Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Engineering
Click here for the English version

Engineering

Mikrofluidisk Imaging Flow Cytometry ved asymmetrisk detektion Time-stretch Optical Microscopy (ATOM)

Published: June 28, 2017 doi: 10.3791/55840
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, 1, 1, 2, 1, 1
1Department of Electrical and Electronic Engineering, The University of Hong Kong, 2Department of Mechanical Engineering, The University of Hong Kong

Summary

Denne protokol beskriver implementeringen af ​​et asymmetrisk detekterings-tidstræk optisk mikroskopisystem til enkeltcellebilleddannelse i ultrafast mikrofluidisk strømning og dets anvendelser i billedflowcytometri.

Abstract

Skalering af antallet af målbare parametre, som muliggør multidimensionel dataanalyse og dermed højere statistikker over statistikker, har været den vigtigste tendens i den avancerede udvikling af flowcytometri. Navnlig giver tilføjelse af høj opløsning billeddannelsesevne mulighed for den komplekse morfologiske analyse af cellulære / subcellulære strukturer. Dette er ikke muligt med standard flow cytometre. Det er dog værdifuldt for at fremme vores viden om cellulære funktioner og kan være til gavn for biovidenskabsforskning, klinisk diagnostik og miljøovervågning. Inkorporering af billeddannelsesfunktioner i flowcytometri kompromitterer analysens gennemløb, primært på grund af begrænsningerne i hastighed og følsomhed i kamerateknologierne. For at overvinde denne hastighed eller gennemstrømningsudfordring mod billedbehandlingsstrømcytometri, samtidig med at billedkvaliteten opretholdes, er asymmetrisk detekterings-time-stretch optisk mikroskopi (ATOM) blevet demonstreret for at muliggøre høj kontrast, single-celle-billedIng med subcellulær opløsning ved en billeddannelses gennemstrømning så høj som 100.000 celler / s. Baseret på billeddannelseskonceptet med konventionel tidstrækbilleddannelse, der afhænger af all-optisk billedkodning og -hentning ved brug af ultrafast bredbånds laserpulser, fremmer ATOM yderligere billeddannelsespræstation ved at forbedre billedkontrasten af ​​umærkede / ufarvede celler. Dette opnås ved at få adgang til fase-gradientinformationen af ​​cellerne, som er spektralkodet til single-shot bredbåndspulser. Derfor er ATOM særligt fordelagtigt i høj-gennemløbsmålinger af enkeltcellemorfologi og tekstur - information, der tyder på celletyper, tilstande og jævne funktioner. I sidste ende kunne dette blive en kraftig billeddannelses-flowcytometriplatform til den biofysiske fænotypning af celler, der supplerer den nuværende state-of-the-art biokemiske markørbaserede cellulære analyse. Dette værk beskriver en protokol til etablering af nøglemodulerne i et ATOM-system (fra optisk frontend til data sRocessing og visualisering backend), såvel som workflow af billeddannelses flow cytometri baseret på ATOM, ved hjælp af humane celler og mikroalger som eksemplerne.

Introduction

Optisk billeddannelse præsenterer et kraftfuldt værktøj og cellebaseret assay til (næsten) ikke-invasivt at visualisere den detaljerede rumlige fordeling af mange cellulære / subcellulære komponenter og dermed afdække en lang række morfologiske, biofysiske og biomolekylære signaturer af celler. Denne evne til at udvinde højindholdsinformation fra enkeltceller er imidlertid generelt blevet kompromitteret, da en enorm og heterogen population af celler skulle undersøges. Dette markerer en fælles afvejning i cellebaserede analyser mellem målekapacitet og indhold. Et bemærkelsesværdigt eksempel er, at tilføjelse af billeddannelsesevne til at flyde cytometri har resulteret i en nedskalering af gennemstrømning med mindst 1-2 størrelsesordener sammenlignet med den af ​​de klassiske ikke-billeddannende flowcytometre. Selv om det kunne tilbyde kompleks morfologisk enkeltcelleanalyse, der ikke er mulig med standardstrømcytometre 1 , mangler billeddannelsesstrømcytometri generelt tilstrækkelig gennemgang til idInddrage cellulær heterogenitet med høj statistisk tillid. Dette er nødvendigt for nye opdagelser i biologi og for at få en forståelse af patogenesen af ​​sygdomme. Den vigtigste tekniske udfordring ligger i den iboende hastighedsgrænse, der pålægges af de almindelige optiske billeddannelsesstrategier: laserstråleskanning ( f.eks. Ved galvanometriske spejle) og / eller billedsensorer ( f.eks. Opladningskoblede enheder (CCD) og komplementære metal- Oxid halvleder (CMOS)). Laserscanningshastigheden begrænses i grunden af ​​scanningsspejles mekaniske inerti, medens rammeprocenten for CCD eller CMOS er begrænset af den grundlæggende afvejning mellem billedhastighed og følsomhed ( dvs. forøgelse af rammebelastningsledningerne til reduceret signaldetekteringsk sensitivitet , og omvendt).

