результирующий сигнал мог быть обнаружен с помощью фотоприемника с хорошим SNR, которое обычно составляет> 10 дБ.
      7. Поместите и отрегулируйте положение микрожидкостного чипа на платформе для образцов и убедитесь, что спектральный душ и, следовательно, область изображения расположены по микрофлюидному каналу ( рис. 1d ).
        ПРИМЕЧАНИЕ. Спектральный ливень освещается ортогонально направлению потока жидкости в пределах мIcrofluidic chip, так что текущее движение автоматически выполняет двумерное (2D) сканирование.
  3. Асимметричный модуль обнаружения
    1. Поместите дополнительный разделитель лучей, чтобы отделить пучок с изображением в два ( рис. 1е ).
      ПРИМЕЧАНИЕ. Каждая реплика луча частично заблокирована краем ножа.
    2. Измерьте и запишите оптическую мощность луча перед блоком луча. Затем вручную поместите края ножа (смонтированные на стадии линейного перевода) так, чтобы они грубо перекрывали половину луча (путем визуального контроля). Затем используйте измеритель оптической мощности, чтобы контролировать мощность пучка при тонкой настройке положения краев ножа, переведя их поперек луча.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Предполагается, что оптимальное положение заключается в том, что мощность уменьшается на ~ 50% от первоначального значения ( т. Е. Разблокированного случая). Это условие, обеспечивающее наилучшую комбинацию сигнала изображенияПрочность и контрастность изображения.
    3. Повторите шаг 2.3.2 для другой реплики луча. Обратите внимание, что ориентация блока частичного луча для одного луча должна быть противоположной относительно другого луча ( рис. 1f ).
    4. Соедините два частично заблокированных луча с двумя отдельными одномодовыми волокнами через двухволоконные коллиматоры.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Одно из плеч имеет дополнительную длину волокна, выступая в качестве линии задержки на основе волокон, чтобы ввести задержку времени по отношению к другой реплике (без линии задержки) ( рисунок 1g ). Оба они направлены на одно волокно с помощью оптоволоконного соединителя перед фотодетекцией. Задержка времени должна быть достаточно длинной, чтобы временно отделить две копии и достаточно короткие, чтобы избежать временного перекрытия со следующей формой волны ( т. Е. Две реплики всегда чередуются во времени и мультиплексируются по времени в одном волокне до обнаружения ( рисунок 2a )).
    5. КепкаИ оцифровать обнаруженные оптические сигналы с помощью осциллографа в реальном времени. Обратите внимание, что ширина полосы пропускания и, следовательно, частота дискретизации осциллографа должны быть достаточно высокими, чтобы гарантировать, что они не влияют на окончательное разрешение изображения (см. Обсуждение).
      ПРИМЕЧАНИЕ. Здесь, когда GVD составляет 0,38 нс / нм, требуются ширина полосы пропускания и частота дискретизации> 20 ГГц и> 40 ГСА / с соответственно.

3. Экспериментальные процедуры

  1. Загрузка образцов
    1. Выполните подсчет клеток под обычным фазовым контрастным микроскопом в стандартном гемоцитометре.
    2. Отрегулируйте плотность клеток, разбавив 1x PBS (с родниковой водой для микроводорослей) и хорошо перемешайте с пипеткой.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Рекомендуемая концентрация составляет от 10 5 до 10 6 клеток / мл.
    3. Установите микрожидкостный чип на платформу для образца оптической системы визуализации.
      ПРИМЕЧАНИЕ. МикрожидкостьЧип в основном изготовлен из полидиметилсилоксана (PDMS) и изготовлен с использованием стандартного метода формования реплик. Микрофлюидный канал сконструирован с асимметричным изогнутым каналом для создания эффекта фокусировки инерциального потока, так что ячейки могут течь в одном файле в области формирования изображения (с размером 80 мкм x 80 мкм (высота x ширина)) на высокой скорости ,
    4. Перенесите раствор клеток, скорректированный по плотности, на 10 мл шприц.
    5. Подключите шприц к входу микрожидкостного чипа и центробежной трубки к выходу микрожидкостного чипа для сбора отходов.
    6. Установите шприц на шприцевой насос и установите подходящий расход, чтобы обеспечить желаемую пропускную способность, и избегать чрезмерного сдвигового усилия между ячейками и каналом.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Линейная скорость образцов должна быть в пределах 0,5 и 10 м / с. Обратите внимание, что перед фактической записью изображения часто требуется дальнейшая тонкая настройка системы с точки зрения максимизацииМощность сигнала изображения и оптимизацию фокусировки изображения путем повторения шагов 2.2.1.4-2.2.1.6.

