Summary
이 프로토콜은 ultrafast microfluidic 흐름과 이미징 유동 세포 계측법의 응용 프로그램에서 단일 셀 이미징을위한 비대칭 감지 시간 - 스트레치 광학 현미경 시스템의 구현을 설명합니다.
Abstract
다차원 데이터 분석 및 높은 신뢰도의 통계 결과를 허용하는 측정 가능한 매개 변수의 수를 조정하는 것은 유세포 분석의 진보 된 개발에서 주된 경향이었습니다. 특히 고해상도 이미징 기능을 추가하면 세포 / 하위 세포 구조의 복잡한 형태 학적 분석이 가능합니다. 이것은 표준 유동 세포 계측기로는 불가능합니다. 그러나 그것은 세포 기능에 대한 우리의 지식을 발전시키는 데 가치가 있으며 생명 과학 연구, 임상 진단 및 환경 모니터링에 도움이 될 수 있습니다. 유동 세포 계측법에 이미징 기능을 통합하면 주로 카메라 기술의 속도와 민감도의 한계로 인해 분석 처리량이 저하됩니다. 이미지 품질을 보존하면서 이미징 유동 세포 계측법이 직면하고있는 이러한 속도 또는 처리량 문제를 극복하기 위해 비대칭 검출 시간 - 신장 광학 현미경 (ATOM)이 높은 대비, 단일 셀 이미지를 가능하게하는 것으로 입증되었습니다100,000 세포 / s의 높은 이미지 처리량으로 하위 세포 분해능을 제공합니다. ATOM은 모든 광학 이미지 인코딩 및 초고속 광대역 레이저 펄스의 사용을 통한 검색에 의존하는 기존의 시간 - 스트레치 이미징의 이미징 개념을 기반으로하여 레이블이없는 / 염색되지 않은 셀의 이미지 대비를 향상시킴으로써 이미징 성능을 향상시킵니다. 이는 단일 샷 광대역 펄스로 스펙트럼 적으로 인코딩 된 셀의 위상 구배 정보에 액세스함으로써 달성됩니다. 따라서 ATOM은 셀 유형, 상태 및 기능을 나타내는 단일 셀 형태 및 텍스처 정보의 높은 처리량 측정에서 특히 유리합니다. 궁극적으로 이것은 현재의 최첨단 생화학 적 마커 기반 세포 분석법을 보완하면서 세포의 생물 물리 표현형을위한 강력한 이미징 유동 세포 계측 플랫폼이 될 수 있습니다. 이 작업은 ATOM 시스템의 핵심 모듈을 구축하기위한 프로토콜을 설명합니다 (광학 프런트 엔드에서 데이터 p로rocessing 및 시각화 백엔드)뿐만 아니라, 인간 세포와 마이크로 조류를 예제로 사용하여 ATOM에 기반한 이미징 유동 세포 계측법의 워크 플로우를 제공합니다.
Introduction
광학 이미징은 많은 세포 / 하위 세포 성분의 상세한 공간 분포를 비 침습적으로 시각화하여 세포의 형태 학적, 생물 물리학 적 및 생체 분자 표지를 밝히는 강력한 도구 및 세포 기반 분석법을 제시합니다. 그러나, 단일 세포로부터 고 함량의 정보를 추출 할 수있는 능력은 일반적으로 거대하고 이질적인 세포 집단이 조사되어야 할 때 타협되었다. 이는 측정 처리량과 컨텐츠 사이의 셀 기반 분석에서 일반적인 트레이드 오프입니다. 주목할만한 예는 이미징 능력을 유동 세포 계측법에 추가하면 고전적인 비 - 이미징 유동 세포 계측기와 비교하여 처리량을 적어도 1-2 배 정도 축소 할 수 있다는 것입니다. 그것은 표준 유동 세포 계측기 1 로는 불가능한 복잡한 형태 학적 단일 세포 분석을 제공 할 수 있지만, 이미징 유동 세포 계측법은 일반적으로 충분한 처리량이 부족한 이드높은 통계적 신뢰로 세포의 이질성을 유인한다. 이것은 생물학의 새로운 발견과 질병의 병인에 대한 이해를 얻기 위해 필요합니다. 핵심 기술 과제는 일반적인 광학 이미징 전략 : 레이저 빔 스캐닝 ( 예 : 갈바 노 메트릭 미러) 및 / 또는 이미지 센서 ( 예 : 전하 결합 소자 (CCD) 및 상보 형 금속 탐지기)가 내재 한 속도 제한에 있습니다. 산화물 반도체 (CMOS))를 포함한다. 레이저 스캐닝 속도는 스캔 미러의 기계적 관성에 의해 본질적으로 제한되는 반면 CCD 또는 CMOS의 프레임 속도는 이미지 속도와 감도 사이의 기본적인 절충에 의해 제한됩니다 ( 즉, 프레임 속도를 높이면 신호 감도가 감소합니다). , 그 반대).
모든 광학, 초고속 이미지 인코딩 메커니즘을 기반으로 광학 시간 - 스트레치 이미징은 높은 처리량 이미징 흐름 세포에 대한 매력적인 플랫폼으로 입증되었습니다ometers, 종래의 이미지 센서 또는 기계식 레이저 스캐닝 필요없이 2 , 3 . 타임 스트레치 영상의 작동 원리에 대한 자세한 설명은 참고 문헌 4 , 5 , 6 , 7 에서 찾을 수 있습니다. 간단히 말하면, 그것은 (i) 이미지화 된 표본의 공간 좌표가 광 펄스 화 된 빔 ( 8 , 9 )의 스펙트럼을 가로 지르는 상이한 파장에 매핑되는 스펙트럼 인코딩 (파장 - 공간 매핑) 개별 레이저 펄스의 파장 성분이 그룹 속도 분산 (GVD)을 통해 시간적 (파장 스위프) 파형 ( 그림 1 )으로 변환 (신장)되는 분산 푸리에 변환 (파장 - 시간 매핑) 9 . 중요한시간 - 스트레치 이미징의 특징은 광 증폭으로, 초고속 광 검출 및 GVD 손실로 인한 감도 손실을 막는데 중요한 역할을하므로 광 검출기 잡음으로 오염되지 않고 이미지 신호 대 잡음비 (SNR)를 향상시킵니다. . 각각의 레이저 펄스는 단방향의 셀 흐름과 직교하는 이미징 된 시료의 라인 스캔을 인코딩하기 때문에 유효 라인 스캔 속도는 일반적으로 10MHz를 초과하는 레이저 반복 속도에 의해 결정됩니다. 이 초고속 작동으로 10,000-100,000 세포 / 초 ( 즉, 기존 이미징 유동 세포 계측법보다 10-100 배)의 처리량에서 흐려지지 않는 단일 세포 이미지 캡처가 가능합니다. 결과적으로, 시간 - 스트레치 이미징 (time-stretch imaging)은 상당히 많은 개체군 내에서 미지의 이질성 또는 희귀 / 비정상 세포를 식별 할 필요가있을 때 특히 높은 처리량, 단일 세포, 이미지 기반 선별 검사에서 고유 한 응용 프로그램을 찾을 수 있습니다. 셀 희귀 암세포 스크리닝 10 또는 미세 조류 분류 11 )와 같은,
시간 - 스트레치 이미징은 주로 밝은 필드 (BF) 이미지 캡처를 기반으로하며이 이미지 캡처에서 이미지의 명암이 셀 2 , 3 , 9 , 10 , 11 에서 빛의 산란 및 흡수를 통해 생성됩니다. 이러한 라벨없는 단일 세포 영상 진단 기능은 세포 독성 및 광 표백과 같은 형광 표지와 관련된 유해한 효과를 우회 할 수있을뿐만 아니라 세포 및 하위 세포의 질감 및 형태에 기반한 단일 세포 분석에 유용한 정보를 제공 할 수 있습니다. 이러한 라벨이없는 매개 변수는 세포의 심상 분류, 특히 엄청난 세포 집단이 이용 가능할 때 효과적이라는 것이 입증되었다 ."xref"> 12. 그러나, 많은 경우에, BF 이미징은 라벨이없는 투명 세포의 상세한 형태를 밝히기에 충분한 대비를 제공하지 못한다. 초고속 프레임 속도 13 , 14 , 15 에서 이미징 콘트라스트를 향상시키기 위해 라벨이없는 위상차, 시간 - 스트레치 이미징 방식이 개발되었습니다. 이 기법들 중 Schlieren 사진과 유사한 개념을 기반으로 위상차 (differential-interference-contrast-) (DIC)와 같은 콘트라스트를 나타 내기 위해 비대칭 검출 시간 - 신장 광학 현미경 (ATOM) 초고속 미소 유체 속도 (최대 10m / s)에서 단일 셀의 고선명, 고 명암 이미징 16 . 이 효과는 이미지 인코딩 된 빔 경로를 부분적으로 차단하거나 광 검출 전에 빔을 기울임으로써 경사 감지 또는 조명을 통해 쉽게 생성 될 수 있습니다. ATOM의 또 다른 장점은반대 방향으로 두 개의 위상차 대비를 동시에 획득 할 수 있습니다. 두 개의 반대 - 대조 이미지의 강도 빼기 및 합산은 각각 동일한 라인 - 스캔으로부터의 미분 위상 - 기울기 콘트라스트 및 흡수 콘트라스트를 각각 산출한다. 이 작업은 광학 설정, 샘플 준비 및 데이터 수집 및 시각화 설정을 포함하여 ATOM 구현을 설명하는 상세한 프로토콜을 제공합니다. 특히,이 연구는 인간의 혈액 세포, 암세포 및 식물성 플랑크톤 (미세 조류)의 단세포 영상으로 ATOM 수술을 입증합니다. 이것은 생물 의학 분야뿐 아니라 해양 및 생물 연료 연구 17,18 에서도 영상 유동 세포 계측법에 대한 ATOM의 적용 가능성을 강조합니다.
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Protocol
1. 샘플 준비
- 샘플 준비 (접착 세포; MCF-7 세포)
- 인큐베이터에서 세포 배양 접시를 꺼내 배양액을 배출하십시오.
- 과도한 배양 배지를 제거하기 위해 1x 인산 버퍼 식염수 (PBS)로 접시에 세포를 씻어.
- 배양 접시 (직경 100 mm)에 0.25 % 트립신 용액 3 mL를 넣고 37 ° C, 5 % CO 2 배양기에 4 분간 넣는다.
참고 : 트립신은 배양 접시에서 분리되도록 세포의 접착 단백질을 용해시킵니다. - 모든 세포가 가벼운 현미경 (10X 목적)을 사용하여 문화 접시에서 분리되었는지 확인하십시오. 그렇지 않다면 부드럽게 세포 배양 접시를 흔들어.
- 트립신의 작용을 멈추기 위해 89 % Dulbecco 's Modified Eagle Medium (DMEM), 10 % fetal bovine serum (FBS), 1 % penicillin-streptomycin (PS)으로 표준 배양액 4 mL를 첨가한다.
- 티200 x g에서 5 분 동안 원심 분리 관과 원심 분리기로 전체 혼합물 (트립신 용액 및 배양 배지의 세포)을 옮긴다.
- 모든 유체를 제거하고 1X PBS 1 mL (pH 값 : 7.4, 37 ° C로 예열 됨)에서 세포를 다시 정지시킵니다.
- 샘플 준비 (배양 된 미세 조류)
- 배양 된 미세 조류와 배양액 (해수, 한천 또는 담수)을 1 : 5의 부피비 (미세 조류와 배양 배지)의 새로운 유리 배양 튜브 (~ 15 mL)에 옮기고 새로운 하위 배양 배지.
- 실험 전 72-120 시간 동안 암 / 빛 (LD)주기 (보통 LD 16 : 8)에 따라 형광등에서 인공 조명으로 일정한 조명하에 방진 챔버에 유리 배양 튜브를 놓습니다.
- 하위 교양 샘플을 원심 튜브에 옮기고 잘 섞는다.
2. ATOM 시스템 설정
그림 1 : ATOM 시스템의 개략도. 광대역 펄스 레이저는 ( a ) 시간 - 신장 모듈 및 ( b ) 인라인 광 증폭기 모듈에 초고속 펄스를 전달하는 데 사용됩니다. 시간 - 스트레치 모듈은 시간 파형의 열을 생성하며, 각각의 시간 파형은 레이저 소스의 파장 스펙트럼의 복제 ( 즉, 파장 대 시간 매핑)이다. 증폭기 모듈은 펄스 스트레칭 (분산) 손실 보상에 사용됩니다. 그 다음, 신장 된 펄스는 회절 격자에 의해 공간적으로 분산되어, 개별적인 파장 성분이 릴레이 렌즈 쌍에 의해 중계되고 대물 렌즈에 의해 ( d) 안의 유동 세포상의 다른 위치들로 초점이 맞추어지는 1D 스펙트럼 샤워 조명을 형성한다 ) 미세 유체 칩. 이것은 스펙트럼 인코딩 과정입니다. 그만큼스펙트럼 적으로 인코딩 된 광은 다시 다른 대물 렌즈 및 거울을 통해 셀을 통과하여 회절 격자로 돌아가고 공간적으로 분산되지 않은 펄스 빔과 재결합합니다. 이 이미지 인코딩 펄스 빔은 다음과 같습니다 ( e ) 2 개의 경로로 분할되어, 양쪽 빔이 섬유에 결합되기 전에 칼날로 부분적으로 차단되지만 반대 방향에서 부분적으로 차단된다. 이 두 빔은 최종 이미지의 두 (반대) 인코딩 된 위상차 대비를 나타냅니다. 양 신호의 동시 검출을 위해, 신호들 중 하나는 ( g ) 시간 지연 라인을 겪게되어, 두 신호는 시간에 다중화 (인터리빙)된다. 데이터 수집에는 고속 광 검출기와 실시간 오실로스코프가 사용됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
- 시간 retch 모듈
- 근적외선 (NIR) 범위 인 800-1,500 nm의 권장 중심 파장을 갖는 광대역 펨토초 (ps) 또는 피코 초 (ps) 펄스 레이저 광원을 사용하십시오.
참고 : 일반적으로 필요한 펄스 폭은 100fs에서 몇 ps까지 다양합니다. 펄스 레이저 소스의 세부 요구 사항은 참고 자료 4 및 5에서 볼 수 있습니다. 중요한 측정 기준은 표 1에 강조 표시되어 있습니다.- 레이저 소스는 ATOM에서 초고속 이미징을 보장하기 위해 메가 헤르츠 영역 ( 예 : 수십 MHz)으로 높은 반복률을 유지해야합니다. 또한 피크 출력 레이저 파워를 파이버 캐비티의 손상 파워 임계 값보다 약 1kW 낮게 설정하십시오.
- 펄스 레이저 소스의 우수한 샷 - 투 - 샷 시간 및 스펙트럼 안정성을 보장하십시오.
참고 : 스펙트럼 진폭 변동의 일반적인 허용 오차는 1.2 %, 19 , 20 ,ss = "xref"> 21,이 설정에서 파이버 모드 잠금 레이저에 의해 달성됩니다.
참고 : 레이저 소스의 광 대역폭은 단일 셀 이미징에서 충분한 이미징 시야 (field-of-view, FOV)를 보장하는 데 필수적인 10-100 nm 일 것으로 예상됩니다 21 .
- 광섬유 시준기를 통해 레이저 펄스 빔을 단일 모드 분산 광섬유에 연결합니다.이 광섬유에서 펄스는 그룹 속도 분산 (GVD)을 통해 확장됩니다 ( 그림 1a ).
참고 : 이것은 각 펄스의 스펙트럼이 파장 스위프 파형 ( 즉, 파장 대 시간 매핑)으로 시간에 매핑 된 후의 프로세스입니다.
참고 : 총 필요한 GVD는 전체 ATOM 이미지 해상도가 파장 대 시간 매핑 프로세스의 영향을받지 않도록하기에 충분해야합니다 (토론 참조). 일반적으로 NIR 범위에서 GVD는 0.1 ns / nm를 훨씬 넘어야합니다. 예를 들어, 단일 모드 광섬유는현재의 설정은 1,060 nm의 파장 (총 섬유 길이 10 km)을 중심으로 0.38 ns / nm의 총 GVD를 제공합니다.
- 근적외선 (NIR) 범위 인 800-1,500 nm의 권장 중심 파장을 갖는 광대역 펨토초 (ps) 또는 피코 초 (ps) 펄스 레이저 광원을 사용하십시오.
- 스펙트럼 인코딩 모듈
- 그림 1 에 나와있는 것처럼 미세 유체 채널을 따라 흐르는 세포의 스펙트럼 인코딩 이미징을 수행하는 광학 현미경 시스템을 구축하십시오.
참고 :이 광학 현미경의 주요 구성 요소는 다음과 같습니다 : (1) 회절 격자, 텔레스코픽 릴레이 렌즈 모듈 ( 그림 1의 RL1과 RL2) 및 두 개의 대물 렌즈 ( 그림 1의 Obj1과 Obj2).- 먼저, 스펙트럼을 생성하기 위해 회절 격자 (투과형 격자가이 설치에 사용됨)로 시간이 연장되고 평행 한 빔을 비추십시오 ( 그림 1c ).
참고 : 회절 빔의 파워 ( 즉, 회절 효율)는 t그는 Littrow 형상에 닫힌 회절 격자를 사용했다. - 4-f 이미징 시스템에서 두 개의 릴레이 렌즈 (RL1과 RL2)를 구성합니다 ( 즉, RL1의 초점 평면에 회절 격자를 놓고 RL1과 RL2를 초점 거리의 합과 같은 거리만큼 분리시킵니다). 대물 렌즈 (Obj1)의 후 초점면 상에 결상된다.
- 조심스럽게 Obj1의 뒷면 구멍을 채우기 위해 스펙트럼 샤워를 정렬하여 스펙트럼 샤워가 투사되고 현미경의 이미지 평면에 초점을 맞출 수 있도록하십시오.
참고 : 여기서, 대물 렌즈 ( 그림 1의 Obj1)의 NA는 0.75입니다. - 비슷한 대물 렌즈 (Obj2) ( 그림 1의 Obj2)와이 대물 렌즈 (Obj2)의 후면 구멍에 평면 거울을 배치하여 스펙트럼 샤워 빔을 이미지 평면을 두 배 통과시키고 회절 격자.
- 맞추다한 쌍의 대물 렌즈 (Obj1, Obj2)는 그 초점면이 서로 겹치도록 배치된다. 스펙트럼 샤워가 동일한 위치에서 이미지 평면을 두 번 통과하고 동일한 경로를 따라 격자로 되돌아가는 지 확인하십시오. 그렇지 않은 경우 광학 시스템을 추가로 정렬하고 조정하십시오.
참고 : 반환 된 빛은 비대칭 탐지 모듈로 광선을 전송할 수 있도록 추가 광선 분배기를 통과해야합니다. - 적절한 레벨에서 광 증폭기 게인을 조정하면 결과 신호가 일반적으로> 10dB 인 양호한 SNR로 광 검출기로 검출 될 수 있습니다.
- 샘플 플랫폼에 microfluidic 칩의 위치를 배치하고 조정하고 스펙트럼 샤워 및 이미징 영역이 미세 유체 채널 ( 그림 1d )에 걸쳐 있는지 확인하십시오.
참고 : 스펙트럼 샤워는 m 내부의 유동체의 흐름 방향에 직각으로 조명됩니다.흐르는 유체가 자동으로 2 차원 (2D) 스캔을 수행하도록 마이크로 유체 칩에 부착됩니다.
- 먼저, 스펙트럼을 생성하기 위해 회절 격자 (투과형 격자가이 설치에 사용됨)로 시간이 연장되고 평행 한 빔을 비추십시오 ( 그림 1c ).
- 그림 1 에 나와있는 것처럼 미세 유체 채널을 따라 흐르는 세포의 스펙트럼 인코딩 이미징을 수행하는 광학 현미경 시스템을 구축하십시오.
- 비대칭 검출 모듈
- 이미징 된 인코딩 된 빔을 두 개로 분리하기 위해 추가 빔 분리기를 배치하십시오 ( 그림 1e ).
참고 : 각 빔 복제품은 칼날로 부분적으로 차단됩니다. - 빔 블록 이전에 빔의 광 출력을 측정하고 기록하십시오. 그런 다음 육안 검사를 통해 빔의 절반을 대략 차단하도록 (선형 변환 스테이지에 장착 된) 나이프 에지를 수동으로 배치합니다. 그 후에 광 파워 미터를 사용하여 빔 파워를 모니터링하면서 빔 가장자리를 따라 칼날의 위치를 미세 조정하십시오.
참고 : 최적의 위치는 전원이 원래 값의 50 %까지 감소되는 위치 ( 즉, 차단되지 않은 경우)로 제안됩니다. 이것은 이미지 신호의 최상의 조합을 제공하는 조건입니다강도 및 이미지 대비 강화. - 다른 빔 복제본에 대해서도 2.3.2 단계를 반복하십시오. 한 빔에 대한 부분 빔 블록의 방향은 다른 빔에 대해 반대 방향이어야합니다 ( 그림 1f ).
- 부분적으로 차단 된 2 개의 광선을 2 개의 섬유 콜리메이터를 통해 2 개의 개별 단일 모드 섬유 암으로 결합하십시오.
참고 : 팔 중 하나에는 광섬유 기반 지연 선으로 사용되는 추가 길이의 광섬유가있어 다른 복제본 (지연 선 제외)과 관련하여 시간 지연을 도입합니다 ( 그림 1g ). 둘 다 광 검출 전에 광섬유 커플러에 의해 단일 광섬유로 보내집니다. 시간 지연은 두 복제본을 시간적으로 분리하고 다음 파형과의 시간적 중복을 피하기에 충분히 짧아야합니다 ( 즉, 두 복제본은 항상 감지 전에 단일 섬유에서 시간 인터리빙 및 시간 다중화됩니다 ( 그림 2a )). - 캡감지 된 광 신호를 실시간 오실로스코프로 디지털화하고 디지털화합니다. 오실로스코프의 대역폭과 샘플링 속도는 최종 이미지 해상도에 영향을주지 않도록 충분히 높아야합니다 (설명 참조).
참고 : 0.38 ns / nm의 GVD를 사용하면 백엔드 획득 대역폭 및 샘플링 속도가> 20 GHz 및> 40 GSa / s가 각각 필요합니다.
- 이미징 된 인코딩 된 빔을 두 개로 분리하기 위해 추가 빔 분리기를 배치하십시오 ( 그림 1e ).
3. 실험 절차
- 시편 적재
- 표준 hemocytometer에서 기존의 위상차 현미경으로 세포 카운팅을 수행하십시오.
- 1x PBS로 희석하여 세포 밀도를 조정하고 (마이크로 조류에 대한 샘물과 함께) 피펫으로 잘 섞는다.
참고 : 제안 농도는 10 5 ~ 10 6 cells / mL입니다. - Microfluidic 칩을 광학 이미징 시스템의 샘플 플랫폼에 장착하십시오.
참고 : microfluidic칩은 주로 PDMS (polydimethylsiloxane)로 만들어지며 표준 복제 성형 방법을 사용하여 제작됩니다. 미세 유동 채널은 관성 유동 포커싱 효과를 생성하기 위해 비대칭 곡선 채널로 설계되어 세포가 이미징 섹션 (80 μm x 80 μm (높이 x 너비) 크기)의 단일 파일로 고속으로 흐를 수 있습니다 . - 밀도 조정 셀 솔루션을 10 ML 주사기로 전송하십시오.
- 주사기를 microfluidic 칩의 입구에 연결하고 원심 튜브를 microfluidic 칩의 출구에 연결하여 처분하십시오.
- 주사기 펌프에 주사기를 장착하고 바람직한 처리량을 제공하고 셀과 채널 사이에 과도한 전단력을 부과하지 않도록 적절한 유속을 설정하십시오.
참고 : 시료의 선형 속도는 0.5 ~ 10 m / s 이내 여야합니다. 실제 이미지를 기록하기 전에 시스템을 더욱 미세 조정해야 할 필요가 있습니다.이미지 신호 강도 및 단계 2.2.1.4-2.2.1.6을 반복하여 이미지 포커싱을 최적화합니다.
4. 데이터 수집
- 각 실험마다 저장할 데이터 포인트의 적절한 수를 설정하십시오. 저장할 데이터 포인트의 수는 샘플의 크기와 유속에 따라 다릅니다.
참고 : 일반적으로 샘플링 속도 80 GSa / s에서 8-16 백만 샘플 포인트로 설정됩니다. - 오실로스코프를 사용하여 배치 모드에서 데이터를 수집하고 저장하십시오.
5. 백엔드 처리
그림 2 : 라인 스캔 시간 추적에서 ATOM 이미지 재구성 흡수 대비 및 차동 (향상된) 위상 구배 대비를 사용하여 ATOM 이미지를 재구성하기 위해 두 세트의 시간 확장 펄스 (보라색 및 녹색 펄스 참조)가( a ) 시간 - 다중화 된 시간 파형 트레이스와 디지털 적으로 분할되어 ( b ) 2 개의 반대 위상 - 그라데이션 대조를 나타내는 2 개의 2D 이미지를 형성하도록 적층된다. 레이저 반복률 추정에서 반올림 오차로 인한 부 인덱스 시프트를 보상하여 왜곡없는 이미지를 형성하기 위해 전단 작업이 필요하다는 점에 유의하십시오. 레이저 소스의 스펙트럼 강도 엔벨로프로부터 ( d ) 미가공 라인 - 스캔을 감함으로써, 이미지의 배경이 제거 될 수있다. ( g ) 흡수 콘트라스트 이미지는 이미지 ( e )와 이미지 ( f )의 픽셀 별 픽셀 합계에 의해 얻어 질 수있는 반면, ( h ) 이미지의 차감에서 차동 위상차 콘트라스트 이미지가 얻어 질 수있다. ) 및 (f). 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.이 그림의
- 오프라인 이미지 재구성을 위해 오실로스코프에서 컴퓨터로 데이터를 전송하십시오.
참고 : 여기서 데이터는 휴대용 하드 디스크에 저장되고 오실로스코프와 처리 컴퓨터간에 수동으로 전송됩니다. 하드 디스크의 용량은 각 실험마다 500GB 이상이어야합니다.- 키 이미지 재구성 루틴을 사용하여 라인 스캔을 디지털 방식으로 스태킹하여 2D 이미지를 형성하십시오 ( 그림 2 ).
참고 : 사용자 정의 프로그램 (MATLAB)은 두 개의 시간 다중 데이터 세트 ( 그림 2의 보라색 및 녹색 파형)를 분리하여 두 개의 비대칭 검출 이미지를 생성합니다.- 두 개의 비대칭 검출 이미지의 강도를 뺀 차분 위상차 이미지를 얻습니다. 2 개의 비대칭 검출 화상을 부가함으로써 흡수 콘트라스트 화상을 얻을 수있다. MCF-7 및 미세 조류의 선택된 이미지보기그림 3 . 개별 이미지의 배경 프로파일은 먼저 제거해야하며 이미지 합계 및 빼기 작업을 수행하기 전에 그 강도를 정규화해야합니다.
- 추가 분석을 위해 세포 부피, 원형도 및 흡수 밀도 등과 같은 이미지에서 파생 된 매개 변수 라이브러리를 생성합니다.
- 키 이미지 재구성 루틴을 사용하여 라인 스캔을 디지털 방식으로 스태킹하여 2D 이미지를 형성하십시오 ( 그림 2 ).
- 데이터 라이브러리를 데이터 시각화 플랫폼에 입력하십시오 ( 그림 4 ).
- 매개 변수 라이브러리 및 해당 재구성 된 이미지를 시각화 인터페이스 플랫폼에로드하십시오.
- 원하는 매개 변수로 축을 설정하십시오.
참고 : 매개 변수는 특정 문제이며 사용자가 정의합니다. 그것들은 MATLAB 프로그램에 의해 ATOM 이미지에서 파생됩니다. 여기에서, 세포의 광 흡수 밀도, 세포 면적, 세포 부피 및 세포 원형도를 선택할 수 있습니다. 표시 할 데이터 세트를 선택하면 모든 셀 이미지를 산점도의 다른 데이터 포인트로 시각화 할 수 있습니다. - 마우스 커서를 각 지점으로 이동하면 해당 이미지와 다른 매개 변수가 부동 하위 창에 표시됩니다.
참고 : 대화 형 방식으로 축을 선형 눈금과 로그 눈금 사이에서 변경할 수 있습니다. - 산점도를 수동으로 게이팅하여 데이터 세트의 하위 집합에 대한 추가 분석을 수행합니다.
참고 : 게이트 된 하위 집합의 모든 매개 변수에있는 막대 그래프를 전체 라이브러리에 대한 그래프로 그릴 수 있습니다. 별도의 히스토그램은 다른 부동 하위 창에 표시됩니다.
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Representative Results
이 연구는 포유류 세포 (인간 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)와 유방암 세포 (MCF-7))와 식물 플랑크톤 (Scenedesmus and Chlamydomonas)과 의 두 가지 단세포 영상 시연을 ATOM이 보여줍니다. 첫 번째 실험은 혈액에서 순환하는 종양 세포 (CTCs)의 탐지, 열거 및 특성 결정을위한 액체 생검에 대한 관심 증가로 인해 이루어졌습니다 23 . 일차 종양 부위에서 혈류로 전파되는 CTCs를 측정하는 능력은 전이성 암 진행을 검사 할 수있게합니다 24 , 25 . 그러나 CTC 분석에는 다음과 같은 과제가 있습니다. (i) CTC 수치는 전혈에서 과다한 금액보다 적습니다. CTC를 확인하고 회수하는 현재의 방법은 주로 세포 농축 및 분리 단계를 포함한다 class = "xref"> 26 , 27 , 28 . 그러나 혈액 세포의 오염 배경 및 / 또는 농축 된 CTCs의 생존 가능성은 이후의 분자 분석 ( 예 : RNA 시퀀싱)에 대한 관심사로 남아있다. (ii) CTCs는 생물 물리학 적 및 생체 분자 표지 모두에서 매우 이질적이며 CTC 농축 및 검출의 효율을 제한한다. 이를 위해 높은 이미징 처리량을 가진 라벨없는 이미징 유동 세포 계측법은 막대한 양의 혈구 내에서 CTCs의 직접적인 영상 진단 및 식별을 가능하게하고, 농축 단계를 최소화하거나 우회하는 매력적인 도구입니다.
두 번째 실험은 특히 환경 과학의 진보에 영향을 줄 수있는 대규모 식물성 플랑크톤 특성화와 관련이있다 ( 예 : 유해 조류 벌레 (HAB) 종의 검출s = "xref"> 29 그리고 재생 가능한 바이오 디젤 공급원으로서의 미세 조류 종의 확인) 17 . ATOM이 가능하게하여, 식물성 플랑크톤의 고 처리량 및 고 콘트라스트 단일 세포 이미징 능력은 다른 속 및 종에 걸친 크기, 질감 및 형태의 복잡한 이질성을 밝히는 데 유용 할 수 있습니다.
그림 3 은 포유 동물 세포, MCF-7 및 PBMC (~ 10m / s의 속도로 흐르는)뿐만 아니라 ATF에 의해 캡처 된 미세 조류, Scenedesmus 및 Chlamydomonas (~ 2m / s의 속도로 흐르는 것) . 네 가지 경우 모두 두 개의 반대 위상 기울기 대조가 두 개의 시간 다중화 된 비대칭 감지 신호 (단계 2.3에서 설명)에 의해 획득되었습니다. 그것들은 모두 DIC 이미지를 닮은 유사 3 차원 모양을 나타내며, 각각은 두 개의 반대 음영 방향 ( 그림 3a의 1 열과 2 열)을 나타냅니다
이 연구는 세포 원형도 및 세포 크기와 같은 생물 물리학 적 성질이 MCF-7과 PBMC의 분류. MCF-7 표본에는 두 개의 클러스터가 관찰됩니다. 모든 데이터 포인트에 대해 고 대비 이미지를 사용할 수 있으므로 클러스터 중 하나가 파편 / 파편에 해당한다는 것을 면밀히 관찰 할 수 있습니다 ( 그림 4a ). ATOM 영상에 기초한 식물 플랑크톤의 두 종 사이의 유사한 분류도 수행되었다. 여기에서 분류 결과는 사용자 정의 된 사용자 인터페이스 ( 그림 4 )로 시각화 된 2D 분산 플롯 형태로 제공됩니다. 각 셀에 해당하는 산점도의 주석 된 각 데이터 포인트는 ATOM에서 파생 된 여러 매개 변수로 더 자세히 조사 할 수 있습니다. 해당 ATOM 이미지를 플롯에 직접 대화 형으로 표시 할 수도 있습니다. 또한이 시각화 인터페이스에서 수동 게이팅이 지원되어 분류 및 분석을 더 쉽게 할 수 있습니다.
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그림 3 : 초고속 유속 (~ 2-10 m / s)에서 미세 조류 및 포유류 세포의 원자 이미지 갤리. ( a ) Scenedesmus; ( b ) 클라 미도 모나스; ( c ) 유방암 세포, MCF-7; 및 ( d ) 인간 PBMC. Scenedesmus와 Chlamydomonas는 ~ 2m / s에서 흘러 나오고 MCF-7과 PBMC는 10m / s에서 흘러 나온다. 각 셀 유형의 왼쪽 두 열 (열 1 및 2)은 두 개의 반대 위상 구배 대비를 나타냅니다. 열 3 및 4는 각각 흡수 대조 및 차동 (강화 된) 위상 - 구배 대조를 나타낸다. 눈금 막대 = 20 μm (빨간색). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Fi그림 4 : ATOM 이미지를 기반으로 한 Cytometry 분석을위한 그래픽 사용자 인터페이스. 이 인터페이스에서 사용자는 ATOM 이미지에서 파생 된 다양한 셀 매개 변수 ( 예 : 셀 크기, 원형도, 흡수 밀도 등 )를 정의하여 셀 유형 분류 및 분석을 수행 할 수 있습니다. 중앙 패널에 표시되는 산점도로 결과를 나타낼 수 있습니다. x 축 및 y 축 (X 및 Y 축 매개 변수 단추) 및 데이터 세트 간 전환 (데이터 집합 단추)에 대한 매개 변수 및 배율 변경과 같은 다양한 표시 옵션에 대한 액세스 및 제어가 가능합니다. 구체적인 셀 정보 (셀 정보 탭)는 특정 데이터 포인트를 가리키면 읽을 수 있습니다. 빠른 탐색을 가능하게하기 위해 사용자는 다른보기 모드로 변경하고 중앙 패널 (보기 모드 단추)에서 산점도의 모든 이미지를 동시에 표시 할 수 있습니다. 수동 게이팅은 추가 분석을 위해 수행 될 수도 있습니다. 황색 데이터 포인트는 MCF-7 세포 표본 (in a (<적색 데이터 포인트는 ( a )의 인간 PBMC 표본과 (b)의 Chlamydomonas (CHA)를 대표하는 반면, 빨간색 데이터 포인트는 ( b )의 Scenedesmus (SCE)를 나타낸다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
ATOM 시스템 설정 중에 특별한주의가 필요한 몇 가지 기술 세부 사항이 있습니다. 첫째, 비대칭 / 비스듬한 스펙트럼으로 인코딩 된 조명이 흡수 콘트라스트에서 잔류 위상 구배 성분 ( 즉, 쉐도 잉 효과)을 도입 할 수 있고 ATOM에서 위상 구배 콘트라스트의 강화에 영향을 미칠 수 있다는 점에 유의해야한다. 따라서, 경사 조명의 이러한 효과는 최소화되어야한다. 두 번째로, 두 개의 복제본을 포함하는 시간 다중화 또는 시간 인터리빙 방식은 이미지 속도 ( 즉, > MHz의 라인 스캔 속도는 여전히 유지 될 수 있음)를 현저하게 저하시키지 않는다는 점을 강조해야한다. 전체 시간 너비 두 개의 빔 - 복제본 중 하나가 한 라인 - 스캔 기간을 초과하지 않는다. 셋째, 분산 형 광섬유 및 증폭기의 통합 모듈의 최적 구성은 사용 가능한 증폭기의 사양으로서 목표로하는 이득에 달려있다. 광 증폭은 본질이다GVD 22 와 관련된 광 손실을 막기 위해 시간 - 스트레치 과정을 거쳐야합니다. 원칙적으로, 그것은 광섬유 기반의 시간 - 신장 과정 ( 도 1b )과 양립 할 수 있도록, 바람직하게는 섬유 형태의 임의의 유형의 광 증폭기에 의해 구현 될 수있다. 광섬유 기반의 광 증폭기의 실용적인 예로는 파장이 1,500 ~ 1,600 nm 인 EDFA (Erbium-Doped Fiber Amplifier), 1,060 nm 이하의 파장을 갖는 YTFA, 광섬유 라만 증폭기, 및 광섬유 매개 변수 증폭기 (FOPA, 원칙적으로 펌프 레이저 소스를 사용할 수있는 한 모든 작동 파장 용)가 있습니다. 앰프 노이즈는 모듈 설계시 신중하게 고려해야합니다. 상세한 이론은 참고 문헌 8에서 볼 수있다. 일반적인 구성은 다중 분산 섬유 세그먼트 (각각 길이가 수 km에 이른다) 사이에 삽입 된 다중 / 직렬 광섬유 증폭기를 포함 할 수있다. ATOM의 경우일반적으로 시간 - 스트레치 이미징의 경우, 일반적인 온 - 오프 광 출력 게인은 약 20-30 dB가되어야합니다. 작동 파장 범위는 일반적으로 ~ 800-1,550 nm로 제한되며, 주로 짧은 파장 ( 즉, 가시 파장)에서 매우 높은 광섬유 손실로 인해 발생합니다. 따라서 대부분의 시간 - 스트레치 이미징 시연과 마찬가지로 섬유 기반 ATOM은 가시광 작동이 여전히 보편적 인 형광 이미징에 즉시 적용될 수 없습니다. 그럼에도 불구하고 FTA (Free-Space Angle-Chirp-Enhanced Delay)라고 불리는 시간 - 스트레치와 유사한 자유 공간 펄스 스트레칭 개념이 최근 형광 이미징뿐만 아니라 ATOM의 초고속 레이저 스캐닝 이미징에 사용되었습니다 가시 파장 30 .
미묘한 설계 고려가 필요한 또 다른 중요한 매개 변수는 이미지 해상도입니다. 고전적인 광학 현미경과 달리, 이미지ATOM의 해상도 및 스펙트럼 샤워 축을 따르는 일반적인 시간 - 스트레치 이미징은 3 개의 제한 영역 ( 22 )에 의해 제어된다 : (ⅰ) 공간 분산 제한 해상도는 회절 격자의 스펙트럼 해상도와 관련되며, δx 공간으로 표시된다 ; (ii) GVD ( 22)의 제곱근에 반비례하는 파장 - 시간 맵핑 프로세스 δxSPA 의 모호성으로서 정의되는 정지상 근사 한계; (iii) 최종 공간 해상도에 영향을 미칠 수있는 광 검출기의 유한 대역폭을 나타내는 광 검출기 - 제한 해상도 δx det . 일반적으로이 세 가지 매개 변수 중 가장 큰 값은 ATOM의 이미지 해상도, δ x 로 정의됩니다 ( 즉, δ x = max { δ x 공간 , δ
현재의 ATOM 데모 및 프로토콜은 데이터 수집이 오실로스코프에 의해 수행되고 데이터 처리가 오프라인으로 진행된다는 것을 보여 주지만 실시간 데이터 수집, 처리 및 분석을 달성하는 것이 유리합니다. ATOM이 가져온 초고 고 콘트라스트 이미지 캡쳐 기능. 이를 위해 GPU (Graphic Processing Unit) 및 / 또는 FPGA (Field-Programmable Gate Array)와 같은 고성능 및 고 처리량 신호 처리 장치를 채택해야합니다. 1 ~ 10GB / s의 높은 데이터 처리량을 달성합니다. 이것은 ATOM의 초고속 샘플링 능력 ( 즉, ~ 10 GSa / s)과 호환됩니다. ATOM과 처리량이 많은 데이터 처리 통합ccelerator는 데이터 기반 생물학 연구에서 새로운 패러다임을 가능하게합니다. 특히 거대한 인구 집단 내의 서로 다른 단일 세포 사이의 미지의 이질성을 밝혀내는 데 도움이됩니다. 이러한 기술은 질병 발생 과정에서 희귀하고 비정상적인 세포가 라벨없는 방식으로 정량화 될 수있는 차세대 임상 연구에 힘을 실어 줄 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
우리를 위해 MCF-7을 준비해 준 P. Yeung에게 감사드립니다. 이 연구는 중국 특별 행정구 홍콩 특별 행정구 연구 보조금위원회 (프로젝트 번호 17259316, 17207715, 17207714, 17205215 및 HKU 720112E), 혁신 및 기술 지원 프로그램 (ITS / 090 / 14 ), HKU 대학 발전 기금 등이있다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Nikon Plan Fluorite Physiology Objectives 40X | Nikon | MRF07420 | Objective lens (Obj2) |
| Olympus Plan Fluorite Objective, 0.75 NA, 0.51 mm WD, 40X | Olympus | RMS40X-PF | Objective lens (Obj1) |
| N-BK7 Plano-Convex Lenses | Thorlabs | LA1145-C | For relaying spectral shower |
| FC/APC Fiber Collimation Package | Thorlabs | F220APC-1064 | For outputing and collecting laser pulses |
| Pellicle beamsplitter | Thorlabs | BP145B3 | For making beam replica |
| Protected silver mirror | Thorlabs | PF10-03-P01 | For reflecting light |
| 800-1650nm 12GHz single mode DC-coupled NIR Photoreceiver | Newport | 1544-B | For converting light into electrical signal |
| Infiniium High-Performance Oscilloscope | Agilent | DSOX91604A | To save the light-converted electrical signals |
| HI1060 optical fiber | Corning | HI1060 | Optical fiber for time-stretch |
| YTTERBIUM DOPED FIBER AMPLIFIER | Keopsys | KPS-STD-BT-YFA-37-BO-SM-111-FA-FA | Optical in-line amplifier |
| Holographic grating | Wasatch Photonics | 020305-6 | Grating |
| Infuse/Withdraw Syringe Pumps | Harvard Apparatus | PHD 2000 | Syringe pump for sample loading in micro-fluidic channels |
References
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