Baseret på en all-optisk, ultrahurtig billedkodningsmekanisme er optisk tidsstregsbilleddannelse blevet demonstreret som en attraktiv platform for høj gennemstrømning af billeddannelsesstrømcytOmeters, uden brug af de konventionelle billedsensorer eller mekanisk laserskanning 2 , 3 . Detaljerede beskrivelser af arbejdspraksis for tidstrækbilleddannelse findes i referencerne 4 , 5 , 6 , 7 . Kort sagt består det af to udskiftelige kortlægningstrin: (i) spektralkodning (bølgelængde-rummapping), hvori de afbildede rums rumlige koordinater kortlægges til forskellige bølgelængder tværs over spektret af den lyspulserede stråle 8 , 9 , Og (ii) en dispersiv Fourier-transformation (bølgelængde-tidskortning) 9 , hvor bølgelængdekomponenterne af individuelle laserimpulser transformeres (straktes) via gruppehastighedsdispersion (GVD) i tidsmæssige (bølgelængde-svævede) bølgeformer ( figur 1 ). En vigtigTræk ved tidstrækbilleddannelse er optisk forstærkning, som spiller en afgørende rolle i bekæmpelsen af ​​følsomhedsfejl på grund af ultrafast fotodetektion og GVD-tab, hvilket forbedrer billed signal-støjforholdet (SNR) uden at blive forurenet af fotodetektorens støj 9 . Da hver laserpuls koder for en linjeskanning af det afbildede præparat, som er ortogonalt for den ensrettet strøm af cellerne, bestemmes en effektiv line-scanhastighed af laserrepetitionshastigheden, som typisk er over 10 MHz. Denne ultrafast operation muliggør uklare, enkeltcelle billedoptagelse med en gennemstrømning på 10.000-100.000 celler / s ( dvs. 10-100 gange højere end konventionelt billeddannelses-flowcytometri). Som følge heraf kunne tidsstrækbilleddannelse finde unikke applikationer i høj gennemstrømning, enkeltcelle, billedbaseret screening, især når der er behov for at identificere ukendt heterogenitet eller sjældne / afvigende celler inden for en betydelig population (tusinder til millioner af cel Ls), såsom sjældne kræftcelle screening 10 eller mikroalger klassifikation 11 .

Time-stretch imaging afhænger overvejende på lysfelt (BF) billedfangst, hvorfra billedkontrasten genereres gennem lysspredning og absorption fra cellerne 2 , 3 , 9 , 10 , 11 . Sådanne etiketfrie, enkeltcelle-billeddannelsesevner kunne omgå de skadelige virkninger, der er forbundet med de fluorescerende mærker, såsom cytotoksicitet og photobleaching, og alligevel tilvejebringe værdifuld information til encelleanalyse baseret på den cellulære og subcellulære tekstur og morfologi. Disse etiketfrie parametre har vist sig at være effektive til den dybe billedklassificering af celler, især når en enorm cellepopulation er tilgængelig 11 ,"Xref"> 12. Imidlertid undlader BF-billeddannelse i mange tilfælde at tilvejebringe tilstrækkelig kontrast til at afsløre den detaljerede morfologi af de etiketfrie transparente celler. Forskellige etiketfrie, fasekontrast-, tidsstrengede billeddannelsesmodaliteter er blevet udviklet til forbedring af billedkontrasten ved ultrafast framehastigheder 13 , 14 , 15 . Blandt disse teknikker blev asymmetrisk detekterings-time-stretch optisk mikroskopi (ATOM) udviklet for at afsløre fase-gradienten (differential-interference-contrast- (DIC) -lignende) kontrast baseret på et koncept svarende til Schlieren-fotografering, hvilket muliggør etiket- Fri, høj kontrastbilleddannelse af enkeltceller med ultrahøj mikrofluidisk hastighed (op til 10 m / s) 16 . Denne effekt kan let genereres gennem skrå påvisning eller belysning ved delvist at blokere den billedkodede strålebane eller vippe bjælken før fotodetektion. En anden fordel ved ATOM er dens aEvne til samtidig at erhverve to fase-gradient kontraster langs modsatte orienteringer. Intensitets subtraktion og summation af to modsatte kontrastbilleder giver henholdsvis den differentielle fase-gradientkontrast og absorptionskontrasten fra samme linjeskanning. Dette arbejde præsenterer en detaljeret protokol, der beskriver implementeringen af ​​ATOM, herunder etablering af den optiske opsætning, prøveudarbejdelsen og dataindsamling og visualisering. Specifikt demonstrerer dette værk ATOM-operationen med enkeltcellet billeddannelse af humane blodlegemer, cancerceller og phytoplankton (mikroalger). Dette fremhæver ATOM's anvendelighed til billeddannende flowcytometri, ikke kun i den biomedicinske arena, men også i marine- og biobrændstofforskning 17 , 18 .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Prøveforberedelse

  1. Prøvepræparation (vedhæftende celler; MCF-7 celler)
    1. Tag cellekulturskålen ud af inkubatoren og drænet dyrkningsmediet.
    2. Skyl cellerne på en skål med 1x phosphatbufret saltvand (PBS) for at fjerne overdreven dyrkningsmedium.
    3. Tilsæt 3 ml af en opløsning af 0,25% trypsin til dyrkningsskålen (diameter på 100 mm) og sæt den i en 37 ° C, 5% CO2-inkubator i 4 minutter.
      BEMÆRK: Trypsinet opløser cellernes klæbende protein, så de løsner fra dyrkningsskålen.
    4. Kontroller, om alle cellerne er løsnet fra kulturskålen ved hjælp af et lysmikroskop (10X objektiv). Hvis ikke, skub forsigtigt cellekulturskålen.
    5. Tilsæt 4 ml af standardkulturmediet (formuleret med 89% Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), 10% føtalt bovint serum (FBS) og 1% penicillin-streptomycin (PS)) for at stoppe trypsins virkning.
    6. TAfbryde hele blandingen (celler i trypsinopløsning og dyrkningsmedium) til et centrifugerør og centrifuge i 5 minutter ved 200 x g.
    7. Fjern al væsken og genopsæt cellerne i 1 ml 1x PBS (pH-værdi: 7,4, forvarmet til 37 ° C).
  2. Prøveforberedelse (dyrkede mikroalger)
    1. Overfør de dyrkede mikroalger og dyrkningsmediet ( f.eks. Havvand, agar eller ferskvand) til nye glaskulturrør (~ 15 ml) i et volumenforhold (mikroalger til dyrkningsmedium) på 1: 5 for at etablere Et nyt subkulturmedium.
    2. Placer glaskulturrørene i et støvtæt kammer under konstant belysning ved kunstig belysning fra lysstofpærer i henhold til en lys / mørk (LD) cyklus (normalt LD 16: 8) i 72-120 timer før forsøget.
    3. Overfør de subkulturerede prøver til et centrifugerør og bland godt.

2. ATOM System Setup


Figur 1: Skematisk af et ATOM-system. En bredbåndspulseret laser anvendes til at levere ultrafastimpulser til ( a ) et tidsstrækmodul og ( b ) et in-line optisk forstærkermodul. Time-stretch-modulet genererer et tog af tidsmæssige bølgeformer, som hver er replikaen af ​​laserkildens bølgelængdespektrum ( dvs. bølgelængde-til-tid kortlægning). Forstærkermodulet bruges til at dæmpe (dispersive) tabskompensation. Den strakte puls bliver derefter ( c ) rumligt dispergeret af et diffraktionsgitter, der danner en 1D spektralbrusebelysning, hvor individuelle bølgelængdekomponenter relæeres af et relælinsepar og fokuseres af objektivlinsen på forskellige positioner på den strømende celle inde i ( d) ) Mikrofluidisk chip. Dette er processen med spektral-kodning. DetSpektralt kodet lys vil igen passere cellen gennem en anden objektivlins og et spejl, der vender tilbage til diffraktionsgitteret og rekombinerer som en rumligt uopløselig pulserende stråle. Denne billedkodede pulserende stråle er så ( E ) opdelt i to stier, således at begge bjælker er delvist blokeret med ( f ) knivkanten, men fra modsatte retninger, inden de kobles i fibrene. Disse to bjælker repræsenterer de to (modsatte) kodede fase-gradient kontraster af det endelige billede. Til samtidig påvisning af begge signalkontraster undergår et af signalerne ( g ) en tidsforsinkelseslinie, således at de to signaler multiplexeres (interleaved) i tid. En højhastighedsfotodetektor og real-time-oscilloskop bruges til dataindsamling. Klik her for at se en større version af denne figur.

  1. Time st Retch modul
    1. Brug en bredbånds femtosekund (fs) eller picosecond (ps) pulserende laser kilde med en anbefalet centerbølgelængde i det nærliggende infrarøde (NIR) interval, 800-1.500 nm.
      BEMÆRK: Den typiske nødvendige pulsbredde kan variere fra under 100 fs til et par ps. Detaljerede krav til de pulserende laserkilder kan ses i Referencer 4 og 5. Vigtige beregninger fremhæves i tabel 1 .
      1. Sørg for, at laserkilden har en høj gentagelseshastighed, som skal være i megahertz-regimet ( f.eks. Tiere MHz) for at sikre ultra hurtig billeddannelse i ATOM. Indstil også peak-output-laserkraften langt under skærmstrømsgrænsen for fiberhulrummet, ca. 1 kW.
      2. Sørg for god temporal og spektral stabilitet af den pulserede laser kilde.
        BEMÆRK: Typisk tolerance i spektral amplitude udsving bør holdes inden for 1,2% 19 , 20 ,Ss = "xref"> 21, som opnået ved den fibermoduslåste laser i denne opsætning.
        BEMÆRK: Den optiske båndbredde af laserkilden forventes at være 10-100 nm, hvilket er afgørende for at sikre tilstrækkelig billedbehandling af synsfelt (FOV) i enkeltcellebilleddannelse 21 .
    2. Ved hjælp af en fiberkollimator kobler du den laserpulserede stråle til en enkeltdispersionel optisk fiber, hvori pulserne strækkes via gruppespredning (GVD) ( figur 1a ).
      BEMÆRK: Dette er processen, hvorefter spektret af hver puls kortlægges på tid som en bølgelængde-bøjet bølgeform ( dvs. bølgelængde-til-tid kortlægning).
      BEMÆRK: Den samlede krævede GVD skal være tilstrækkelig til at sikre, at den samlede ATOM-billedopløsning ikke påvirkes af bølgelængde-til-tiden kortlægningsprocessen (se diskussionen). Typisk i NIR-området bør GVD være langt over 0,1 ns / nm. For eksempel anvendes en single-mode fiber anvendt i thiS nuværende opsætning giver en total GVD på 0,38 ns / nm omkring bølgelængden på 1.060 nm (en total fiberlængde på 10 km).
  2. Spektral-kodende modul
    1. Konstruer et optisk mikroskopsystem til at udføre den spektralkodede billeddannelse af cellerne, som strømmer langs den mikrofluidiske kanal, som illustreret i figur 1 .
      BEMÆRK: Nøglekomponenterne i dette optiske mikroskop omfatter: (1) et diffraktionsgitter, et teleskopisk relælinsemodul (RL1 og RL2 i figur 1 ) og to objektivlinser (Obj1 og Obj2 i Figur 1 ).
      1. Først belyser den tidsstrækede og kollimerede stråle på et diffraktionsgitter (transmissionsgitteret anvendes i denne opsætning) for at generere spektralbruser ( figur 1c ).
        BEMÆRK: Effekten af ​​den diffrakterede stråle ( dvs. diffraktion effektivitet) kan maksimeres ved at justere tHan gitter orientering lukket for Littrow konfiguration.
      2. Konfigurer de to relælinser (RL1 og RL2) i et 4-f billeddannelsessystem ( dvs. placér diffraktionsgitteret på brændpunktet RL1 og adskilt RL1 og RL2 med en afstand svarende til summen af ​​deres brændvidder. Vil derefter blive afbildet på objektivobjektivets objektiv Obj1).
      3. Juster spektralbruset forsigtigt for at fylde Obj1's blændeåbning, således at spektralbrusken kan projiceres og fokuseres på mikroskopets billedplan.
        BEMÆRK: Her er NA'en af ​​objektivlinsen (Obj1 i Figur 1 ) 0,75.
      4. Placér en anden objektivlins (Obj2 i Figur 1 ) med et lignende NA og et plane spejl ved den bageste åbning af denne objektivlins (Obj2), således at spektralbruserstrålen kan justeres for at passere billedplanet dobbelt og vende tilbage til Diffraktionsgitter.
      5. JustereParet af objektive linser (Obj1 og Obj2), således at deres fokalplaner overlapper hinanden. Kontroller for at se om spektralbrusken dobbeltkører billedplanet på samme sted og vender tilbage til gitteret efter den samme sti. Hvis ikke, udfør yderligere justering og afstemning af det optiske system.
        BEMÆRK: Det returnerede lys skal passere gennem en yderligere strålesplitter, således at lyset kan overføres til et asymmetrisk detektionsmodul.
      6. Juster den optiske forstærkerforstærkning på et passende niveau, således at det resulterende signal kan detekteres af fotodetektoren med en god SNR, som typisk er> 10 dB.
      7. Placer og juster mikrofluidiske chipets position på prøveplatformen og sørg for, at spektralbrusebadet og dermed billedområdet placeres over mikrofluidkanalen ( figur 1d ).
        BEMÆRK: Spektralbrusken er belyst ortogonalt til strømningsretningen af ​​fluidum inde i mMikrofluidisk chip, således at den flydende bevægelse automatisk udfører todimensionale (2D) scanninger.
  3. Asymmetrisk detektionsmodul
    1. Anbring en ekstra strålesplitter for at adskille den billedkodede stråle i to ( figur 1e ).
      BEMÆRK: Hver stråle replika er delvist blokeret af en knivkant.
    2. Mål og optag strålens optiske effekt før stråleblokken. Derefter placeres knivkanterne manuelt (monteret på en lineær oversættelsestrin), så de næsten blokerer halvdelen af ​​strålen (ved visuel inspektion). Brug derefter den optiske effektmåler til at overvåge strålekraften, mens du finjusterer positionen af ​​knivkanterne ved at oversætte dem over bjælken.
      BEMÆRK: Det foreslås, at den optimale position er, hvor strømmen reduceres med ~ 50% af den oprindelige værdi ( dvs. det ublockerede tilfælde). Dette er den betingelse, der giver den bedste kombination af billedsignalStyrke og billedkontrastforbedring.
    3. Gentag trin 2.3.2 for en anden stråle replika. Bemærk at orienteringen af ​​den delvise stråleblok for en stråle skal være modsat i forhold til den anden stråle ( figur 1f ).
    4. Par de to delvist blokerede bjælker i to separate, single-mode fiberarme gennem to-fiberkollimatorer.
      BEMÆRK: En af armene har en ekstra fiberlængde, der tjener som en fiberbaseret forsinkelseslinje, for at indføre en tidsforsinkelse i forhold til den anden replika (uden forsinkelseslinien) ( figur 1g ). Begge er rettet til en enkelt fiber af en fiberkobler før fotodetektion. Tidsforsinkelsen skal være lang nok til midlertidigt at adskille de to replikaer og kort nok til at undgå tidsmæssig overlapning med den næste bølgeform ( dvs. de to replikaer er altid tidsinterleveret og tidsmultiplexeret i en enkelt fiber forud for detektion ( figur 2a )).
    5. KasketTure og digitalisere de detekterede optiske signaler med real-time-oscilloskopet. Bemærk at båndbredden og dermed oscilloskopets prøveudtagningshastighed skal være tilstrækkelig høj til at sikre, at de ikke påvirker den endelige billedopløsning (se diskussionen).
      BEMÆRK: Her kræves der med en GVD på 0,38 ns / nm en båndbredde for båndbredde og samplingshastighed på henholdsvis> 20 GHz og> 40 GSa / s.

3. Eksperimentelle procedurer

  1. Prøveindlæsning
    1. Udfør celletælling under et konventionelt fasekontrastmikroskop i et standard hæmocytometer.
    2. Juster celletætheden ved at fortynde med 1x PBS (med kildevand til mikroalger) og bland godt med en pipette.
      BEMÆRK: Den foreslåede koncentration er fra 10 5 til 106 celler / ml.
    3. Monter den mikrofluidiske chip på prøveplatformen i det optiske billeddannelsessystem.
      BEMÆRK: Den mikrofluidiskeChippen fremstilles primært af polydimethylsiloxan (PDMS) og fremstilles ved anvendelse af standard replikestøbningsmetoden. Den mikrofluidiske kanal er konstrueret med en asymmetrisk buet kanal for at generere fokuseringseffekten for inertielstrømmen, således at cellerne kan strømme i en enkelt fil i billedafsnittet (med en dimension på 80 μm x 80 μm (højde x bredde)) ved høj hastighed .
    4. Overfør den tæthedsjusterede celleopløsning til en 10 ml sprøjte.
    5. Tilslut sprøjten til mikrofluidisk chipets indløb og et centrifugalrør til udgangen af ​​den mikrofluidiske chip til bortskaffelse.
    6. Monter sprøjten på en sprøjtepumpe og indstil en passende strømningshastighed for at give ønskelig gennemstrømning og undgå at påføre overdreven forskydningskraft mellem cellerne og kanalen.
      BEMÆRK: Den lineære hastighed af prøverne skal ligge inden for 0,5 og 10 m / s. Bemærk, at det før den faktiske billedoptagelse ofte er nødvendigt at finjustere systemet, hvad angår maksimering afBilledsignalstyrke og optimering af billedfokusering ved at gentage trin 2.2.1.4-2.2.1.6.

4. Data Acquisition

  1. Indstil et passende antal datapunkter, der skal gemmes for hvert eksperiment. Antallet af datapunkter, der skal gemmes, afhænger af størrelsen og flowhastigheden af ​​prøverne.
    BEMÆRK: Det er typisk indstillet til 8-16 millioner prøvepunkter under en samplingshastighed på 80 GSa / s.
  2. Indhent og gem dataene i en batch-tilstand ved hjælp af oscilloskopet.

5. Backend Processing

Figur 2
Figur 2: Rekonstruktion af ATOM-billeder fra Line Scan Time Trace. For at rekonstruere ATOM-billederne med absorptionskontrast og differentieret (forbedret) fase-gradientkontrast, ekstraheres to sæt tidsstrækede pulser (se de lilla og grønne pulser) fra( A ) det tidsmultiplexerede temporære bølgeformspor og derefter digitalt segmenteret og stablet for at danne ( b ) to 2D-billeder, der viser de to modsatte fase-gradientkontraster. Bemærk, at der kræves en skæreoperation for at danne ( c ) de forvrængningsfrie billeder ved at kompensere for delindeksskiftet på grund af afrundingsfejlen i laserrevisionshastighedsestimeringen. Ved at subtrahere ( d ) raw line-scan fra laserkildens spektralintensitetskuvert kan baggrunden for billederne fjernes. ( G ) Et absorptionskontrastbillede kan opnås ved hjælp af en pixel-for-pixelintensitetsopsummering af billederne ( e ) og ( f ), medens ( h ) et differentielt fase-gradient kontrastbillede kan opnås ved subtraktion af billeder ) Og (f). Klik her for at se en større versionAf denne figur.

  1. Overfør data fra oscilloskopet til computere til offline image rekonstruktion.
    BEMÆRK: Her gemmes dataene i en bærbar harddisk og overføres manuelt mellem oscilloskopet og behandlingscomputere. Kapaciteten på harddisken skal være over 500 GB for hvert eksperiment.
    1. Brug nøglebilledet rekonstruktion rutine til digitalt at stable linjeskanninger for at danne et 2D billede ( Figur 2 ).
      BEMÆRK: Det brugerdefinerede program (i MATLAB) producerer derefter to asymmetriske detektionsbilleder ved at adskille de to tidsmultiplexede datasæt (lilla og grønne bølgeformer i figur 2 ).
      1. Hent et forskelligt fase-gradient kontrastbillede ved at subtrahere intensiteterne af de to asymmetriske detektionsbilleder; Et absorptions kontrastbillede kan opnås ved at tilføje de to asymmetriske detektionsbilleder. Se udvalgte billeder af MCF-7 og mikroalger iFigur 3 . Bemærk, at baggrundsprofilerne for de enkelte billeder først skal elimineres, og deres intensiteter skal normaliseres før billedsummeringen og subtraktionerne.
    2. Generer et bibliotek med parametre afledt af billederne, såsom cellevolumen, cirkularitet og absorptionsdensitet osv. Til yderligere analyse.
  2. Indtast databiblioteket i data visualiseringsplatformen ( Figur 4 ).
    1. Indlæs biblioteket med parametre og de tilsvarende rekonstruerede billeder til platformen til visualisering af grænseflader.
    2. Indstil akserne som parametre af interesse.
      BEMÆRK: Parametrene er problemspecifikke og defineres af brugeren. De er afledt af ATOM-billederne ved MATLAB-programmet. Her er den optiske absorptionsdensitet af cellen, celleområdet, cellevolumenet og cellecirkulariteten tilgængelig til udvælgelse. Vælg datasættet, der skal vises, således at hvert cellebillede kan visualiseres som et andet datapunkt på scatterplotten.
    3. Flyt musemarkøren til hvert punkt, så det tilsvarende billede og andre parametre vises i et flydende undervindue.
      BEMÆRK: Axerne kan ændres mellem de lineære og logaritmiske skalaer på en interaktiv måde.
    4. Udfør yderligere analyse af enhver undergruppe af datasættet ved manuelt gating på scatter plot.
      BEMÆRK: Histogrammet i alle parametre i den indhegne delmængde kan afbildes i forhold til hele bibliotekets. De separate histogrammer vises i et andet flydende undervindue.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Dette arbejde illustrerer to single-celledemonstrationstemonstrationer af ATOM: et med pattedyrsceller (human perifer blodmononukleær celle s (PBMC) og brystcancerceller (MCF-7)) og en anden med phytoplankton s (Scenedesmus og Chlamydomonas). Det første forsøg blev motiveret af den voksende interesse for væskebiopsi til påvisning, opregning og karakterisering af cirkulerende tumorceller (CTC'er) i blodet 23 . Evnen til at måle CTC'er spredt fra primære tumorsteder til blodstrømmen muliggør undersøgelse af metastatisk kræftprogression 24 , 25 . Udfordringer findes dog i CTC analyse: (i) CTC-tællingen er signifikant lavere end den ublu mængde blodceller i helblod. Nuværende metoder til at identificere og genvinde CTC'erne involverer for det meste celleberigelse og separeringstrin Class = "xref"> 26 , 27 , 28 . Imidlertid forbliver den kontaminerende baggrund fra blodceller og / eller levedygtigheden af ​​de berigede CTC'er en bekymring for efterfølgende molekylær analyse ( fx RNA-sekventering) 29 . Ii) CTC'er er stærkt heterogene med hensyn til både biofysiske og biomolekylære signaturer, hvilket begrænser effektiviteten af ​​CTC-berigelsen og detektion. Til dette formål er etiketfri billeddannelses-flowcytometri med en høj billeddannelsesmængde et attraktivt værktøj, der muliggør direkte billeddannelse og identifikation af CTC'er inden for en enorm population af blodlegemer, hvilket minimerer eller endog omgår tilsætningstrinene.

Det andet eksperiment er særligt relevant for storskala fytoplankton karakterisering, hvilket kan påvirke fremskridt inden for miljøvidenskab ( fx påvisning af skadelige algerblom (HAB) arterS = "xref"> 29 og identifikation af mikroalgiske arter som vedvarende biodieselkilder) 17 . Aktiveret af ATOM kunne muligheden for høj gennemstrømning og høj kontrast single-celle billeddannelse af fytoplankton være værdifuldt for at afsløre den komplekse heterogenitet i størrelse, tekstur og morfologi på tværs af forskellige slægter og arter.

Figur 3 viser billeder af pattedyrceller, MCF-7 og PBMC (flyder med en hastighed på ~ 10 m / s) såvel som mikroalger, Scenedesmus og Chlamydomonas (flyder med en hastighed på ~ 2 m / s), fanget af ATOM . I alle fire tilfælde blev de to modsatte fase-gradientkontraster opnået ved de to tidsmultiplexerede, asymmetrisk detekterede signaler (beskrevet i trin 2.3). De udviser begge et pseudo-tredimensionelt udseende, der ligner DIC-billederne, der hver især viser to modsatte skyggeorienteringer (kolonne 1 og 2 i figur 3a dvs. de absorberende og forøgede differentielle fase-gradientkontraster; kolonne 3 og 4 i figur 3a -d ). Bemærk, at det ikke kun kan mærkefrit ATOM afsløre de uklare enkeltcellebilleder, men også karakterisere cellulære strukturer med høj kontrast. Specielt kan vakuolerne, pyrenoidet og flagellaen i mikroalgerne tydeligt visualiseres i figur 3 . Denne billeddannelsesattribut gør det muligt at udvinde et rigt sæt identifikatorer afledt af de egentlige cellulære og subcellulære teksturer / morfologier til automatisk billedbaseret klassificering.

Dette arbejde viser, at biofysiske egenskaber, såsom cellecirkularitet og cellestørrelse, kan anvendes fo R klassificeringen af ​​MCF-7 og PBMC. Bemærk at to klynger observeres i MCF-7-prøven. Tilgængeligheden af ​​billeder med høj kontrast til alle datapunkter gør det muligt for os at undersøge, at en af ​​klyngerne svarer til fragmenter / affald ( figur 4a ). En lignende klassifikation mellem to arter af fytoplankton baseret på ATOM-billeder blev også udført. Her er klassificeringsresultaterne præsenteret i en form af et 2D-scatteringsbillede, der visualiseres af den brugerdefinerede brugergrænseflade ( figur 4 ). Hvert annoteret datapunkt i scatterplot, der svarer til hver celle, kan undersøges yderligere med forskellige parametre afledt af ATOM. Det tilsvarende ATOM-billede kan også interaktivt vises direkte på plottet. Manuel gating understøttes også i denne visualiseringsgrænseflade for at lette yderligere klassificering og analyse.

Iles / ftp_upload / 55840 / 55840fig3.jpg "/>
Figur 3: ATOM Image Galley af mikroalger og mammale celler ved en ultrafast flydende hastighed (~ 2-10 m / s). ( A ) Scenedesmus; ( B ) chlamydomonas; ( C ) brystcancerceller, MCF-7; Og ( d ) human PBMC. Scenedesmus og Chlamydomonas strømmer ved ~ 2 m / s, mens MCF-7 og PBMC strømmer ved 10 m / s. De venstre to kolonner (kolonne 1 og 2) for hver celletype repræsenterer to modsatte fase-gradientkontraster. Kolonner 3 og 4 repræsenterer henholdsvis absorptionskontrast og differentieret (forbedret) fase-gradientkontrast. Skalestænger = 20 μm (i rødt). Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 4
FiGure 4: Et grafisk brugergrænseflade til cytometrisk analyse baseret på ATOM-billeder. I denne grænseflade kan brugeren udføre celletypeklassifikation og analyse ved at definere forskellige celleparametre ( fx cellestørrelse, cirkularitet, absorptionsdensitet osv. ) Afledt af ATOM-billederne. Resultatet kan repræsenteres i et scatterplot, der vises i midterpanelet. Adgang og styring af forskellige skærmindstillinger, som omfatter skiftende parametre og skalering for x- og y-aksen (X- og Y-aksens parameterknapper) og skift mellem datasæt (Datasæt-knap), er mulig. Detaljeret celleinformation (Celleinformationsfane) kan læses ved at svinge på et bestemt datapunkt. For at aktivere hurtig navigation kan brugeren skifte til en anden visningstilstand og samtidigt vise alle billeder på scatterplot i centerpanelet (Visningstilstandsknap). Manuel gating kan også udføres til yderligere analyse. Gule datapunkter repræsenterer MCF-7 celleprøven (i ( a </ B )), mens de røde datapunkter repræsenterer den humane PBMC-prøve (i (a)) og Chlamydomonas (CHA) (i (b)). Klik her for at se en større version af denne figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Der er flere tekniske detaljer, der kræver særlig opmærksomhed under ATOM-systemopsætningen. For det første er det vigtigt at bemærke, at asymmetrisk / skrå spektralkodet belysning kunne introducere resterende fase-gradientkomponenter ( dvs. skyggeeffekten) i absorptionskontrasten og påvirke forstærkningen af ​​fase-gradientkontrast i ATOM. Derfor bør denne effekt af skrå belysning minimeres. For det andet skal det understreges, at tidsmultiplexerings- eller tidsinterleaving-ordningen med to replikaer ikke resulterer i nogen væsentlig kompromis med billedhastigheden ( dvs. linjeskanningsfrekvensen på> MHz kan stadig opretholdes), idet den samlede tidsmæssige bredde Af to stråle-replikaer overstiger ikke en linje-scan periode. For det tredje afhænger den optimale konfiguration af det integrerede modul af dispersive fibre og forstærkere af den målrettede forstærkning som specifikationen af ​​de tilgængelige forstærkere. Optisk forstærkning er essentiaJeg er i gang med at stræbe for at bekæmpe det optiske tab i forbindelse med GVD 22 . I princippet kan den implementeres af en hvilken som helst type optisk forstærker, fortrinsvis i fiberformatet, således at den er kompatibel med den fiberbaserede tidsstrækproces ( figur 1b ). Praktiske eksempler på optiske fiberbaserede optiske forstærkere omfatter erbiumdoterede fiberforstærkere (EDFA, til operationsbølgelængder på ~ 1500-1.600 nm), ytterbiumdoterede fiberforstærkere (YDFA; til driftbølgelængder på ~ 1.060 nm), fiberramanforstærkere, Og fiberoptiske parametriske forstærkere (FOPA; for en hvilken som helst operationsbølgelængde, i princippet så længe en pumpelaserkilde er tilgængelig). Forstærkerstøj skal også overvejes nøje i moduldesign. Detaljeret teori kan ses i Reference 8. En fælles konfiguration kan indebære multiple / cascaded fiberforstærkere indsat mellem flere dispersive fiber segmenter (hver har en længde på nogle få km). For ATOM aNd time-stretch imaging generelt, den typiske on-off optisk effektforøgelse bør være omkring 20-30 dB. Det skal bemærkes, at driftens bølgelængdeområde typisk er begrænset til ~ 800-1,550 nm, hovedsageligt på grund af det meget høje optiske fibertab ved kortere bølgelængder ( dvs. synlige bølgelængder). Derfor er fiberbaseret ATOM på samme måde som flertallet af tidstrækbilleddannelsesdemonstrationerne ikke umiddelbart anvendelige til fluorescensafbildning, hvor synlige lysoperationer stadig er almindelige. Ikke desto mindre bemærker, at et friluftspuls-strækkende koncept, der ligner tidstrækning, kaldet frilufts-vinkel-chirpforstærket forsinkelse (FACED), for nylig er blevet brugt til ultrasnit laser scanning billeddannelse i ATOM såvel som til fluorescensbilleddannelse Ved synlige bølgelængder 30 .

En anden vigtig parameter, der kræver subtile design overvejelser er billedopløsning. I modsætning til klassisk lysmikroskopi, billedetOpløsning af ATOM og generel tidsstrækning imaging langs spektralbruseraksen styres af tre begrænsende regimer 22 : (i) den rumlige dispersionsbegrænsede opløsning, som er relateret til spektralopløsningen af diffraktionsgitteret betegnet som δ x rumlig ; (Ii) den stationære fase tilnærmelsesgrænse, der defineres som tvetydigheden af ​​bølgelængde-kortlægningsprocessen δ x SPA , som omvendt skaleres med kvadratroden af ​​GVD 22 ; Og (iii) fotodetektorbegrænset opløsning δ x det , der beskriver fotodetektorens endelige båndbredde, som også kunne påvirke den endelige rumlige opløsning. Generelt defineres den største værdi blandt disse tre parametre som billedopløsningen af ​​ATOM, δ x ( dvs. δ x = max { δ x rumlig , δ SPA , δ x det }). Det er altid ønskeligt at sikre, at den endelige opløsning er begrænset til rumsdispersion ( dvs. δ x = δ x rumlig > δ x SPA > δ x det ). Derfor skal både GVD (trin 2.2.1.1) og båndbredden (trin 2.3.5) i fotodetektoren være tilstrækkeligt høj til at tilfredsstille denne tilstand. På den anden side evalueres billedopløsningen langs strømningsretningen af ​​diffraktionsgrænsen. Dette er kun sandt, når Nyquist's prøvetagningsbetingelse er tilfredsstillende ( dvs. gentagelseshastigheden for laseren (R, i Hz) og strømningshastigheden af ​​cellerne (F, i m / s) skal indstilles således, at pixelstørrelsen i Strømningsretningen er F / R <2 δ y, hvor δ y er den diffraktionsbegrænsede opløsning langs strømningsretningen). Bemærk at gitterets specifikationer ( f.eks. </ Em> sporetæthed) og objektivlinsen ( f.eks. Den numeriske blænde (NA)) skal være omhyggeligt designet til at matche den målrettede opløsning.

Mens den nuværende ATOM-demonstration og -protokol viser, at dataopsamlingen udføres af oscilloskop, og databehandlingen efterfølges offline, er det mere gunstigt at opnå realtid, kontinuerlig dataindsamling, behandling og endda analyse, især ved at udnytte evnen til at opnå De ultra hurtige og høj kontrast billedoptagelser evner bragt af ATOM. Med henblik herpå bør der vedtages en højproduktions- og høj-gennemgangssignalbehandlingsenhed, såsom en grafisk behandlingsenhed (GPU) og / eller et feltprogrammerbart portarrangement (FPGA), som har vist sig at være i stand til at Opnå en databehandling gennemstrømning så højt som ~ 1-10 GB / s. Dette er kompatibelt med ATOM's ultrafast prøveudtagningsevne ( dvs. ~ 10 GSa / s). Integrationen af ​​ATOM og en high-throughput databehandling aCcelerator muliggør et nyt paradigme i data-drevne biologiske studier, især ved at løse den ukendte heterogenitet mellem forskellige enkeltceller i en enorm befolkning. En sådan teknologi kunne også styrke en ny generation af klinisk forskning, hvor sjældne, afvigende celler i sygdomsprocessen kan kvantificeres på en etiketfri måde.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Vi takker hr. P. Yeung for at forberede MCF-7 til os. Dette arbejde blev delvist støttet af tilskud fra Research Grant Council i Hongkongs særlige administrationsregion, Kina (Projekt nr. 17259316, 17207715, 17207714, 17205215 og HKU 720112E), Innovations- og teknologistøtteprogrammet (ITS / 090/14 ) Og HKU's udviklingsudviklingsfond.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Nikon Plan Fluorite Physiology Objectives 40X Nikon MRF07420 Objective lens (Obj2)
Olympus Plan Fluorite Objective, 0.75 NA, 0.51 mm WD, 40X Olympus RMS40X-PF Objective lens (Obj1)
N-BK7 Plano-Convex Lenses Thorlabs LA1145-C For relaying spectral shower
FC/APC Fiber Collimation Package Thorlabs F220APC-1064 For outputing and collecting laser pulses
Pellicle beamsplitter Thorlabs BP145B3 For making beam replica
Protected silver mirror Thorlabs PF10-03-P01 For reflecting light
800-1650nm 12GHz single mode DC-coupled NIR Photoreceiver Newport 1544-B For converting light into electrical signal
Infiniium High-Performance Oscilloscope Agilent DSOX91604A To save the light-converted electrical signals
HI1060 optical fiber Corning HI1060 Optical fiber for time-stretch
YTTERBIUM DOPED FIBER AMPLIFIER Keopsys KPS-STD-BT-YFA-37-BO-SM-111-FA-FA Optical in-line amplifier
Holographic grating Wasatch Photonics 020305-6 Grating
Infuse/Withdraw Syringe Pumps Harvard Apparatus PHD 2000 Syringe pump for sample loading in micro-fluidic channels

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lau, A. K. S., Wong, T. T. W., Shum, H. C., Wong, K. K. Y., Tsia, K. K. Imaging Flow Cytometry: Methods and Protocols. Barteneva, N. S., Vorobjev, I. A. , Springer New York. New York, NY. 23-45 (2016).
  2. Goda, K., Tsia, K. K., Jalali, B. Serial time-encoded amplified imaging for real-time observation of fast dynamic phenomena. Nature. 458 (7242), 1145-1149 (2009).
  3. Goda, K., Jalali, B. Dispersive Fourier transformation for fast continuous single-shot measurements. Nat Photon. 7 (2), 102-112 (2013).
  4. Lau, A. K., Shum, H. C., Wong, K. K., Tsia, K. K. Optofluidic time-stretch imaging - an emerging tool for high-throughput imaging flow cytometry. Lab Chip. 16 (10), 1743-1756 (2016).
  5. Lau, A. K. S., Tang, A. H. L., Xu, J., Wong, X. W., Y, K. K., Tsia, K. K. Optical Time Stretch for High-Speed and High-Throughput Imaging - From Single-Cell to Tissue-Wide Scales. IEEE J. Sel. Top. in Quant. Electron. 22 (4), (2016).
  6. Lei, C., Guo, B., Cheng, Z., Goda, K. Optical time-stretch imaging: Principles and applications. Appl Phys Rev. 3 (1), 011102 (2016).
  7. Lei, C., Guo, B., Cheng, Z., Goda, K. Optical time-stretch imaging: Principles and applications. Applied Physics Reviews. 3 (011102), (2016).
  8. Goda, K., et al. High-throughput single-microparticle imaging flow analyzer. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (29), 11630-11635 (2012).
  9. Goda, K., Solli, D. R., Tsia, K. K., Jalali, B. Theory of amplified dispersive Fourier transformation. Physical Review A. 80 (4), 043821 (2009).
  10. Goda, K., et al. High-throughput single-microparticle imaging flow analyzer. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (29), 11630-11635 (2012).
  11. Lai, Q. T. K., et al. High-throughput time-stretch imaging flow cytometry for multi-class classification of phytoplankton. Opt. Express. 24 (25), 28170-28184 (2016).
  12. Chen, C. L., et al. Deep Learning in Label-free Cell Classification. Sci Rep. 6, 21471 (2016).
  13. Fard, A. M., et al. Nomarski serial time-encoded amplified microscopy for high-speed contrast-enhanced imaging of transparent media. Biomed Opt Express. 2 (12), 3387-3392 (2011).
  14. Lau, A. K., et al. Interferometric time-stretch microscopy for ultrafast quantitative cellular and tissue imaging at 1 mum. J Biomed Opt. 19 (7), 76001 (2014).
  15. Mahjoubfar, A., Chen, C., Niazi, K. R., Rabizadeh, S., Jalali, B. Label-free high-throughput cell screening in flow. Biomed Opt Express. 4 (9), 1618-1625 (2013).
  16. Wong, T. T., et al. Asymmetric-detection time-stretch optical microscopy (ATOM) for ultrafast high-contrast cellular imaging in flow. Sci Rep. 4, 3656 (2014).
  17. Mata, T. M., Martins, A. A., Caetano, N. S. Microalgae for biodiesel production and other applications: A review. Renew Sustainable Energy Rev. 14 (1), 217-232 (2010).
  18. Irigoien, X., Huisman, J., Harris, R. P. Global biodiversity patterns of marine phytoplankton and zooplankton. Nature. 429 (6994), 863-867 (2004).
  19. Wei, X., et al. Coherent Laser Source for High Frame-Rate Optical Time-Stretch Microscopy at 1.0 µm. IEEE J. Sel. Top. Quantum Electron. 20 (5), 384-389 (2014).
  20. Wei, X., et al. Breathing laser as an inertia-free swept source for high-quality ultrafast optical bioimaging. Opt. Lett. 39 (23), 6593-6596 (2014).
  21. Xu, Y., Wei, X., Ren, Z., Wong, K. K. Y., Tsia, K. K. Ultrafast measurements of optical spectral coherence by single-shot time-stretch interferometry. Sci Rep. 6, 27937 (2016).
  22. Tsia, K. K., Goda, K., Capewell, D., Jalali, B. Performance of serial time-encoded amplified microscope. Opt. Express. 18 (10), 10016-10028 (2010).
  23. Alix-Panabières, C., Pantel, K. Challenges in circulating tumour cell research. Nat Rev Cancer. 14 (9), 623-631 (2014).
  24. Kling, J. Beyond counting tumor cells. Nat Biotech. 30 (7), 578-580 (2012).
  25. Hodgkinson, C. L., et al. Tumorigenicity and genetic profiling of circulating tumor cells in small-cell lung cancer. Nat Med. 20 (8), 897-903 (2014).
  26. Ozkumur, E., et al. Inertial focusing for tumor antigen-dependent and -independent sorting of rare circulating tumor cells. Sci Transl Med. 5 (179), (2013).
  27. Hou, H. W., et al. Isolation and retrieval of circulating tumor cells using centrifugal forces. Scientific Reports. 3, 1259 (2013).
  28. Karabacak, N. M., et al. marker-free isolation of circulating tumor cells from blood samples. Nat. Protocols. 9 (3), 694-710 (2014).
  29. Krebs, M. G., et al. Molecular analysis of circulating tumour cells-biology and biomarkers. Nat Rev Clin Oncol. 11 (3), 129-144 (2014).
  30. Wu, J., et al. Ultrafast Laser-Scanning Time-Stretch Imaging at Visible Wavelengths. Light Sci Appl. , (2016).

Tags

Engineering Mikroskopi billeddannelsesstrømcytometri mikrofluidisk tidsstræk imaging high-throughput screening single-cell analyse
Mikrofluidisk Imaging Flow Cytometry ved asymmetrisk detektion Time-stretch Optical Microscopy (ATOM)
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Tang, A. H. L., Lai, Q. T. K.,… More

Tang, A. H. L., Lai, Q. T. K., Chung, B. M. F., Lee, K. C. M., Mok, A. T. Y., Yip, G. K., Shum, A. H. C., Wong, K. K. Y., Tsia, K. K. Microfluidic Imaging Flow Cytometry by Asymmetric-detection Time-stretch Optical Microscopy (ATOM). J. Vis. Exp. (124), e55840, doi:10.3791/55840 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter