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Engineering

Citometria de Fluxo de Imagem Microfluídica por Microscopia Óptica de Tempo-estiramento com detecção assimétrica (ATOM)

Published: June 28, 2017 doi: 10.3791/55840
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, 1, 1, 2, 1, 1
1Department of Electrical and Electronic Engineering, The University of Hong Kong, 2Department of Mechanical Engineering, The University of Hong Kong

Summary

Este protocolo descreve a implementação de um sistema de microscopia óptica de estiramento de tempo de detecção assimétrica para imagens de célula única em fluxo microfluídico ultra-rápido e suas aplicações em citometria de fluxo de imagem.

Abstract

Escalar o número de parâmetros mensuráveis, que permite análises de dados multidimensionais e, portanto, resultados estatísticos de maior confiança, tem sido a principal tendência no desenvolvimento avançado de citometria de fluxo. Notavelmente, adicionar recursos de imagem de alta resolução permite a complexa análise morfológica de estruturas celulares / sub-celulares. Isso não é possível com citometros de fluxo padrão. No entanto, é valioso para o avanço do conhecimento das funções celulares e pode beneficiar a pesquisa de ciências da vida, diagnósticos clínicos e monitoramento ambiental. A incorporação de capacidades de imagem na citometria de fluxo compromete o rendimento do ensaio, principalmente devido às limitações de velocidade e sensibilidade nas tecnologias da câmera. Para superar essa velocidade ou desafio de produção enfrentando a citometria de fluxo de imagem, preservando a qualidade da imagem, demonstrou-se que o microscópio óptico de estiramento de tempo de detecção assimétrica (ATOM) possibilita a imagem de célula única de alto contrasteCom resolução sub-celular, a uma taxa de transferência de imagens de até 100.000 células / s. Com base no conceito de imagem da imagem de estiramento temporal convencional, que se baseia na codificação e recuperação de imagens totalmente ópticas através do uso de pulsos de laser de banda larga ultra-rápidos, o ATOM avança ainda mais o desempenho da imagem, aumentando o contraste da imagem de células não marcadas / não coradas. Isso é conseguido ao acessar a informação de gradiente de fase das células, que é codificada espectralmente em pulsos de banda larga de disparo único. Por isso, ATOM é particularmente vantajosa em medidas de alto rendimento de morfologia e textura de célula única, indicativa de tipos de células, estados e funções par. Em última análise, isso pode se tornar uma poderosa plataforma de citometria de fluxo de imagem para a fenotipagem biofísica de células, complementando o atual teste celular baseado em marcador bioquímico de última geração. Este trabalho descreve um protocolo para estabelecer os módulos-chave de um sistema ATOM (do frontend óptico para dados pBackend de rocessamento e visualização), bem como o fluxo de trabalho de citometria de fluxo de imagem baseada em ATOM, utilizando células humanas e microalgas como exemplos.

Introduction

A imagem óptica apresenta uma ferramenta poderosa e um ensaio baseado em células para (quase) não invasivamente visualizar a distribuição espacial detalhada de muitos componentes celulares / subcelulares, descobrindo assim uma multiplicidade de assinaturas morfológicas, biofísicas e biomoleculares das células. No entanto, esta capacidade de extrair informações de alto conteúdo de células únicas geralmente foi comprometida quando uma enorme e heterogênea população de células teve que ser investigada. Isso marca um trade-off comum em ensaios baseados em células entre a taxa de transferência e o conteúdo. Um exemplo notável é que a adição de capacidade de imagem para a citometria de fluxo resultou em um down-scaling de throughput em pelo menos 1-2 ordens de grandeza em comparação com os citometros de fluxo não convencionais. Embora possa oferecer análise morfológica complexa de célula única que não seja possível com citometros de fluxo padrão 1 , a citometria de fluxo de imagem geralmente não possui throughput suficiente para idEnriquecer a heterogeneidade celular com alta confiança estatística. Isso é necessário para novas descobertas em biologia e para obter uma compreensão da patogênese das doenças. O principal desafio técnico reside no limite de velocidade inerente imposto pelas estratégias comuns de imagem óptica: varredura do raio laser ( por exemplo, por espelhos galvanométricos) e / ou sensores de imagem ( por exemplo, dispositivo de acoplamento de carga (CCD) e complemento de metal- Semicondutor de óxido (CMOS)). A velocidade de varredura a laser é intrinsecamente restrita pela inércia mecânica dos espelhos de varredura, enquanto a taxa de quadros do CCD ou CMOS é limitada pelo trade-off fundamental entre a velocidade de imagem e a sensibilidade ( ou seja, aumentando a taxa de quadros para reduzir a sensibilidade de detecção de sinal , e vice versa).

Com base em um mecanismo de codificação de imagem totalmente óptico e ultra-rápido, a imagem óptica de tempo-estiramento foi demonstrada como uma plataforma atraente para o fluxo de imagens de alto rendimentoOmeters, sem necessidade dos sensores de imagem convencionais ou varredura a laser mecânica 2 , 3 . Descrições detalhadas do princípio de funcionamento da imagem de estiramento no tempo podem ser encontradas nas referências 4 , 5 , 6 , 7 . Em resumo, consiste em duas etapas de mapeamento intercambiáveis: (i) codificação espectral (mapeamento de espaço de onda), em que as coordenadas espaciais da amostra representada são mapeadas para diferentes comprimentos de onda em todo o espectro do feixe de pulsos de luz 8 , 9 , E (ii) uma transformação de Fourier dispersiva (mapeamento de comprimento de onda) 9 , na qual os componentes do comprimento de onda dos impulsos laser individuais são transformados (esticados) através da dispersão de velocidade do grupo (GVD) em formas de onda temporais (varredura de comprimento de onda) ( Figura 1 ). Um importanteA característica da imagem de estiramento no tempo é a amplificação óptica, que desempenha um papel crítico no combate à perda de sensibilidade devido à fotodetecção ultra-rápida e perda de GVD, aumentando assim a relação sinal-ruído da imagem (SNR) sem ser contaminada pelo ruído fotodetetor 9 . Uma vez que cada pulso laser codifica uma varredura de linha do espécime formado, que é ortogonal ao fluxo unidirecional das células, uma taxa efetiva de varredura de linha é determinada pela taxa de repetição do laser, que normalmente é superior a 10 MHz. Esta operação ultra-rápida permite a captura de imagens sem célula sem borrão a uma taxa de transferência de 10 000 a 100 000 células / s ( ou seja, 10 a 100 vezes maior do que a citometria de fluxo de imagem convencional). Como resultado, a imagem em tempo de estiramento pode encontrar aplicações únicas em rastreamento baseado em imagens de alto nível, de célula única, especialmente quando há necessidade de identificar heterogeneidade desconhecida ou células raras / aberrantes em uma população considerável (milhares a milhões de Cel Ls), como o raro exame de células cancerosas 10 ou a classificação de micro-algas 11 .

A imagem de tempo de alongamento depende predominantemente da captura de imagem de campo brilhante (BF), a partir da qual o contraste da imagem é gerado através da dispersão da luz e absorção das células 2 , 3 , 9 , 10 , 11 . Essas capacidades de imagem de célula única livres de rótulos podem ignorar os efeitos prejudiciais associados aos rótulos fluorescentes, como a citotoxicidade e o foto-branqueamento, e ainda fornecem informações valiosas para a análise de uma célula baseada na textura e morfologia celular e sub-celular. Estes parâmetros livres de etiqueta são comprovadamente eficazes para a classificação profunda das imagens das células, especialmente quando existe uma enorme população celular 11 ,"Xref"> 12. No entanto, em muitas ocasiões, a imagem BF não proporciona um contraste suficiente para revelar a morfologia detalhada das células transparentes livres de etiquetas. Foram desenvolvidas diferentes modalidades de imagem sem etiqueta, de contraste de fase, tempo-estiramento para melhorar o contraste da imagem em taxas de quadros ultra-rápidas 13 , 14 , 15 . Entre estas técnicas, o microscópio óptico de estiramento por tempo de detecção assimétrica (ATOM) foi desenvolvido para revelar o contraste de gradiente de fase (diferencial-interferência-contraste-DIC) baseado em um conceito semelhante à fotografia de Schlieren, permitindo que o rótulo- Imagem livre e de alto contraste de células únicas a uma velocidade microfluídica ultra alta (até 10 m / s) 16 . Este efeito pode ser facilmente gerado através de detecção ou iluminação oblíqua, bloqueando parcialmente o caminho de feixe codificado por imagem ou inclinando o feixe antes da fotodeteção. Outra vantagem da ATOM é suaPara adquirir simultaneamente dois contrastes de gradiente de fase ao longo de orientações opostas. A subtração de intensidade e o somatório de duas imagens de contraste oposto produzem o contraste de gradiente de fase diferencial e o contraste de absorção, respectivamente, da mesma varredura de linha. Este trabalho apresenta um protocolo detalhado descrevendo a implementação do ATOM, incluindo o estabelecimento da configuração óptica, a preparação da amostra e a aquisição e visualização de dados. Especificamente, este trabalho demonstra a operação ATOM com imagens de célula única de células sanguíneas humanas, células cancerosas e fitoplâncton (microalgas). Isso destaca a aplicabilidade da ATOM para a citometria de fluxo de imagem, não só na arena biomédica, mas também na pesquisa marinha e biocombustível 17 , 18 .

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Protocol

1. Preparação da amostra

  1. Preparação da amostra (células aderentes, células MCF-7)
    1. Retire o prato de cultura celular da incubadora e drene o meio de cultura.
    2. Enxágüe as células num prato com 1x solução salina tamponada com fosfato (PBS) para remover o meio de cultura excessivo.
    3. Adicionar 3 mL de uma solução de tripsina 0,25% ao prato de cultura (diâmetro de 100 mm) e colocá-lo em uma incubadora de CO 2 de 37 ° C e 5% durante 4 min.
      NOTA: A tripsina dissolve a proteína adesiva das células para que elas se separem do prato de cultura.
    4. Verifique se todas as células se separaram do prato de cultura usando um microscópio de luz (objetivo 10X). Se não, agite suavemente o prato de cultura de células.
    5. Adicione 4 mL do meio de cultura padrão (formulado com meio de Eagle modificado com DMF de 89% (DMEM), soro bovino fetal a 10% (FBS) e 1% de penicilina-estreptomicina (PS)) para parar a ação da tripsina.
    6. TReduzir toda a mistura (células na solução de tripsina e meio de cultura) para um tubo de centrífuga e centrifugação durante 5 min a 200 x g.
    7. Remova todo o fluido e re-suspenda as células em 1 mL de 1x PBS (pH: 7.4, pré-aquecido a 37 ° C).
  2. Preparação de amostras (micro-algas cultivadas)
    1. Transferir as micro-algas cultivadas e o meio de cultura ( por exemplo, água do mar, ágar ou água fresca) para novos tubos de cultura de vidro (~ 15 mL) em uma relação de volume (micro-algas para meio de cultura) de 1: 5 para estabelecer Um novo meio de subcultura.
    2. Coloque os tubos de cultura de vidro em uma câmara à prova de poeira sob iluminação constante por iluminação artificial de lâmpadas fluorescentes de acordo com um ciclo claro / escuro (LD) (geralmente LD 16: 8) durante 72 - 120 h antes da experiência.
    3. Transfira as amostras subcutâneas para um tubo de centrífuga e misture bem.

2. Configuração do sistema ATOM


Figura 1: Esquema de um sistema ATOM. Um laser pulsado de banda larga é empregado para fornecer pulsos ultra-rápidos para ( a ) um módulo de estiramento do tempo e ( b ) um módulo de amplificador óptico em linha. O módulo de estiramento do tempo gera um trem de formas de onda temporais, cada uma das quais é a réplica do espectro de comprimento de onda da fonte do laser ( ou seja, o mapeamento de comprimento de onda para o tempo). O módulo amplificador é usado para compensação de perda de pulso (dispersiva). O pulso esticado é então ( c ) disperso espacialmente por uma grade de difração, formando uma iluminação de chuveiro espectral 1D em que componentes de comprimento de onda individuais são retransmitidos por um par de lente de relé e focados pela lente objetiva em diferentes posições na célula que flui dentro do ( d ) Chip microfluídico. Este é o processo de codificação espectral. oA luz codificada espectralmente passará a célula através de outra lente objetiva e um espelho, retornando à grade de difracção e recombinando como um feixe pulsado espacialmente não disperso. Esse feixe pulsado codificado por imagem é então ( E ) divididos em dois caminhos, de modo que ambos os feixes sejam parcialmente bloqueados com ( f ) o limite da faca, mas de direções opostas, antes de serem acoplados nas fibras. Esses dois feixes representam os dois contrastes de inclinação de fase codificados (opostos) da imagem final. Para a detecção simultânea de ambos os contrastes de sinal, um dos sinais sofre ( g ) uma linha de atraso de tempo, de modo que os dois sinais sejam multiplexados (intercalados) no tempo. Um fotodetector de alta velocidade e um osciloscópio em tempo real são usados ​​para aquisição de dados. Clique aqui para ver uma versão maior dessa figura.

  1. Tempo st Módulo retch
    1. Utilize uma fonte de laser pulsada de femtosegundo (fs) ou de picosegundo (ps) com um comprimento de onda central recomendado na faixa de infravermelho próximo (NIR), 800-1,500 nm.
      NOTA: A largura típica de pulso requerida pode variar de 100 sub-100 a alguns ps. Os requisitos detalhados das fontes de laser pulsado podem ser vistos nas Referências 4 e 5. As métricas importantes são destacadas na Tabela 1 .
      1. Certifique-se de que a fonte do laser tenha uma alta taxa de repetição, que deve estar no regime de megahertz ( por exemplo, dezenas de MHz) para garantir a imagem ultra-rápida no ATOM. Além disso, defina a potência máxima do laser de saída bem abaixo do limite de potência de dano da cavidade da fibra, aproximadamente 1 kW.
      2. Assegure uma boa estabilidade temporal e espectral tiro-a-tiro da fonte de laser pulsada.
        NOTA: A tolerância típica na flutuação da amplitude espectral deve ser mantida dentro de 1,2% 19 , 20 ,Ss = "xref"> 21, conforme alcançado pelo laser bloqueado em modo de fibra nesta configuração.
        NOTA: Espera-se que a largura de banda óptica da fonte de laser seja de 10-100 nm, o que é essencial para garantir o campo de visão (FOV) suficiente em imagens de célula única 21 .
    2. Através de um colimador de fibras, acople o feixe pulsado a laser a uma fibra óptica dispersiva de modo único, em que os impulsos são esticados através da dispersão de velocidade do grupo (GVD) ( Figura 1a ).
      NOTA: Este é o processo após o qual o espectro de cada pulso é mapeado no tempo como uma forma de onda varrida pelo comprimento de onda ( ou seja, mapeamento de comprimento de onda para o tempo).
      NOTA: O GVD necessário total deve ser suficiente para garantir que a resolução da imagem ATOM geral não seja afetada pelo processo de mapeamento de comprimento de onda (veja a discussão). Normalmente, na gama NIR, o GVD deve estar além de 0,1 ns / nm. Por exemplo, uma fibra de modo único empregada nessaA configuração atual fornece um GVD total de 0,38 ns / nm em torno do comprimento de onda de 1.060 nm (um comprimento total de fibra de 10 km).
  2. Módulo de codificação espectral
    1. Construa um sistema de microscópio óptico para executar a imagem espectralmente codificada das células que circulam ao longo do canal microfluídico, conforme ilustrado na Figura 1 .
      NOTA: Os componentes-chave deste microscópio óptico incluem: (1) uma grade de difração, um módulo telescópico de lente de relé (RL1 e RL2 na Figura 1 ) e duas lentes objetivas (Obj1 e Obj2 na Figura 1 ).
      1. Primeiro, ilumine o feixe estirado e colimado no tempo em uma grade de difração (a grade de transmissão é usada nesta configuração) para gerar um chuveiro espectral ( Figura 1c ).
        NOTA: A potência do feixe difractado ( ou seja, a eficiência da difração) pode ser maximizada ajustando tA orientação da grade foi fechada para a configuração da Littrow.
      2. Configure as duas lentes de relé (RL1 e RL2) em um sistema de imagem de 4-f ( ou seja, coloque a grade de difração no plano focal de RL1 e separe RL1 e RL2 por uma distância igual à soma de suas distâncias focais. O banho espectral Será então imaginado no plano focal traseiro da lente objetiva Obj1).
      3. Alinhe cuidadosamente o chuveiro espectral para preencher a abertura traseira do Obj1, de modo que o chuveiro espectral possa ser projetado e focado no plano da imagem do microscópio.
        NOTA: Aqui, a NA da lente objetiva (Obj1 na Figura 1 ) é de 0,75.
      4. Coloque outra lente objetiva (Obj2 na Figura 1 ) com uma NA semelhante e um espelho plano na abertura traseira desta lente objetiva (Obj2), de modo que o feixe de chuveiro espectral possa ser alinhado para passar duas vezes o plano da imagem e retornar ao Grade de difracção.
      5. AjustarO par de lentes objetivas (Obj1 e Obj2), de modo que seus planos focais se sobrepõem. Verifique se o chuveiro espectral passa o plano da imagem no mesmo local e retorna à grade seguindo o mesmo caminho. Caso contrário, realize um maior alinhamento e afinação do sistema óptico.
        NOTA: A luz retornada deve passar através de um divisor de feixe adicional, de modo que a luz possa ser transmitida para um módulo de detecção assimétrica.
      6. Ajuste o ganho do amplificador óptico em um nível adequado, de modo que o sinal resultante possa ser detectado pelo fotodetector com um bom SNR, que normalmente é de> 10 dB.
      7. Coloque e ajuste a posição do microfluídico na plataforma da amostra e assegure-se de que o chuveiro espectral e, portanto, a área de imagem, sejam colocados através do canal microfluídico ( Figura 1d ).
        NOTA: O chuveiro espectral é iluminado ortogonalmente ao sentido do fluxo de fluidics dentro do mChip icrofluidico, de modo que o movimento de fluxo executa automaticamente varreduras bidimensionais (2D).
  3. Módulo de detecção assimétrica
    1. Coloque um divisor de feixe adicional para separar o feixe codificado em imagens em dois ( Figura 1e ).
      NOTA: Cada réplica de feixe é parcialmente bloqueada por uma aresta da faca.
    2. Medir e gravar a potência óptica do feixe antes do bloqueio do feixe. Em seguida, posicione manualmente os bordos da faca (montados em uma fase de translação linear), de modo a bloquear aproximadamente a metade do feixe (por inspeção visual). Depois, use o medidor de potência óptica para monitorar a energia do feixe enquanto ajuste a posição das bordas da faca traduzindo-as através do feixe.
      NOTA: Sugere-se que a posição ideal é onde a potência é diminuída em ~ 50% do valor original ( ou seja, o caso desbloqueado). Esta é a condição que fornece a melhor combinação de sinal de imagemReforço de contraste de imagem e força.
    3. Repita o passo 2.3.2 para outra réplica do feixe. Observe que a orientação do bloco de feixe parcial para um feixe deve ser oposta em relação ao outro feixe ( Figura 1f ).
    4. Junte os dois feixes parcialmente bloqueados em dois braços de fibra separados em um único modo através de colimadores de duas fibras.
      NOTA: Um dos braços tem um comprimento extra de fibra, servindo como uma linha de atraso baseada em fibra, para introduzir um atraso de tempo em relação à outra réplica (sem a linha de atraso) ( Figura 1g ). Ambos são direcionados para uma única fibra por um acoplador de fibra antes da fotodetecção. O tempo de atraso deve ser suficientemente longo para separar temporariamente as duas réplicas e curto o suficiente para evitar a sobreposição temporal com a próxima forma de onda ( ou seja, as duas réplicas são sempre intercaladas no tempo e multiplexadas no tempo em uma única fibra antes da detecção ( Figura 2a )).
    5. BonéTire e digitalize os sinais ópticos detectados com o osciloscópio em tempo real. Observe que a largura de banda e, portanto, a taxa de amostragem do osciloscópio devem ser suficientemente altas para garantir que elas não influenciam a resolução final da imagem (veja a discussão).
      NOTA: Aqui, com o GVD de 0,38 ns / nm, é necessária uma largura de banda de aquisição do backend e uma taxa de amostragem de> 20 GHz e> 40 GSa / s, respectivamente.

3. Procedimentos experimentais

  1. Carregamento de amostras
    1. Execute a contagem de células sob um microscópio de contraste de fase convencional em um hemocitômetro padrão.
    2. Ajuste a densidade celular diluyendo com 1x PBS (com água de nascente para microalgas) e misture bem com uma pipeta.
      NOTA: A concentração sugerida é de 10 5 a 10 6 células / mL.
    3. Monte o microfluídico na plataforma de amostra do sistema de imagem óptica.
      NOTA: O microfluídicoO chip é feito principalmente de polidimetilsiloxano (PDMS) e é fabricado usando o método padrão de moldagem de réplicas. O canal microfluídico é projetado com um canal curvo assimétrico para gerar o efeito de focagem de fluxo inercial, de modo que as células possam fluir em um único arquivo na seção de imagem (com uma dimensão de 80 μm x 80 μm (altura x largura)) em alta velocidade .
    4. Transfira a solução celular ajustada em densidade para uma seringa de 10 mL.
    5. Conecte a seringa à entrada do microfluídico e um tubo centrífugo para a saída do microfluídico para coleta de descarte.
    6. Montar a seringa em uma bomba de seringa e ajustar uma taxa de fluxo adequada para dar o rendimento desejável e evitar a imposição de força de cisalhamento excessiva entre as células e o canal.
      NOTA: A velocidade linear das amostras deve estar dentro de 0,5 e 10 m / s. Observe que, antes da gravação real da imagem, muitas vezes é necessário aprimorar o ajuste do sistema, em termos de maximização daForça do sinal de imagem e otimização da focagem da imagem repetindo as etapas 2.2.1.4-2.2.1.6.

4. Aquisição de dados

  1. Defina um número adequado de pontos de dados a serem salvos para cada experiência. O número de pontos de dados a serem salvos depende do tamanho e da taxa de fluxo das amostras.
    NOTA: Normalmente, ele está configurado para 8-16 milhões de pontos de amostra sob uma taxa de amostragem de 80 GSa / s.
  2. Adquira e guarde os dados em um modo de lote usando o osciloscópio.

5. Processamento de Backend

Figura 2
Figura 2: Reconstrução de imagens ATOM a partir do Rastreio de tempo de varredura de linha. Para reconstruir as imagens ATOM com o contraste de absorção e diferencial diferencial diferencial (melhorado), dois conjuntos de pulsos esticados no tempo (ver os pulsos roxo e verde) são extraídos de(A) o rastreio da forma de onda temporal multiplexada no tempo e então são segmentados e empilhados digitalmente para formar ( b ) duas imagens 2D que mostram os dois contrastes de gradiente de fase opostos. Observe que uma operação de cisalhamento é necessária para formar ( c ) as imagens sem distorção, compensando o deslocamento do subíndice devido ao erro de arredondamento na estimativa da taxa de repetição do laser. Ao subtrair a ( d ) verificação de linha bruta do envelope de intensidade espectral da fonte do laser, o fundo das imagens pode ser removido. ( G ) Uma imagem de contraste de absorção pode ser obtida por uma soma de intensidade de pixel por pixel das imagens ( e ) e ( f ), enquanto que ( h ) uma imagem diferencial de contraste de gradiente de fase pode ser obtida a partir da subtração de imagens (e ) E (f). Clique aqui para ver uma versão maiorDesta figura.

  1. Transfira os dados do osciloscópio para os computadores para reconstrução de imagem offline.
    NOTA: Aqui, os dados são armazenados em um disco rígido portátil e transferidos manualmente entre o osciloscópio e os computadores de processamento. A capacidade do disco rígido deve ser superior a 500 GB para cada experiência.
    1. Use a rotina de reconstrução de imagem de chave para empilhar digitalmente as varreduras de linha para formar uma imagem 2D ( Figura 2 ).
      NOTA: O programa personalizado (em MATLAB) produz duas imagens de detecção assimétricas separando os dois conjuntos de dados multiplexados no tempo (formas de onda roxas e verdes na Figura 2 ).
      1. Obtenha uma imagem de contraste diferencial de fase diferencial, subtraindo as intensidades das duas imagens de detecção assimétricas; Uma imagem de contraste de absorção pode ser obtida adicionando as duas imagens de detecção assimétricas. Veja as imagens selecionadas de MCF-7 e micro-algas emFigura 3 . Observe que os perfis de fundo de imagens individuais devem primeiro ser eliminados e suas intensidades devem ser normalizadas, antes das operações de soma e subtração da imagem.
    2. Gerar uma biblioteca de parâmetros derivados das imagens, como volume celular, circularidade e densidade de absorção, etc. , para análise posterior.
  2. Insira a biblioteca de dados na plataforma de visualização de dados ( Figura 4 ).
    1. Carregue a biblioteca de parâmetros e as imagens reconstruídas correspondentes na plataforma de interface de visualização.
    2. Defina os eixos como os parâmetros de interesse.
      NOTA: Os parâmetros são específicos do problema e são definidos pelo usuário. Eles são derivados das imagens ATOM pelo programa MATLAB. Aqui, a densidade de absorção óptica da célula, área celular, volume celular e circularidade celular estão disponíveis para seleção. Selecione o conjunto de dados para ser exibido, de modo que cada imagem de célula possa ser visualizada como um ponto de dados diferente no gráfico de dispersão.
    3. Mova o cursor do mouse para cada ponto, de modo que a imagem correspondente e outros parâmetros sejam exibidos em uma sub-janela flutuante.
      NOTA: Os eixos podem ser alterados entre as escalas linear e logarítmica de forma interativa.
    4. Execute análises adicionais de qualquer subconjunto do conjunto de dados, ativando manualmente o gráfico de dispersão.
      NOTA: O histograma em cada parâmetro do subconjunto fechado pode ser plotado em relação à de toda a biblioteca. Os histogramas separados são exibidos em outra sub-janela flutuante.

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Representative Results

Este trabalho ilustra duas demonstrações de imagens de célula única por ATOM: uma com células de mamífero (células mononucleares de sangue periférico humano (PBMC) e células de câncer de mama (MCF-7)) e outra com fitoplâncton s (Scenedesmus e Chlamydomonas). O primeiro experimento foi motivado pelo interesse crescente pela biópsia líquida pela detecção, enumeração e caracterização de células tumorais circulantes (CTCs) no sangue 23 . A capacidade de medir CTCs disseminada de sites tumorais primários para o fluxo sanguíneo permite o exame da progressão do câncer metastático 24 , 25 . No entanto, existem desafios na análise CTC: (i) a contagem de CTC é significativamente menor do que a quantidade exorbitante de células sanguíneas no sangue total. Os métodos atuais de identificação e recuperação dos CTC envolvem principalmente etapas de enriquecimento celular e separação Class = "xref"> 26 , 27 , 28 . No entanto, o fundo contaminante das células sanguíneas e / ou a viabilidade dos CTCs enriquecidos continuam a ser uma preocupação para a análise molecular subsequente ( por exemplo, sequenciação de ARN) 29 . (Ii) Os CTCs são altamente heterogêneos em termos de assinaturas biofísicas e biomoléculas, limitando a eficiência do enriquecimento e detecção de CTC. Para este fim, a citometria de fluxo de imagem sem rótulos com um alto rendimento de imagem é uma ferramenta atraente que permite a imagem e identificação direta de CTCs dentro de uma enorme população de células sanguíneas, minimizando ou mesmo ignorando as etapas de enriquecimento.

O segundo experimento é particularmente relevante para a caracterização do fitoplâncton em larga escala, o que pode afetar os avanços nas ciências ambientais ( por exemplo, a detecção de espécies nocivas de flor de algas (HAB)S = "xref"> 29 e a identificação de espécies de microalgas como fontes de biodiesel renováveis) 17 . Habilitado por ATOM, a capacidade de imagem de célula única de alto contraste e alto contraste de fitoplâncton pode ser valiosa para revelar a heterogeneidade complexa em tamanho, textura e morfologia em diferentes gêneros e espécies.

A Figura 3 mostra imagens de células de mamífero, MCF-7 e PBMC (fluindo a uma velocidade de ~ 10 m / s), bem como microalgas, Scenedesmus e Chlamydomonas (fluindo a uma velocidade de ~ 2 m / s) capturados pela ATOM . Em todos os quatro casos, os dois contrastes de gradiente de fase opostos foram obtidos pelos dois sinais detectados assimetricamente multiplexados no tempo (descritos no passo 2.3). Ambos exibem uma aparência pseudo-tridimensional, semelhante às imagens DIC, cada uma das quais mostra duas orientações de sombreamento opostas (colunas 1 e 2 na Figura 3a ou seja, os contrastes de gradiente de fase diferencial de absorção e melhorada, as colunas 3 e 4 na Figura 3a -d ). Note-se que não só o ATOM livre de etiqueta revela as imagens sem célula sem borrão, mas também caracteriza as estruturas celulares com alto contraste. Notavelmente, as vacúolas, o pólenóide e o flagelo nas microagras podem ser claramente visualizados na Figura 3 . Este atributo de imagem cria criticamente a extração de um conjunto rico de identificadores derivados das texturas / morfologias intrínsecas celulares e subcelulares para a classificação automatizada baseada em imagem.

Este trabalho demonstra que as propriedades biofísicas, como a circularidade celular e o tamanho da célula, podem ser usadas para A classificação de MCF-7 e PBMC. Observe que dois cachos são observados na amostra MCF-7. A disponibilidade de imagens de alto contraste para todos os pontos de dados nos permite examinar se um dos clusters corresponde a fragmentos / detritos ( Figura 4a ). Também foi realizada uma classificação semelhante entre duas espécies de fitoplâncton com base em imagens ATOM. Aqui, os resultados da classificação são apresentados na forma de um gráfico de dispersão 2D visualizado pela interface de usuário personalizada ( Figura 4 ). Cada ponto de dados anotado no gráfico de dispersão, correspondente a cada célula, pode ser explorado com diferentes parâmetros derivados do ATOM. A imagem ATOM correspondente também pode ser exibida de forma interativa diretamente no enredo. O gating manual também é suportado nesta interface de visualização para facilitar a posterior classificação e análise.

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Figura 3: ATOM Image Galley de Micro-algas e células de mamíferos com uma velocidade de fluxo ultra-rápida (~ 2-10 m / s). (A) Scenedesmus; ( B ) Chlamydomonas; ( C ) células de cancro da mama, MCF-7; E ( d ) PBMC humano. O Scenedesmus e Chlamydomonas são fluidos a ~ 2 m / s, enquanto MCF-7 e PBMC são fluídos a 10 m / s. As duas colunas esquerdas (colunas 1 e 2) para cada tipo de célula representam dois contrastes de gradiente de fase opostos. As colunas 3 e 4 representam o contraste de absorção e o contraste de gradiente de fase (melhorado), respectivamente. Barras de escala = 20 μm (em vermelho). Clique aqui para ver uma versão maior dessa figura.

Figura 4
FiGure 4: Uma interface gráfica de usuário para análise de citometria com base em imagens ATOM. Nesta interface, o usuário pode realizar a classificação e análise de tipo celular definindo parâmetros de células diferentes ( por exemplo, tamanho de célula, circularidade, densidade de absorção, etc. ) derivadas das imagens ATOM. O resultado pode ser representado em um gráfico de dispersão exibido no painel central. O acesso e o controle de várias opções de exibição, que incluem a mudança de parâmetros e a escala para o eixo x e y (botões de parâmetros do eixo X e Y) e a alternância entre os conjuntos de dados (botão Dataset) é possível. A informação detalhada da célula (guia de informações da célula) pode ser lida pairando em um ponto de dados específico. Para habilitar a navegação rápida, o usuário pode mudar para outro modo de visualização e exibir simultaneamente todas as imagens no diagrama de dispersão no painel central (botão de modos de exibição). O controle manual também pode ser realizado para posterior análise. Os pontos de dados amarelos representam a amostra de células MCF-7 (em ( a </ Strong>)) e Scenedesmus (SCE) (em ( b )), enquanto os pontos de dados vermelhos representam o espécime PBMC humano (em (a)) e Chlamydomonas (CHA) (em (b)). Clique aqui para ver uma versão maior dessa figura.

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Discussion

Existem vários detalhes técnicos que exigem atenção especial durante a configuração do sistema ATOM. Em primeiro lugar, é essencial notar que a iluminação assimétrica / oblíqua codificada especificamente pode introduzir componentes residuais de gradiente de fase ( ou seja, o efeito de sombreamento) no contraste de absorção e influenciar o aumento do contraste de gradiente de fase em ATOM. Portanto, esse efeito de iluminação oblíqua deve ser minimizado. Em segundo lugar, deve-se enfatizar que o esquema de multiplexação de tempo ou entrelaçamento de tempo que envolve duas réplicas resulta em nenhum compromisso significativo na velocidade de imagem ( ou seja, a taxa de varredura de linha de> MHz ainda pode ser mantida), uma vez que a largura temporal total De duas réplicas de feixe não exceda um período de varredura de linha. Em terceiro lugar, a configuração ideal do módulo integrado de fibra dispersiva e amplificadores depende do ganho visado como a especificação dos amplificadores disponíveis. A amplificação óptica é essencialL ao processo de alongamento do tempo para combater a perda óptica associada ao GVD 22 . Em princípio, ele pode ser implementado por qualquer tipo de amplificador óptico, de preferência no formato de fibra, de modo que seja compatível com o processo de estiramento do tempo baseado em fibra ( Figura 1b ). Os exemplos práticos de amplificadores ópticos baseados em fibra óptica incluem amplificadores de fibra dopada com erbium (EDFA, para comprimentos de onda de operação de ~ 1.500-1.600 nm), amplificadores de fibra dopada de ytterbium (YDFA, para comprimentos de onda de operação de ~ 1.060 nm), amplificadores Raman de fibra, E amplificadores paramétricos de fibra óptica (FOPA, para qualquer comprimento de onda de operação, em princípio, desde que esteja disponível uma fonte de laser de bomba). O ruído do amplificador também deve ser cuidadosamente considerado no projeto do módulo. A teoria detalhada pode ser vista na Referência 8. Uma configuração comum pode envolver múltiplos amplificadores de fibra em cascata inseridos entre vários segmentos de fibra dispersiva (cada um tem um comprimento de alguns quilômetros). Para ATOM aE em termos de tempo de estiramento, em geral, o típico aumento de potência óptica de ativação deve ser de cerca de 20 a 30 dB. Deve notar-se que o intervalo de comprimento de onda de operação é tipicamente limitado a ~ 800-1,550 nm, principalmente devido à perda de fibra óptica extremamente alta em comprimentos de onda mais curtos ( ou seja, comprimentos de onda visíveis). Portanto, de forma semelhante à maioria das demonstrações de imagem de estiramento no tempo, o ATOM baseado em fibra não será imediatamente aplicável à imagem de fluorescência, onde as operações de luz visível ainda são comuns. No entanto, note que um conceito de alongamento de pulso de espaço livre que se assemelha ao estiramento do tempo, chamado de atraso angular-chirp-ampliado em espaço livre (FACED), foi recentemente usado para imagens ultra-rápidas de varredura a laser em ATOM, bem como para imagens de fluorescência Em comprimentos de onda visíveis 30 .

Outro parâmetro importante que requer uma consideração de projeto sutil é a resolução da imagem. Ao contrário do microscópio de luz clássico, a imagemA resolução da ATOM e a imagem geral do estiramento do tempo ao longo do eixo do chuveiro espectral são regidas por três regimes limitantes 22 : (i) a resolução de dispersão espacial dispersa, que está relacionada à resolução espectral da rede de difracção, denotada como δ x espacial ; (Ii) o limite de aproximação da fase estacionária, que é definido como a ambigüidade do processo de mapeamento de tempo de onda δ x SPA , que escala inversamente com a raiz quadrada do GVD 22 ; E (iii) a resolução limitada do fotodetector δ x det , que descreve a largura de banda finita do fotodetector que também pode influenciar a resolução espacial final. Em geral, o maior valor entre esses três parâmetros é definido como a resolução da imagem de ATOM, δ x ( ie, δ x = max { δ x espacial , δ SPA , δ x det }). É sempre desejável assegurar que a resolução final seja limitada em termos espaciais ( isto é, δ x = δ x espacial > δ x SPA > δ x det ). Portanto, tanto o GVD (passo 2.2.1.1) como a largura de banda (etapa 2.3.5) do fotodetector devem ser suficientemente altos para satisfazer esta condição. Por outro lado, a resolução da imagem ao longo da direção do fluxo é avaliada pelo limite de difração. Isso é verdade somente quando a condição de amostragem do Nyquist é satisfeita ( ou seja, a taxa de repetição do laser (R, em Hz) e a taxa de fluxo das células (F, em m / s) devem ser configuradas de modo que o tamanho do pixel em A direção do fluxo é F / R <2 δ y, onde δ y é a resolução limitada de difracção ao longo da direção do fluxo). Observe que as especificações da grade ( por exemplo, </ Em> densidade do sulco) e lente objetiva ( por exemplo, a abertura numérica (NA)) deve ser cuidadosamente projetada para corresponder a resolução segmentada.

Enquanto a demonstração e o protocolo ATOM atuais mostram que a aquisição de dados é feita por osciloscópio e o processamento de dados é seguido offline, é mais favorável para obter a aquisição, processamento e análise contínua de dados em tempo real, em tempo real, especialmente aproveitando a capacidade de alcançar As capacidades de captura de imagens ultra-rápidas e de alto contraste trazidas pela ATOM. Para isso, deve ser adotada uma unidade de processamento de sinal de alto desempenho e alto débito, como uma unidade de processamento gráfico (GPU) e / ou uma matriz de portas programável em campo (FPGA), que demonstrou ter a capacidade de Alcançar uma taxa de processamento de dados tão alta quanto ~ 1-10 GB / s. Isso é compatível com a capacidade de amostragem ultra-rápida do ATOM ( ou seja, ~ 10 GSa / s). A integração do ATOM e um processamento de dados de alto rendimentoCcelerator permite um novo paradigma em estudos biológicos orientados a dados, especialmente ao desvendar a heterogeneidade desconhecida entre diferentes células únicas em uma enorme população. Essa tecnologia também pode capacitar uma nova geração de pesquisa clínica, em que células raras aberrantes durante o processo da doença podem ser quantificadas de forma livre de etiquetas.

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Disclosures

Os autores não têm nada a divulgar.

Acknowledgments

Agradecemos ao Sr. P. Yeung pela preparação do MCF-7 para nós. Este trabalho foi parcialmente apoiado por subsídios do Conselho de Bolsas de Pesquisa da Região Administrativa Especial de Hong Kong, China (Projeto nº 17259316, 17207715, 17207714, 17205215 e HKU 720112E), o Programa de Apoio à Inovação e Tecnologia (ITS / 090/14 ), E o Fundo de Desenvolvimento Universitário da HKU.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Nikon Plan Fluorite Physiology Objectives 40X Nikon MRF07420 Objective lens (Obj2)
Olympus Plan Fluorite Objective, 0.75 NA, 0.51 mm WD, 40X Olympus RMS40X-PF Objective lens (Obj1)
N-BK7 Plano-Convex Lenses Thorlabs LA1145-C For relaying spectral shower
FC/APC Fiber Collimation Package Thorlabs F220APC-1064 For outputing and collecting laser pulses
Pellicle beamsplitter Thorlabs BP145B3 For making beam replica
Protected silver mirror Thorlabs PF10-03-P01 For reflecting light
800-1650nm 12GHz single mode DC-coupled NIR Photoreceiver Newport 1544-B For converting light into electrical signal
Infiniium High-Performance Oscilloscope Agilent DSOX91604A To save the light-converted electrical signals
HI1060 optical fiber Corning HI1060 Optical fiber for time-stretch
YTTERBIUM DOPED FIBER AMPLIFIER Keopsys KPS-STD-BT-YFA-37-BO-SM-111-FA-FA Optical in-line amplifier
Holographic grating Wasatch Photonics 020305-6 Grating
Infuse/Withdraw Syringe Pumps Harvard Apparatus PHD 2000 Syringe pump for sample loading in micro-fluidic channels

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References

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Engenharia Edição 124 Microscopia citometria de fluxo de imagem microfluídica imagem de estiramento no tempo triagem de alto rendimento análise de célula única
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