4. Сбор данных

  1. Установите подходящее количество точек данных для сохранения для каждого эксперимента. Количество сохраняемых точек данных зависит от размера и скорости потока образцов.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Как правило, он устанавливается на 8-16 миллионов точек выборки при частоте дискретизации 80 ГГц / с.
  2. Приобретайте и сохраняйте данные в пакетном режиме с помощью осциллографа.

5. Обработка бэкэнд

фигура 2
Рисунок 2: Реконструкция изображений ATOM с трассировки времени линии. Для восстановления изображений АТОМ с контрастностью контраста и дифференциального (усиленного) градиента фазового графа два набора импульсов с растяжением по длине (см. Фиолетовый и зеленый импульсы) извлекаются из(А) временную мультиплексированную трассу временных сигналов и затем подвергают цифровому сегментированию и складывают, чтобы сформировать ( b ) два 2D-изображения, показывающие два противоположных контраста фазового градиента. Обратите внимание, что необходима операция сдвига для формирования ( c ) изображений без искажений путем компенсации сдвига субиндекса из-за ошибки округления в оценке скорости повторения лазера. Вычитая ( d ) необработанное сканирование линии из огибающей спектральной интенсивности лазерного источника, фон изображений можно удалить. ( G ) Изображение контрастности поглощения может быть получено путем суммирования по пикселям по объему изображений ( e ) и ( f ), тогда как ( h ) дифференциальное изображение с градиентом фазового градиента может быть получено из вычитания изображений (e ) И (f). Нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версиюЭтой цифры.

  1. Передайте данные с осциллографа на компьютеры для восстановления автономного изображения.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Здесь данные хранятся на переносном жестком диске и передаются вручную между осциллографом и компьютерами обработки. Емкость жесткого диска должна быть более 500 ГБ для каждого эксперимента.
    1. Используйте процедуру восстановления ключевого изображения, чтобы скомпоновать линейные сканирование, чтобы сформировать 2D-изображение ( рисунок 2 ).
      ПРИМЕЧАНИЕ. Пользовательская программа (в MATLAB) затем создает два асимметричных изображения обнаружения, разделяя два набора данных с временным мультиплексированием (фиолетовые и зеленые сигналы на рисунке 2 ).
      1. Получите дифференциальное изображение с градиентом фазового градиента путем вычитания интенсивностей двух асимметричных изображений обнаружения; Контрастное изображение поглощения может быть получено путем добавления двух асимметричных изображений обнаружения. См. Выбранные изображения MCF-7 и микроводорослей вРисунок 3 . Обратите внимание, что фоновые профили отдельных изображений сначала должны быть устранены, а их интенсивности должны быть нормализованы до операций суммирования и вычитания изображения.
    2. Создайте библиотеку параметров, полученных из изображений, таких как объем ячейки, округлость и плотность поглощения и т. Д. Для дальнейшего анализа.
  2. Введите библиотеку данных в платформу визуализации данных ( рисунок 4 ).
    1. Загрузите библиотеку параметров и соответствующие восстановленные изображения на платформу интерфейса визуализации.
    2. Задайте осей как представляющие интерес параметры.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Параметры являются специфичными для конкретной задачи и определяются пользователем. Они получены из изображений ATOM программой MATLAB. Здесь для выбора доступны оптическая плотность поглощения ячейки, площади ячейки, объема ячейки и округлости ячейки. Выберите набор данных для отображения, чтобы каждое изображение ячейки можно было визуализировать как другую точку данных на графике рассеяния.
    3. Переместите курсор мыши на каждую точку, чтобы соответствующее изображение и другие параметры отображались в плавающем под-окне.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Оси могут быть изменены между линейной и логарифмической шкалами в интерактивном режиме.
    4. Выполните дальнейший анализ любого подмножества набора данных, вручную строя на диаграмме рассеяния.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Гистограмма в каждом параметре закрытого подмножества может быть нанесена на график по сравнению со всей библиотекой. Отдельные гистограммы отображаются в другом плавающем под-окне.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

В этой работе показаны две одноячеистые демонстрации изображений ATOM: одна с клетками млекопитающих (мононуклеарная клетка периферической крови человека (PBMC) и клетки рака молочной железы (MCF-7)), а другая с фитопланктоном s (Scenedesmus и Chlamydomonas). Первый эксперимент был вызван растущим интересом к жидкой биопсии для обнаружения, подсчета и характеристики циркулирующих опухолевых клеток (КТК) в крови 23 . Способность измерять КТК, распространенные с первичных опухолевых сайтов, в кровоток, позволяет исследовать прогрессирование метастатического рака 24 , 25 . Однако в анализе CTC существуют проблемы: (i) количество CTC значительно ниже, чем чрезмерное количество клеток крови в цельной крови. Существующие методы идентификации и восстановления КТК в основном включают стадии обогащения и разделения клеток Class = "xref"> 26 , 27 , 28 . Однако загрязняющий фон из клеток крови и / или жизнеспособность обогащенных CTC остаются проблемой для последующего молекулярного анализа ( например, секвенирования РНК) 29 . (Ii) КТК сильно гетерогенны с точки зрения как биофизических, так и биомолекулярных сигнатур, что ограничивает эффективность обогащения и обнаружения КТК. С этой целью цитометрия с изображением без метки с высокой пропускной способностью изображения является привлекательным инструментом, который позволяет непосредственно отображать и идентифицировать CTC в огромной популяции клеток крови, сводя к минимуму или даже минуя этапы обогащения.

Второй эксперимент особенно важен для крупномасштабной характеристики фитопланктона, которая может влиять на достижения в области наук об окружающей среде ( например, обнаружение видов вредных водорослевых цветков (HAB)S = "xref"> 29 и идентификация микроводорослевых видов в качестве возобновляемых источников биодизеля) 17 . Благодаря ATOM возможности высокопроизводительной и высококонтрастной одноэлементной визуализации фитопланктона могут быть полезными для выявления сложной гетерогенности по размеру, текстуре и морфологии по разным родам и видам.

На рисунке 3 показаны изображения клеток млекопитающих, MCF-7 и PBMC (скорость течения со скоростью ~ 10 м / с), а также микроводоросли, Scenedesmus и Chlamydomonas (протекающие со скоростью ~ 2 м / с), захваченные ATOM , Во всех четырех случаях два противоположных контраста фазового градиента были получены двумя мультиплексированными по времени асимметричными сигналами (описанными на шаге 2.3). Оба они проявляют псевдо-трехмерный вид, напоминающий изображения DIC, каждый из которых показывает две противоположные ориентации затенения (столбцы 1 и 2 на рисунке 3a т. Е. Только контрастные эффекты поглощения и усиленного дифференциального фазового градиента, столбцы 3 и 4 на рис. 3а -d ). Обратите внимание, что не только без метки ATOM обнаруживают размытые одноклеточные изображения, но также характеризуют клеточные структуры с высокой контрастностью. Примечательно, что на рис. 3 могут быть четко видны вакуоли, пиреноиды и жгутики в микроводорослей. Этот атрибут изображения критически позволяет извлекать богатый набор идентификаторов, полученных из внутренних клеточных и субклеточных текстур / морфологий для автоматической классификации на основе изображений.

Эта работа демонстрирует, что биофизические свойства, такие как клеточность и размер ячейки, могут быть использованы для Классификация MCF-7 и PBMC. Обратите внимание, что в образце MCF-7 наблюдаются два кластера. Доступность высококонтрастных изображений для всех точек данных позволяет нам тщательно изучить, что один из кластеров соответствует фрагментам / мусору ( рис. 4а ). Была также проведена аналогичная классификация между двумя видами фитопланктона на основе изображений ATOM. Здесь результаты классификации представлены в виде 2D-графика рассеяния, визуализированного пользовательским интерфейсом ( рис. 4 ). Каждая аннотированная точка данных в графике рассеяния, соответствующая каждой ячейке, может быть дополнительно исследована с различными параметрами, полученными из ATOM. Соответствующее изображение ATOM также может быть интерактивно отображено непосредственно на графике. Ручное стробирование также поддерживается в этом интерфейсе визуализации для облегчения дальнейшей классификации и анализа.

Iles / ftp_upload / 55840 / 55840fig3.jpg "/>
Рисунок 3: Камелия изображения ATOM из микроводорослей и клеток млекопитающих со сверхбыстрой скоростью потока (~ 2-10 м / с). А) Scenedesmus; B ) хламидомонады; (В) клетки рака молочной железы, MCF-7; И ( d ) человеческий РВМС. Scenedesmus и Chlamydomonas протекают со скоростью ~ 2 м / с, тогда как MCF-7 и PBMC протекают со скоростью 10 м / с. Левые два столбца (столбцы 1 и 2) для каждого типа ячеек представляют два противоположных контраста фазового градиента. Столбцы 3 и 4 представляют контрастность контраста и дифференциальный (усиленный) градиент фазового градиента, соответственно. Шкала шкалы = 20 мкм (красным). Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 4
FiGure 4: Графический пользовательский интерфейс для цитометрического анализа на основе изображений ATOM. В этом интерфейсе пользователь может выполнять классификацию и анализ клеточного типа, определяя различные параметры ячейки ( например, размер ячейки, округлость, плотность поглощения и т. Д. ), Полученные из изображений ATOM. Результат может быть представлен в диаграмме рассеяния, отображаемой на центральной панели. Доступ и управление различными параметрами дисплея, которые включают в себя изменение параметров и масштабирование для оси x и y (кнопки параметров оси X и Y) и переключение между наборами данных (кнопка набора данных). Подробная информация о ячейке (закладка информации о ячейке) может считываться путем зависания определенной точки данных. Чтобы включить быструю навигацию, пользователь может перейти в другой режим просмотра и одновременно отобразить все изображения на диаграмме рассеяния на центральной панели (кнопка «Просмотр режимов»). Ручное стробирование также может быть выполнено для дальнейшего анализа. Желтые точки данных представляют собой образец ячейки MCF-7 (в ( a </ Strong>)) и Scenedesmus (SCE) (в ( b )), тогда как красные точки данных представляют собой образец PBMC человека (в (a)) и Chlamydomonas (CHA) (в (b)). Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Существует несколько технических деталей, требующих особого внимания при настройке системы ATOM. Во-первых, важно отметить, что асимметричное / наклонное спектрально-кодированное освещение может вводить остаточные компоненты фазового градиента ( т. Е. Эффект затенения) в контраст поглощения и влиять на усиление контраста фазового градиента в АТОМ. Поэтому этот эффект наклонного освещения должен быть сведен к минимуму. Во-вторых, следует подчеркнуть, что схема временного мультиплексирования или временного чередования, включающая две копии, не приводит к существенному компрометации скорости изображения ( т. Е. Скорость линейного сканирования> МГц может поддерживаться), учитывая, что общая временная ширина Двух лучей-реплик не превышает одного периода сканирования строки. В-третьих, оптимальная конфигурация интегрированного модуля дисперсионного волокна и усилителей зависит от целевого усиления как спецификации доступных усилителей. Оптическое усиление - essentiaL к процессу растяжения времени для борьбы с оптическими потерями, связанными с GVD 22 . В принципе, он может быть реализован любым типом оптического усилителя, предпочтительно в формате волокна, таким образом, что он совместим с процессом растяжения по длине волокна ( рис. 1b ). Практические примеры оптических усилителей на основе оптических волокон включают в себя волоконные усилители, легированные эрбием (EDFA, для рабочих длин волн от 1500 до 1600 нм), волоконные усилители, легированные иттербием (YDFA, для рабочих длин волн 1060 нм), волоконно-комбинационные усилители, И волоконно-оптические параметрические усилители (FOPA, для любой длины волны работы, в принципе, до тех пор, пока имеется источник лазера накачки). Шум шума усилителя также должен быть тщательно рассмотрен в дизайне модуля. Подробную теорию можно увидеть в ссылке 8. Общая конфигурация может включать в себя многоканальные / каскадные волоконные усилители, вставленные между множеством сегментов дисперсионного волокна (каждая из которых имеет длину несколько километров). Для ATOMВ общем случае, типичное усиление оптической мощности в выключенном состоянии должно составлять около 20-30 дБ. Следует отметить, что диапазон рабочих длин волн обычно ограничен до ~ 800-1,550 нм, в основном из-за чрезвычайно высоких потерь оптического волокна на более коротких длинах волн ( т. Е. Видимых длин волн). Поэтому, подобно большинству демонстраций изображений с растяжением во времени, ATOM на основе волокон не будет немедленно применяться к флуоресцентной визуализации, где операции видимого света все еще являются обычным явлением. Тем не менее, обратите внимание, что концепция сверхвысокочастотного импульсного растяжения, напоминающая временное растяжение, называемую задержкой с расширенным пространственным усилением (FACED) в свободном пространстве, недавно использовалась для сверхбыстрого лазерного сканирования в АТОМ, а также для флуоресцентной визуализации При видимых длинах волн 30 .

Другим важным параметром, требующим тонкого рассмотрения дизайна, является разрешение изображения. В отличие от классической световой микроскопии изображениеРазрешение АТОМ и общая временная растяжка вдоль оси спектрального ливня определяются тремя предельными режимами 22 : (i) разрешение с пространственной дисперсией, которое связано со спектральным разрешением дифракционной решетки, обозначаемое как δ x пространственное ; (Ii) предел аппроксимации стационарной фазы, который определяется как неоднозначность процесса отображения длины волны δ x SPA , который обратно масштабируется с квадратным корнем из GVD 22 ; И (iii) ограниченное фотодетектором разрешение δ x det , которое описывает конечную ширину полосы пропускания фотоприемника, которая также может влиять на окончательное пространственное разрешение. В общем случае наибольшее значение среди этих трех параметров определяется как разрешение изображения ATOM, δ x ( т. Е. Δ x = max ( δ x пространственное , δ SPA , δ x det }). Всегда желательно гарантировать, что окончательное разрешение ограничено пространственной дисперсией ( т. Е. Δ x = δ x пространственное > δ x SPA > δ x det ). Следовательно, как GVD (шаг 2.2.1.1), так и полоса пропускания (шаг 2.3.5) фотоприемника должны быть достаточно высокими, чтобы удовлетворить этому условию. С другой стороны, разрешение изображения вдоль направления потока оценивается по дифракционному пределу. Это справедливо только тогда, когда выполняется условие выборки Найквиста ( т. Е. Частота повторения лазера (R, в Гц) и скорость потока ячеек (F, в м / с) должны быть установлены так, чтобы размер пикселя в Направление потока F / R <2 δ y, где δ y - разрешение, ограниченное дифракцией, вдоль направления потока). Обратите внимание, что характеристики решетки ( например, </ Em>) и объектив ( например, числовая апертура (NA)) должны быть тщательно разработаны в соответствии с целевым разрешением.

Хотя текущая демонстрация и протокол ATOM показывают, что сбор данных осуществляется с помощью осциллографа, а обработка данных выполняется в автономном режиме, более выгодно осуществлять непрерывную сбор данных, обработку и даже аналитику в реальном времени, особенно используя возможность достижения Сверхбыстрыми и высококонтрастными способностями захвата изображения, приносимыми ATOM. С этой целью должен быть принят высокопроизводительный и высокопроизводительный блок обработки сигналов, такой как графический процессор (GPU) и / или программируемая пользователем матрица вентилей (FPGA), которые, как было продемонстрировано, имеют возможность Достичь пропускной способности обработки данных до ~ 1-10 ГБ / с. Это совместимо со сверхбыстросборной способностью ATOM ( т.е. ~ 10 GSa / s). Интеграция ATOM и обработка высокопроизводительных данных aCcelerator позволяет создать новую парадигму в биологических исследованиях, основанных на данных, особенно в распутывании неизвестной гетерогенности между отдельными клетками в огромной популяции. Такая технология может также дать возможность новому поколению клинических исследований, в которых редкие, аберрантные клетки во время процесса заболевания могут быть количественно определены без метки.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgments

Мы благодарим г-на П. Юнга за подготовку MCF-7 для нас. Эта работа была частично поддержана грантами Совета по научным грантам Гонконгского особого административного района, Китай (проект № 17259316, 17207715, 17207714, 17205215 и HKU 720112E), Программа поддержки инноваций и технологий (ITS / 090/14 ), И Фонд развития университета HKU.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Nikon Plan Fluorite Physiology Objectives 40X Nikon MRF07420 Objective lens (Obj2)
Olympus Plan Fluorite Objective, 0.75 NA, 0.51 mm WD, 40X Olympus RMS40X-PF Objective lens (Obj1)
N-BK7 Plano-Convex Lenses Thorlabs LA1145-C For relaying spectral shower
FC/APC Fiber Collimation Package Thorlabs F220APC-1064 For outputing and collecting laser pulses
Pellicle beamsplitter Thorlabs BP145B3 For making beam replica
Protected silver mirror Thorlabs PF10-03-P01 For reflecting light
800-1650nm 12GHz single mode DC-coupled NIR Photoreceiver Newport 1544-B For converting light into electrical signal
Infiniium High-Performance Oscilloscope Agilent DSOX91604A To save the light-converted electrical signals
HI1060 optical fiber Corning HI1060 Optical fiber for time-stretch
YTTERBIUM DOPED FIBER AMPLIFIER Keopsys KPS-STD-BT-YFA-37-BO-SM-111-FA-FA Optical in-line amplifier
Holographic grating Wasatch Photonics 020305-6 Grating
Infuse/Withdraw Syringe Pumps Harvard Apparatus PHD 2000 Syringe pump for sample loading in micro-fluidic channels

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lau, A. K. S., Wong, T. T. W., Shum, H. C., Wong, K. K. Y., Tsia, K. K. Imaging Flow Cytometry: Methods and Protocols. Barteneva, N. S., Vorobjev, I. A. , Springer New York. New York, NY. 23-45 (2016).
  2. Goda, K., Tsia, K. K., Jalali, B. Serial time-encoded amplified imaging for real-time observation of fast dynamic phenomena. Nature. 458 (7242), 1145-1149 (2009).
  3. Goda, K., Jalali, B. Dispersive Fourier transformation for fast continuous single-shot measurements. Nat Photon. 7 (2), 102-112 (2013).
  4. Lau, A. K., Shum, H. C., Wong, K. K., Tsia, K. K. Optofluidic time-stretch imaging - an emerging tool for high-throughput imaging flow cytometry. Lab Chip. 16 (10), 1743-1756 (2016).
  5. Lau, A. K. S., Tang, A. H. L., Xu, J., Wong, X. W., Y, K. K., Tsia, K. K. Optical Time Stretch for High-Speed and High-Throughput Imaging - From Single-Cell to Tissue-Wide Scales. IEEE J. Sel. Top. in Quant. Electron. 22 (4), (2016).
  6. Lei, C., Guo, B., Cheng, Z., Goda, K. Optical time-stretch imaging: Principles and applications. Appl Phys Rev. 3 (1), 011102 (2016).
  7. Lei, C., Guo, B., Cheng, Z., Goda, K. Optical time-stretch imaging: Principles and applications. Applied Physics Reviews. 3 (011102), (2016).
  8. Goda, K., et al. High-throughput single-microparticle imaging flow analyzer. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (29), 11630-11635 (2012).
  9. Goda, K., Solli, D. R., Tsia, K. K., Jalali, B. Theory of amplified dispersive Fourier transformation. Physical Review A. 80 (4), 043821 (2009).
  10. Goda, K., et al. High-throughput single-microparticle imaging flow analyzer. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (29), 11630-11635 (2012).
  11. Lai, Q. T. K., et al. High-throughput time-stretch imaging flow cytometry for multi-class classification of phytoplankton. Opt. Express. 24 (25), 28170-28184 (2016).
  12. Chen, C. L., et al. Deep Learning in Label-free Cell Classification. Sci Rep. 6, 21471 (2016).
  13. Fard, A. M., et al. Nomarski serial time-encoded amplified microscopy for high-speed contrast-enhanced imaging of transparent media. Biomed Opt Express. 2 (12), 3387-3392 (2011).
  14. Lau, A. K., et al. Interferometric time-stretch microscopy for ultrafast quantitative cellular and tissue imaging at 1 mum. J Biomed Opt. 19 (7), 76001 (2014).
  15. Mahjoubfar, A., Chen, C., Niazi, K. R., Rabizadeh, S., Jalali, B. Label-free high-throughput cell screening in flow. Biomed Opt Express. 4 (9), 1618-1625 (2013).
  16. Wong, T. T., et al. Asymmetric-detection time-stretch optical microscopy (ATOM) for ultrafast high-contrast cellular imaging in flow. Sci Rep. 4, 3656 (2014).
  17. Mata, T. M., Martins, A. A., Caetano, N. S. Microalgae for biodiesel production and other applications: A review. Renew Sustainable Energy Rev. 14 (1), 217-232 (2010).
  18. Irigoien, X., Huisman, J., Harris, R. P. Global biodiversity patterns of marine phytoplankton and zooplankton. Nature. 429 (6994), 863-867 (2004).
  19. Wei, X., et al. Coherent Laser Source for High Frame-Rate Optical Time-Stretch Microscopy at 1.0 µm. IEEE J. Sel. Top. Quantum Electron. 20 (5), 384-389 (2014).
  20. Wei, X., et al. Breathing laser as an inertia-free swept source for high-quality ultrafast optical bioimaging. Opt. Lett. 39 (23), 6593-6596 (2014).
  21. Xu, Y., Wei, X., Ren, Z., Wong, K. K. Y., Tsia, K. K. Ultrafast measurements of optical spectral coherence by single-shot time-stretch interferometry. Sci Rep. 6, 27937 (2016).
  22. Tsia, K. K., Goda, K., Capewell, D., Jalali, B. Performance of serial time-encoded amplified microscope. Opt. Express. 18 (10), 10016-10028 (2010).
  23. Alix-Panabières, C., Pantel, K. Challenges in circulating tumour cell research. Nat Rev Cancer. 14 (9), 623-631 (2014).
  24. Kling, J. Beyond counting tumor cells. Nat Biotech. 30 (7), 578-580 (2012).
  25. Hodgkinson, C. L., et al. Tumorigenicity and genetic profiling of circulating tumor cells in small-cell lung cancer. Nat Med. 20 (8), 897-903 (2014).
  26. Ozkumur, E., et al. Inertial focusing for tumor antigen-dependent and -independent sorting of rare circulating tumor cells. Sci Transl Med. 5 (179), (2013).
  27. Hou, H. W., et al. Isolation and retrieval of circulating tumor cells using centrifugal forces. Scientific Reports. 3, 1259 (2013).
  28. Karabacak, N. M., et al. marker-free isolation of circulating tumor cells from blood samples. Nat. Protocols. 9 (3), 694-710 (2014).
  29. Krebs, M. G., et al. Molecular analysis of circulating tumour cells-biology and biomarkers. Nat Rev Clin Oncol. 11 (3), 129-144 (2014).
  30. Wu, J., et al. Ultrafast Laser-Scanning Time-Stretch Imaging at Visible Wavelengths. Light Sci Appl. , (2016).

Tags

Engineering Микроскопия цифровая проточная цитометрия микрожидкостная временная растяжка высокопроизводительный скрининг однокамерный анализ
Микрофлюидная имитационная проточная цитометрия с помощью асимметричного детектирования оптической микроскопии с временным растяжением (ATOM)
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Tang, A. H. L., Lai, Q. T. K.,… More

Tang, A. H. L., Lai, Q. T. K., Chung, B. M. F., Lee, K. C. M., Mok, A. T. Y., Yip, G. K., Shum, A. H. C., Wong, K. K. Y., Tsia, K. K. Microfluidic Imaging Flow Cytometry by Asymmetric-detection Time-stretch Optical Microscopy (ATOM). J. Vis. Exp. (124), e55840, doi:10.3791/55840 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter