Summary
Dit protocol beschrijft de implementatie van een asymmetrische detectie tijdstens optisch microscopiesysteem voor single-cell imaging in ultrafast microfluidische stroom en zijn toepassingen in beeldstroomcytometrie.
Abstract
Het scaleren van het aantal meetbare parameters, waarmee multidimensionale data-analyse en daarmee hogere-vertrouwen statistische resultaten mogelijk zijn, is de belangrijkste trend in de geavanceerde ontwikkeling van flowcytometrie. Met name, het toevoegen van hoge resolutie beeldvorming mogelijkheden staat voor de complexe morfologische analyse van cellulaire / subcellulaire structuren. Dit is niet mogelijk met standaard flow cytometers. Het is echter waardevol voor het bevorderen van onze kennis van cellulaire functies en kan profiteren van wetenschappelijk onderzoek, klinische diagnostiek en milieu-monitoring. Het integreren van beeldcapaciteit in flowcytometrie maakt een compromis voor de analyse, vooral door de beperkingen op snelheid en gevoeligheid in de camera technologieën. Om deze snelheid of doorstroomuitdaging tegen beeldstroomcytometrie tegen te gaan terwijl de beeldkwaliteit wordt behouden, is de asymmetrische detectie-tijdoptische optische microscopie (ATOM) aangetoond om in hoge resolutie, single-cell imagMet een subcellulaire resolutie, bij een beeldvormende doorvoer zo hoog als 100.000 cellen / s. Op basis van het beeldvormende concept van conventionele time-stretch imaging, die afhankelijk is van all-optical image encoding en retrieval door het gebruik van ultrafast breedband laser pulsen, bevordert ATOM de beeldprestatie verder door het beeldcontrast van ongemerkt / niet-gestikte cellen te verbeteren. Dit wordt bereikt door toegang te krijgen tot de fase-gradiëntinformatie van de cellen, die spectraal gecodeerd wordt in single-shot breedbandpulsen. Bijgevolg is ATOM bijzonder gunstig in metingen met een hoge doorvoer van single-cell morfologie en textuurinformatie die indicatief is voor celtypes, staten en zelfs functies. Uiteindelijk zou dit een krachtig beeldvormend flow cytometry platform kunnen worden voor de biofysische fenotypering van cellen, die de huidige state-of-the-art biochemische markering gebaseerde cellulaire test aanvullen. Dit werk beschrijft een protocol om de sleutelmodules van een ATOM-systeem vast te stellen (van optische frontend naar data pRocessing en visualisatie backend), evenals de workflow van beeldstroom-cytometrie gebaseerd op ATOM, met behulp van menselijke cellen en microalgen als voorbeelden.
Introduction
Optische beeldvorming presenteert een krachtige tool en cel gebaseerde analyse om (bijna) niet-invasieve de gedetailleerde ruimtelijke verdeling van veel cellulaire / subcellulaire componenten te visualiseren, waardoor een groot aantal morfologische, biofysische en biomoleculaire signaturen van cellen wordt ontdekt. Deze mogelijkheid om high-content informatie uit enkele cellen te verzamelen is echter in het algemeen gecompromitteerd wanneer een enorme en heterogene celcellen onderzocht moesten worden. Dit markeert een gemeenschappelijke afweging in celanalyses tussen meting doorvoer en inhoud. Een opvallend voorbeeld is dat het toevoegen van beeldcapaciteit om de cytometrie te stromen resulteerde in een afschaling van de doorvoer met ten minste 1-2 orders van grootte in vergelijking met die van de klassieke non-imaging flow cytometers. Hoewel het complexe morfologische single-cell analyse kan bieden die niet mogelijk is met standaard flow cytometers 1 , ontbreekt beeldstroomcytometrie over het algemeen onvoldoende doorvoer naar idCellulaire heterogeniteit met hoge statistische vertrouwen inhouden. Dit is nodig voor nieuwe ontdekkingen in de biologie en voor het begrijpen van de pathogenese van ziekten. De belangrijkste technische uitdaging ligt in de inherente snelheidsbeperking die wordt opgelegd door de gemeenschappelijke optische beeldvormingstrategieën: laserstraalscanning, ( bijvoorbeeld door galvanometrische spiegels) en / of beeldsensoren ( bijv. Laadkoppelapparaat (CCD) en complementair metaal- Oxide halfgeleider (CMOS)). De laserscansnelheid wordt intrinsiek beperkt door de mechanische inertie van de aftastspiegels, terwijl de beeldsnelheid van CCD of CMOS beperkt is door de fundamentele afweging tussen beeldsnelheid en gevoeligheid ( dwz het verhogen van de beeldsnelheidskanalen tot een verminderde signaaldetectiegevoeligheid , en vice versa).
Op basis van een all-optisch, ultrafast beeldcoderend mechanisme is optische tijdreeksbeeldvorming aangetoond als een aantrekkelijk platform voor high-throughput imaging flow cytOmeters, zonder de conventionele beeldsensoren of mechanische laserscanning 2 , 3 . Gedetailleerde beschrijvingen van het werkprincipe van tijdreeksbeeldvorming zijn te vinden in referenties 4 , 5 , 6 , 7 . Kort samengevat bestaat het uit twee uitwisselbare mappingstappen: (i) spectrale codering (golflengte-ruimte mapping), waarbij de ruimtelijke coördinaten van het afgebeelde exemplaar worden toegewezen aan verschillende golflengten over het spectrum van de lichtpulse bundel 8 , 9 , En (ii) een dispersieve Fourier-transformatie (golflengte-time mapping) 9 , waarbij de golflengtecomponenten van individuele laserpulsen worden getransformeerd (uitgestrekt) via groepsnelheidsdispersie (GVD) in temporele golflengte-geveegde golfvormen ( Figuur 1 ). Een belangrijkeKenmerk van tijdreeksbeeldvorming is optische versterking, die een kritische rol speelt bij het bestrijden van het verlies van gevoeligheid door ultrafast fotodetectie en GVD-verlies, waardoor de beeldsignaal-ruisverhouding (SNR) wordt versterkt zonder dat het door het fotodetectorgeluid 9 wordt besmet . Aangezien elke laserpuls codeert voor een lijnscan van het afgebeelde monster, dat orthogonaal is voor de unidirectionele stroom van de cellen, wordt een effectieve lijnsnelheid bepaald door de laserherhalingstemperatuur, die typisch meer dan 10 MHz is. Deze ultrasnelle bediening maakt het mogelijk om onduidelijk beeldvorming met een cel op een doorsnede van 10.000-100.000 cellen / s te maken ( dwz 10-100 keer hoger dan conventionele beeldvormende flowcytometrie). Als gevolg daarvan kan tijdreeksbeelden unieke toepassingen vinden in high-throughput, single-cell, beeldgebaseerde screening, vooral wanneer er behoefte bestaat aan onbekende heterogeniteit of zeldzame / afwijkende cellen binnen een aanzienlijke populatie (duizenden tot miljoenen CEL Ls), zoals zeldzame kankercelscreening 10 of microalgeclassificatie 11 .
Tijdreeksbeeldvorming berust voornamelijk op beeldvorming op het gebied van de heldere veld (BF), waaruit het beeldcontrast wordt gegenereerd door lichtverdeling en absorptie van de cellen 2 , 3 , 9 , 10 , 11 . Zulke etiketvrije, single-cell imaging mogelijkheden kunnen de schadelijke effecten die verband houden met de fluorescerende labels, zoals cytotoxiciteit en photobleaching, omzeilen en toch waardevolle informatie verschaffen voor single-cell analyse gebaseerd op de cellulaire en subcellulaire textuur en morfologie. Deze labelvrije parameters zijn bewezen effectief te zijn voor de diepbeeldclassificatie van cellen, vooral als er een enorme celbevolking beschikbaar is 11 ,"Xref"> 12. In veel gevallen verzekert BF imaging echter niet voldoende contrast om de gedetailleerde morfologie van de labelvrije transparante cellen te onthullen. Verschillende labelvrije, fasecontrast-, tijdreeksafbeeldingsmodaliteiten zijn ontwikkeld om het imagingcontrast te verbeteren bij ultra snelle beeldsnelheden 13 , 14 , 15 . Onder deze technieken werd asymmetrische detectie-tijdreeks optische microscopie (ATOM) ontwikkeld om het fasegradiënt (differential-interference-contrast- (DIC) -achtig) contrast te tonen op basis van een concept vergelijkbaar met Schlieren photography, waardoor de label- Vrije, hoge contrast beeldvorming van enkele cellen met een ultrahoge microfluïdische snelheid (tot 10 m / s) 16 . Dit effect kan gemakkelijk worden gegenereerd door middel van schuine detectie of verlichting door het beeldgekodeerde straalpad gedeeltelijk te blokkeren of de balk voor de fotodetectie te kantelen. Een ander voordeel van ATOM is its aMogelijkheid om tegelijkertijd twee fase-gradiëntcontrasten te verkrijgen tegenover tegengestelde oriëntaties. Intensiteits subtractie en summatie van twee tegengestelde contrastbeelden geven het differentiaalfase-gradiëntcontrast en het absorptiecontrast respectievelijk van dezelfde lijnscanning. Dit werk bevat een gedetailleerd protocol waarin de implementatie van ATOM wordt beschreven, met inbegrip van de oprichting van de optische opstelling, de steekproefvoorbereiding en de dataverzameling en visualisatie. Specifiek, dit werk demonstreert de ATOM operatie met single-cell imaging van menselijke bloedcellen, kankercellen en fytoplankton (microalgen). Dit wijst op de toepasbaarheid van ATOM op het imaging van flowcytometrie, niet alleen in de biomedische arena, maar ook in onderzoek op zee- en biobrandstoffen 17 , 18 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Voorbeeld Bereiding
- Proefbereiding (hechtende cellen; MCF-7 cellen)
- Neem de celcultuurschotel uit de incubator en laat het kweekmedium af.
- Spoel de cellen op een schotel met 1x fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) om excessief kweekmedium te verwijderen.
- Voeg 3 ml van een oplossing van 0,25% trypsine toe aan de kweekschotel (diameter 100 mm) en zet deze gedurende 4 minuten in een 37 ° C, 5% C02 incubator.
OPMERKING: De trypsine lost het lijmproteïne van de cellen op, zodat ze loskomen van de kweekschotel. - Controleer of alle cellen losgemaakt zijn van de cultuurschotel met behulp van een lichtmicroscoop (10X objectief). Indien niet, schud de celcultuurschotel zachtjes.
- Voeg 4 ml van het standaardcultuurmedium toe (geformuleerd met 89% Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), 10% foetaal bees serum (FBS) en 1% penicilline streptomycine (PS)) om de werking van de trypsine te stoppen.
- TOntlont het gehele mengsel (cellen in trypsineoplossing en kweekmedium) naar een centrifugebuis en centrifugeer gedurende 5 minuten bij 200 x g.
- Verwijder alle vloeistoffen en verwijder de cellen opnieuw in 1 ml 1x PBS (pH-waarde: 7,4, voorverwarmd tot 37 ° C).
- Proefbereiding (gekweekte microalgen)
- Breng de gekweekte microalgen en het kweekmedium ( bijv. Zeewater, agar of zoet water) over naar nieuwe glascultuurbuizen (~ 15 ml) in een volumeverhouding (microalgen tot kweekmedium) van 1: 5 om vast te stellen Een nieuw subkweekmedium.
- Plaats de glascultuurbuizen in een stofvrije kamer met constante verlichting door kunstmatige verlichting van fluorescentielampen volgens een licht / donker (LD) cyclus (gewoonlijk LD 16: 8) gedurende 72-120 uur voor het experiment.
- Breng de sub-gekweekte monsters over naar een centrifugebuis en meng goed.
2. ATOM Systeem Setup
Figuur 1: Schematisch van een ATOM-systeem. Een breedband-gepulseerde laser wordt gebruikt om ultrafaste pulsen te leveren aan ( a ) een tijdreeksmodule en ( b ) een in-line optische versterker module. De time-stretch module genereert een trein van temporale golfvormen, die elk de replica zijn van het golflengtespectrum van de laserbron ( maw golflengte-naar-tijd mapping). De versterkermodule wordt gebruikt voor pulsuitrekkende (dispersieve) verliescompensatie. De uitgerekte puls wordt dan ( c ) ruimtelijk gedispergeerd door een diffractieratrix, waarbij een 1D spectrale douchebelichting wordt gevormd waarbij individuele golflengtecomponenten door een relaislenspaar worden doorgegeven en door de objectieflens op verschillende posities op de vloeiende cel in de ( d) ) Microfluïdische chip. Dit is het proces van spectrale codering. DeSpectraal gecodeerd licht zal de cel weer door een andere objectieflens en een spiegel passeren, terugkeren naar het diffraderraster en opnieuw combineren als een ruimtelijk niet-gedispergeerde gepulseerde bundel. Deze afbeelding-gecodeerde pulserende bundel is dan ( E ) verdeeld in twee paden, zodanig dat beide balken gedeeltelijk geblokkeerd zijn met ( f ) de mesrand, maar van tegenovergestelde richtingen, voordat ze in de vezels worden gekoppeld. Deze twee balken vertegenwoordigen de twee (tegenovergestelde) gecodeerde fase-gradiëntcontrasten van het uiteindelijke beeld. Voor de gelijktijdige detectie van beide signaalcontrasten ondergaat één van de signalen ( g ) een tijdvertragingslijn, zodanig dat de twee signalen in de tijd gemultiplexeerd worden (interleaved). Een high-speed fotodetector en real-time oscilloscoop worden gebruikt voor data-acquisitie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
- Tijdstip Retch module
- Gebruik een breedband femtosekonde (fs) of picosecond (ps) gepulseerde laserbron met een aanbevolen middellengte in het nabijgelegen infrarood (NIR) bereik, 800-1.500 nm.
OPMERKING: De typische vereiste pulsbreedte kan variëren van sub-100 fs tot een paar ps. Gedetailleerde eisen van de gepulseerde laserbronnen zijn te zien in Referenties 4 en 5. Belangrijke statistieken worden in tabel 1 gemarkeerd.- Zorg ervoor dat de laserbron een hoge herhalingssnelheid heeft, die in het megahertz-regime ( bijvoorbeeld tientallen MHz) moet zijn om ultra snelle beeldvorming in ATOM te waarborgen. Stel ook de piekvermogenlaserkracht goed onder de schadevermogendrempel van de vezelholte, ongeveer 1 kW.
- Zorg voor een goede shot-to-shot temporale en spectrale stabiliteit van de gepulseerde laserbron.
OPMERKING: Typische tolerantie in de spectrale amplitude fluctuatie moet binnen 1,2% gehouden worden 19 , 20 ,Ss = "xref"> 21, zoals bereikt door de lasergebaseerde laser in deze setup.
OPMERKING: De optische bandbreedte van de laserbron wordt verwacht op 10-100 nm, wat essentieel is om voldoende beeldvorming van de beeldweergave (FOV) te waarborgen in single-cell imaging 21 .
- Via een vezel collimator koppel je de laserpulsbundel aan een single-mode dispersieve optische vezel, waarbij de pulsen door middel van groepsnelheidsdispersie (GVD) worden getrokken ( Figuur 1a ).
OPMERKING: Dit is het proces waarna het spectrum van elke puls op tijd wordt afgebeeld als golflengte-geveegde golfvorm ( dwz golflengte-naar-tijd mapping).
OPMERKING: De totale vereiste GVD moet voldoende zijn om ervoor te zorgen dat de totale ATOM-beeldresolutie niet beïnvloed wordt door het golflengte-naar-tijd mappingproces (zie de discussie). In het NIR-bereik moet de GVD typisch ruim 0,1 ns / nm liggen. Bijvoorbeeld, een enkelvoudige vezel die in dezeS huidige setup biedt een totale GVD van 0,38 ns / nm rond de golflengte van 1.060 nm (een totale vezellengte van 10 km).
- Gebruik een breedband femtosekonde (fs) of picosecond (ps) gepulseerde laserbron met een aanbevolen middellengte in het nabijgelegen infrarood (NIR) bereik, 800-1.500 nm.
- Spectral-coderende module
- Construeer een optisch microscoop systeem om de spectraal gecodeerde beeldvorming van de cellen die langs het microfluïdische kanaal stromen, zoals weergegeven in Figuur 1, uit te voeren .
OPMERKING: De hoofdcomponenten van deze optische microscoop omvatten: (1) een diffractierat, een telescopische relay-lens module (RL1 en RL2 in Figuur 1 ) en twee objectieve lenzen (Obj1 en Obj2 in Figuur 1 ).- Verlicht eerst de tijdgestrekte en gecollimeerde bundel op een diffractieratroon (transmissie-type rooster is in deze setup gebruikt) om een spectrale douche te genereren ( Figuur 1c ).
OPMERKING: De kracht van de diffractiebalk ( dwz diffractie-efficiëntie) kan maximaal worden door t aan te passenHij raster oriëntatie gesloten voor de Littrow configuratie. - Configureer de twee relaislens (RL1 en RL2) in een 4-f beeldsysteem ( dwz plaats het diffractieratrix op het brandpunt van RL1 en scheid RL1 en RL2 met een afstand die gelijk is aan de som van hun brandpunten. Zal dan worden afgebeeld op het achterste brandpunt van de objectieve lens Obj1).
- Zet de spectrale douche zorgvuldig uit om de achterblind van de Obj1 te vullen, zodat de spectrale douche kan worden geprojecteerd en gefocust op het beeldvlak van de microscoop.
OPMERKING: hier is de NA van de objectieflens (Obj1 in Figuur 1 ) 0,75. - Plaats een andere objectieflens (Obj2 in Figuur 1 ) met een soortgelijke NA en een vlakke spiegel bij de achterkant van deze objectieflens (Obj2), zodat de spectrale douchestraal kan worden uitgelijnd om het beeldvlak dubbel te verplaatsen en terug te keren naar de diffractierooster.
- aanpassenHet objectief objectief (Obj1 en Obj2), zodat hun brandpunten elkaar overlappen. Controleer of de spectrale douche het beeldvlak op dezelfde locatie dubbel verlaat en terugkeert naar het raster op dezelfde weg. Als dat niet het geval is, voer dan verder de uitlijning en afstemming van het optische systeem uit.
OPMERKING: Het teruggegeven licht moet door een bijkomende straalknipper doorgaan, zodat het licht kan worden overgebracht naar een asymmetrische detectiemodule. - Stel de optische versterker versterking op een geschikt niveau, zodat het resulterende signaal door de fotodetector gedetecteerd kan worden met een goede SNR, die typisch bij> 10 dB is.
- Plaats en stel de positie van de microfluïdische chip op het monsterplatform in en controleer of de spectrale douche, en dus het beeldgebied, over het microfluïdische kanaal staat ( Figuur 1d ).
OPMERKING: De spectrale douche is orthogonaal verlicht aan de stromingsrichting van vloeistoffen in de mMicrofluidische chip, zodat de bewegende beweging automatisch twee-dimensionale (2D) scans uitvoert.
- Verlicht eerst de tijdgestrekte en gecollimeerde bundel op een diffractieratroon (transmissie-type rooster is in deze setup gebruikt) om een spectrale douche te genereren ( Figuur 1c ).
- Construeer een optisch microscoop systeem om de spectraal gecodeerde beeldvorming van de cellen die langs het microfluïdische kanaal stromen, zoals weergegeven in Figuur 1, uit te voeren .
- Asymmetrische detectiemodule
- Plaats een bijkomende straalverdeler om de afbeeldingscode te scheiden in twee ( Figuur 1e ).
OPMERKING: Elke balk replica is gedeeltelijk geblokkeerd door een mesrand. - Meet en teken de optische kracht van de balk voor het straalblok. Plaats dan de mesranden handmatig (gemonteerd op een lineaire vertaalfase) zodanig dat ze ongeveer de helft van de balk blokkeren (bij visuele inspectie). Gebruik daarna de optische stroommeter om de straalstroom te monitoren terwijl u de positie van de messen bewerkt door deze over de straal te vertalen.
OPMERKING: Het is aan te bevelen dat de optimale positie is waar de stroom wordt verminderd met ~ 50% van de oorspronkelijke waarde ( dwz de niet-geblokkeerde zaak). Dit is de voorwaarde die de beste combinatie van beeldsignaal levertKracht en beeldcontrastverbetering. - Herhaal stap 2.3.2 voor een andere beam replica. Merk op dat de oriëntatie van het gedeeltelijke straalblok voor één balk tegengesteld moet zijn ten opzichte van de andere balk ( figuur 1f ).
- Koppel de twee gedeeltelijk geblokkeerde balken in twee afzonderlijke, single-mode vezel armen door middel van twee-vezel collimatoren.
OPMERKING: Eén van de armen heeft een extra lengte vezel, die als vezelgebaseerde vertragingslijn dient, om een vertraging in te stellen ten opzichte van de andere replica (zonder de vertragingslijn) ( Figuur 1g ). Beiden worden voor een fotodetectie aan een enkele vezel geleid door een vezelkoppeling. De tijdsvertraging moet lang genoeg zijn om de twee replica's tijdelijk te scheiden en kort genoeg om temporele overlap met de volgende golfvorm te vermijden (dat wil zeggen, de twee replica's zijn altijd tijdinterleaved en tijdmultiplexeerd in een enkele vezel voorafgaand aan detectie ( Figuur 2a )). - petTure en digitaliseer de gedetecteerde optische signalen met de real-time oscilloscoop. Merk op dat de bandbreedte en dus de bemonsteringssnelheid van de oscilloscoop voldoende hoog moeten zijn om ervoor te zorgen dat ze de uiteindelijke beeldresolutie niet beïnvloeden (zie de discussie).
OPMERKING: hier zijn bij de GVD van 0,38 ns / nm een backend-acquisitiebandbreedte en bemonsteringssnelheid van respectievelijk> 20 GHz en> 40 GSa / s vereist.
- Plaats een bijkomende straalverdeler om de afbeeldingscode te scheiden in twee ( Figuur 1e ).
3. Proefprocedures
- Het laden van het monster
- Voer celtelling uit onder een conventionele fasecontrastmicroscoop in een standaardhemocytometer.
- Verstel de celdichtheid door te verdunnen met 1x PBS (met bronwater voor microalgen) en meng goed met een pipet.
OPMERKING: De voorgestelde concentratie is van 10 5 tot 10 6 cellen / ml. - Monteer de microfluïdische chip op het monsterplatform van het optische beeldsysteem.
OPMERKING: De microfluïdischeChip is voornamelijk gemaakt van polydimethylsiloxaan (PDMS) en is vervaardigd met behulp van de standaard replica molding methode. Het microfluïdische kanaal is ontworpen met een asymmetrisch gebogen kanaal voor het genereren van het inertiële stroomfocus effect, zodanig dat de cellen in een enkel bestand kunnen stromen in de beeldvormende sectie (met een afmeting van 80 μm x 80 μm (hoogte x breedte)) met hoge snelheid . - Breng de dichtheids-aangepaste celoplossing over op een 10 ml spuit.
- Verbind de spuit aan de inlaat van de microfluïdische chip en een centrifugale buis aan de uitlaat van de microfluïdische chip voor verwijdering van afval.
- Monteer de spuit op een spuitpomp en stel een geschikte stroomsnelheid in om gewenste doorvoer te geven en om te voorkomen dat overmatige schuifkracht tussen de cellen en het kanaal wordt opgelegd.
OPMERKING: De lineaire snelheid van de monsters moet binnen 0,5 en 10 m / s liggen. Merk op dat het voor het actuele beeldopname vaak nodig is om het systeem verder te verfijnen, in termen van het maximaliseren van deBeeldsignaalsterkte en optimalisatie van de beeldfocus door stappen 2.2.1.4-2.2.1.6 te herhalen.
4. Gegevensverzameling
- Stel voor elk experiment een geschikt aantal gegevenspunten in. Het aantal opgeslagen gegevenspunten hangt af van de grootte en de doorvoersnelheid van de monsters.
OPMERKING: Het is typisch ingesteld op 8-16 miljoen voorbeeldpunten onder een bemonsteringssnelheid van 80 GSa / s. - Verkrijg en bewaar de gegevens in een batchmodus met behulp van de oscilloscoop.
5. Backend Processing
Figuur 2: Reconstructie van ATOM-afbeeldingen uit de Line Scan Time Trace. Om de ATOM beelden te reconstrueren met het absorptiecontrast en het differentiaal (verbeterde) fase-gradiëntcontrast worden twee sets tijdgestrekte pulsen (zie de paarse en groene pulsen) geëxtraheerd uit(A) het tijdmultiplexeerde temporale golfvormspoor en worden dan digitaal gesegmenteerd en gestapeld om ( b ) twee 2D-beelden te vormen die de twee tegenover elkaar gelegen fase-gradiëntcontrasten tonen. Merk op dat er een schuifbewerking nodig is om ( c ) de vervormingsvrije afbeeldingen te vormen door de subindex-verschuiving te compenseren door de afrondingsfout in de schatting van de laserherhalingssnelheid. Door de ( d ) raw line-scan van de spectrale intensiteitsomhulling van de laserbron af te trekken, kan de achtergrond van de afbeeldingen verwijderd worden. ( G ) Een absorptiecontrastbeeld kan worden verkregen door een pixel-bij-pixelintensiteitsopname van beelden ( e ) en ( f ), terwijl ( h ) een differentiaalfase-gradiëntcontrastbeeld verkregen kan worden bij de aftrekking van afbeeldingen (e ) En (f). Klik hier om een grotere versie te bekijkenVan deze figuur.
- Verplaats de gegevens van de oscilloscoop naar de computers voor offline beeldherstructurering.
OPMERKING: hier worden de gegevens opgeslagen in een draagbare harde schijf en handmatig overgedragen tussen de oscilloscoop en de verwerkende computers. De capaciteit van de harde schijf moet voor elk experiment meer dan 500 GB zijn.- Gebruik de key image reconstruction routine om de lijn scans digitaal te stapelen om een 2D beeld te vormen ( Figuur 2 ).
OPMERKING: Het aangepaste programma (in MATLAB) produceert vervolgens twee asymmetrische detectiebeelden door de twee tijdmultiplexeerde datasets (paarse en groene golfvormen in figuur 2 ) te scheiden.- Verkrijg een contrastfase-gradiëntcontrastbeeld door de intensiteiten van de twee asymmetrische detectiebeelden af te trekken; Een absorptiecontrastbeeld kan worden verkregen door de twee asymmetrische detectiebeelden toe te voegen. Zie geselecteerde afbeeldingen van MCF-7 en microalgen inFiguur 3 . Houd er rekening mee dat de achtergrondprofielen van afzonderlijke afbeeldingen eerst moeten worden geëlimineerd, en hun intensiteiten moeten worden genormaliseerd, voorafgaand aan de beeldsomming en aftrekken.
- Genereer een bibliotheek met parameters afgeleid van de afbeeldingen, zoals celvolume, circulariteit en absorptiedichtheid, enz. Voor verdere analyse.
- Gebruik de key image reconstruction routine om de lijn scans digitaal te stapelen om een 2D beeld te vormen ( Figuur 2 ).
- Voer de bibliotheek gegevens in op het data visualisatie platform ( Figuur 4 ).
- Laad de bibliotheek van parameters en de bijbehorende gereconstrueerde beelden op het platform voor visualisatieinterface.
- Stel de assen als de parameters van belang.
OPMERKING: De parameters zijn probleemspecifiek en worden door de gebruiker gedefinieerd. Ze zijn afgeleid van de ATOM-afbeeldingen door het MATLAB programma. Hier zijn de optische absorptiedichtheid van de cel, celgebied, celvolume en celcirkulariteit beschikbaar voor selectie. Selecteer de dataset die u wilt weergeven, zodat elk celbeeld kan worden weergegeven als een ander gegevenspunt op het scatterplot. - Beweeg de muis cursor naar elk punt, zodat de bijbehorende afbeelding en andere parameters in een drijvend subvenster worden weergegeven.
OPMERKING: De assen kunnen op interactieve wijze tussen de lineaire en logaritmische weegschaal worden veranderd. - Voer verder analyse uit van elke subset van de dataset door handmatig op het scatterplot te gaten.
OPMERKING: Het histogram in elke parameter van de gated subset kan worden afgebeeld tegen die van de volledige bibliotheek. De afzonderlijke histogrammen worden weergegeven in een ander zwevend subvenster.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dit werk illustreert twee demonstraties met één cel van ATOM: één met zoogdiercellen (humane perifere bloedmononucleaire cellen (PBMC) en borstkankercellen (MCF-7)) en een ander met phytoplankton s (Scenedesmus en Chlamydomonas). Het eerste experiment werd gemotiveerd door de groeiende belangstelling voor vloeibare biopsie voor het detecteren, opnemen en karakteriseren van circulerende tumorcellen (CTC's) in het bloed 23 . De mogelijkheid om CTC's te meten die worden verspreid van primaire tumorplaatsen naar de bloedstroom, maakt het mogelijk om metastatische kankerprogressie 24 , 25 te onderzoeken . Er bestaan echter uitdagingen in CTC-analyse: (i) de CTC-telling is significant lager dan de buitensporige hoeveelheid bloedcellen in volledig bloed. Huidige methoden voor het identificeren en herstellen van de CTC's betreffen meestal celverrijking en scheidingsstappen Class = "xref"> 26 , 27 , 28 . De vervuilende achtergrond van bloedcellen en / of de levensvatbaarheid van de verrijkte CTC's blijft echter zorgen voor de volgende moleculaire analyse ( bijvoorbeeld RNA-sequencing) 29 . (Ii) CTC's zijn zeer heterogene in termen van zowel biofysische en biomoleculaire handtekeningen, waardoor de efficiëntie van de CTC-verrijking en detectie wordt beperkt. Daartoe is etiketvrije beeldvormende flowcytometrie met een hoge beeldvorming doorvoer een aantrekkelijk hulpmiddel dat de directe beeldvorming en identificatie van CTC's mogelijk maakt binnen een enorme populatie van bloedcellen, waardoor de verrijkingstappen worden geminimaliseerd of zelfs omzeild worden.
Het tweede experiment is vooral relevant voor grootschalige fytoplankton karakterisering, die de vooruitgang in de milieugeschiedenis kan beïnvloeden ( bijv. De detectie van schadelijke alg bloei (HAB) soortenS = "xref"> 29 en de identificatie van microalgische soorten als hernieuwbare biodieselbronnen) 17 . Door ATOM ingeschakeld, zou het vermogen van hoge doorvoer en een hoog contrast met een single-cell beeldvorming van fytoplankton waardevol kunnen zijn om de complexe heterogeniteit in grootte, textuur en morfologie over verschillende genus en soorten te onthullen.
Figuur 3 toont afbeeldingen van zoogdiercellen, MCF-7 en PBMC (vloeibaar met een snelheid van ~ 10 m / s), evenals microalgen, Scenedesmus en Chlamydomonas (stroomt met een snelheid van ~ 2 m / s), gevangen door ATOM . In alle vier gevallen werden de twee tegenover elkaar gelegen fase-gradiëntcontrasten verkregen door de twee tijdmultiplexeerde, asymmetrisch gedetecteerde signalen (beschreven in stap 2.3). Zij hebben allebei een pseudo-driedimensionale uitstraling, die lijkt op de DIC-beelden, die elk twee tegenover elkaar liggende schaduwrichtlijnen tonen (kolommen 1 en 2 in figuur 3a
Dit werk laat zien dat biofysische eigenschappen, zoals celcirkulariteit en celgrootte, kunnen worden gebruikt voor R de classificatie van MCF-7 en PBMC. Merk op dat twee clusters in het MCF-7-monster worden waargenomen. De beschikbaarheid van beelden met hoge contrast voor alle gegevenspunten stelt ons in staat om te controleren dat een van de clusters overeenkomt met fragmenten / puin ( Figuur 4a ). Een soortgelijke indeling tussen twee soorten fytoplankton op basis van ATOM-beelden werd ook uitgevoerd. Hier worden de classificatieresultaten gepresenteerd in een vorm van een 2D scatterplot dat wordt weergegeven door de aangepaste gebruikersinterface ( Figuur 4 ). Elk geannoteerd gegevenspunt in het scatterplot, dat overeenkomt met elke cel, kan verder worden onderzocht met verschillende parameters afgeleid van ATOM. Het bijbehorende ATOM-beeld kan ook interactief op het plot worden weergegeven. Handmatig gaten wordt ook ondersteund in deze visualisatie interface om verdere indeling en analyse te vergemakkelijken.
Iles / ftp_upload / 55840 / 55840fig3.jpg "/>
Figuur 3: ATOM Image Galley van Microalgen en Soogdiercellen bij een Ultrafast Flow Speed (~ 2-10 m / s). (A) Scenedesmus; ( B ) Chlamydomonas; ( C ) borstkankercellen, MCF-7; En ( d ) menselijke PBMC. De Scenedesmus en Chlamydomonas vloeien op ~ 2 m / s, terwijl MCF-7 en PBMC bij 10 m / s stroomden. De linker twee kolommen (kolommen 1 en 2) voor elk celtype vertegenwoordigen twee tegenover elkaar gelegen fase-gradiëntcontrasten. Kolommen 3 en 4 vertegenwoordigen respectievelijk het absorptiecontrast en differentiaal (verbeterd) fase-gradiëntcontrast. Schaalstaven = 20 μm (in het rood). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
FiGure 4: Een grafische gebruikersinterface voor cytometrische analyse op basis van ATOM Images. In deze interface kan de gebruiker celltype-indeling en analyse uitvoeren door verschillende celparameters ( bijvoorbeeld celgrootte, circulariteit, absorptiedichtheid, enz. ) Te bepalen die afgeleid zijn van de ATOM-afbeeldingen. Het resultaat kan worden weergegeven in een scatterplot die in het middenpaneel wordt weergegeven. Toegang tot en controle over verschillende weergaveopties, waaronder veranderende parameters en schalen voor de x- en y-as (X- en Y-as parameter toetsen) en het schakelen tussen gegevens sets (Dataset-knop), is mogelijk. Gedetailleerde celinformatie (celinformatie tab) kan worden gelezen door te zweven op een specifiek gegevenspunt. Om snelle navigatie mogelijk te maken, kan de gebruiker veranderen in een andere weergavemodus en tegelijkertijd alle afbeeldingen weergeven op het scatterplot in het middenpaneel (weergavemodus knop). Handmatig gaten kunnen ook worden uitgevoerd voor verdere analyse. Gele data punten vertegenwoordigen het MCF-7 celmonster (in ( a </ B>) en Scenedesmus (SCE) (in ( b )), terwijl de rode data punten het humane PBMC-monster (in (a)) en Chlamydomonas (CHA) (in (b)) vertegenwoordigen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Er zijn verschillende technische details die speciale aandacht behoeven tijdens de installatie van het ATOM-systeem. Ten eerste is het essentieel om op te merken dat asymmetrische / schuine spectraal gecodeerde verlichting residuele fase-gradiëntcomponenten ( dwz het schaduw effect) in het absorptiecontrast kan introduceren en de versterking van fase-gradiëntcontrast in ATOM kunnen beïnvloeden. Daarom moet dit effect van schuine verlichting worden geminimaliseerd. In de tweede plaats moet worden benadrukt dat de tijdmultiplexerende of tijdinterleavingregeling van twee replica's geen significant compromis op de beeldsnelheid tot gevolg heeft ( dwz de lijnsnelheid van> MHz kan nog steeds worden gehandhaafd), aangezien de totale temporele breedte Van twee bundelreplica's overschrijdt niet één lijn-scanperiode. Ten derde hangt de optimale configuratie van de geïntegreerde module van dispersieve vezels en versterkers af van de doelwinst als de specificatie van de beschikbare versterkers. Optische versterking is essentiaIk ben aan het proces van tijdreeks om het optische verlies dat verband houdt met GVD 22 te bestrijden. In principe kan deze worden uitgevoerd door elk type optische versterker, bij voorkeur in het vezelformaat, zodanig dat het compatibel is met het vezelgebaseerde, tijdreeksproces ( Figuur 1b ). Praktische voorbeelden van optische versterkers op basis van optische vezels zijn onder meer erbium-gedoteerde vezelversterkers (EDFA, voor werking golflengten van ~ 1.500-1.600 nm), ytterbium-gedoteerde vezelversterkers (YDFA; voor golflengten van ~ 1.060 nm), vezel Raman versterkers, En fiber optische parametrische versterkers (FOPA; voor elke golflengte in principe, zolang een pomplaserbron beschikbaar is). Versterkergeluid moet ook zorgvuldig in het moduleontwerp worden overwogen. Gedetailleerde theorie kan in Referentie 8 worden gezien. Een gemeenschappelijke configuratie kan meerdere / cascade-vezelversterkers omvatten die tussen meerdere dispersieve vezelsegmenten zijn ingebracht (elk heeft een lengte van enkele km). Voor ATOM aNd-tijdbeeldvorming in het algemeen, zou de typische on-off optische vermogenstoename ongeveer 20-30 dB moeten zijn. Opgemerkt moet worden dat het bereik van de golflengte van de werking typisch beperkt is tot ~ 800-1,550 nm, voornamelijk door het bijzonder hoge optische vezelverlies bij kortere golflengten ( dwz zichtbare golflengten). Daarom, op dezelfde manier als de meerderheid van de demonstratie van de tijdreeksbeeldvorming, zal de ATOM op vezelbasis niet direct van toepassing zijn op fluorescentiebeeldvorming, waar zichtbare lichte operaties nog steeds gebruikelijk zijn. Desalniettemin moet u opmerken dat een vrije ruimte- pulserend concept, dat lijkt op tijdstip, genaamd vrije ruimte-hoek-chirpversterkte vertraging (FACED), onlangs is gebruikt voor ultrasnelle laser-scannen beeldvorming in ATOM, evenals voor fluorescentie beeldvorming Bij zichtbare golflengten 30 .
Een andere belangrijke parameter die subtiele ontwerpoverwegingen vereist is beeldresolutie. In tegenstelling tot klassieke lichtmicroscopie, de afbeeldingResolutie van ATOM en algemene tijdreeksbeeldvorming langs de spectrale douchas wordt geregeld door drie beperkende regimes 22 : (i) de ruimtelijke-dispersie beperkte resolutie, die verband houdt met de spectrale resolutie van het diffractierat, aangeduid als δ x ruimtelijk ; (Ii) de stationaire fase benaderingsgrens, die wordt gedefinieerd als de dubbelzinnigheid van het golflengte-mapping proces δ x SPA , dat omgekeerd schaalt met de vierkantswortel van GVD 22 ; En (iii) de fotodetector beperkte resolutie δ x det , die de eindige bandbreedte van de fotodetector beschrijft die ook de uiteindelijke ruimtelijke resolutie kan beïnvloeden. In het algemeen wordt de grootste waarde onder deze drie parameters gedefinieerd als de beeldresolutie van ATOM, δ x ( dwz δ x = max { δ x ruimtelijk , δ
Terwijl de huidige ATOM demonstratie en protocol aantonen dat de data-acquisitie door oscilloscoop wordt uitgevoerd en de gegevensverwerking offline wordt gevolgd, is het gunstiger om real-time, doorlopende dataverzameling, verwerking en zelfs analyses te realiseren, met name het vermogen om te bereiken De ultra-snelle en high-contrast beeldopname mogelijkheden van ATOM. Hiervoor moet een high-performance en high-throughput signaalverwerkende eenheid worden aangenomen, zoals een grafische verwerkingseenheid (GPU) en / of een veldprogrammeerbare poortarray (FPGA), die aangetoond zijn om de mogelijkheid te hebben om Haal een verwerkingsdoorvoer tot ongeveer 1 tot 10 GB / s. Dit is compatibel met het ultra snelle monstervermogen van ATOM ( dwz ~ 10 GSa / s). De integratie van ATOM en een high-throughput data processing aCcelerator maakt een nieuw paradigma in data-driven biologische studies mogelijk, vooral bij het ontrafelen van de onbekende heterogeniteit tussen verschillende enkele cellen in een enorme populatie. Dergelijke technologie kan ook een nieuwe generatie klinisch onderzoek bemachtigen, waarbij zeldzame, afwijkende cellen tijdens het ziekteproces op een etiketvrije manier kunnen worden gekwantificeerd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Wij danken de heer P. Yeung voor het voorbereiden van de MCF-7 voor ons. Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door subsidies van de Research Grant Council van de speciale administratie regio Hongkong, China (Project nr. 17259316, 17207715, 17207714, 17205215 en HKU 720112E), het innovatie- en technologieondersteuningsprogramma (ITS / 090/14 ) En het Universiteits Ontwikkelingsfonds van HKU.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Nikon Plan Fluorite Physiology Objectives 40X | Nikon | MRF07420 | Objective lens (Obj2) |
| Olympus Plan Fluorite Objective, 0.75 NA, 0.51 mm WD, 40X | Olympus | RMS40X-PF | Objective lens (Obj1) |
| N-BK7 Plano-Convex Lenses | Thorlabs | LA1145-C | For relaying spectral shower |
| FC/APC Fiber Collimation Package | Thorlabs | F220APC-1064 | For outputing and collecting laser pulses |
| Pellicle beamsplitter | Thorlabs | BP145B3 | For making beam replica |
| Protected silver mirror | Thorlabs | PF10-03-P01 | For reflecting light |
| 800-1650nm 12GHz single mode DC-coupled NIR Photoreceiver | Newport | 1544-B | For converting light into electrical signal |
| Infiniium High-Performance Oscilloscope | Agilent | DSOX91604A | To save the light-converted electrical signals |
| HI1060 optical fiber | Corning | HI1060 | Optical fiber for time-stretch |
| YTTERBIUM DOPED FIBER AMPLIFIER | Keopsys | KPS-STD-BT-YFA-37-BO-SM-111-FA-FA | Optical in-line amplifier |
| Holographic grating | Wasatch Photonics | 020305-6 | Grating |
| Infuse/Withdraw Syringe Pumps | Harvard Apparatus | PHD 2000 | Syringe pump for sample loading in micro-fluidic channels |
References
- Lau, A. K. S., Wong, T. T. W., Shum, H. C., Wong, K. K. Y., Tsia, K. K. Imaging Flow Cytometry: Methods and Protocols. Barteneva, N. S., Vorobjev, I. A. , Springer New York. New York, NY. 23-45 (2016).
- Goda, K., Tsia, K. K., Jalali, B. Serial time-encoded amplified imaging for real-time observation of fast dynamic phenomena. Nature. 458 (7242), 1145-1149 (2009).
- Goda, K., Jalali, B. Dispersive Fourier transformation for fast continuous single-shot measurements. Nat Photon. 7 (2), 102-112 (2013).
- Lau, A. K., Shum, H. C., Wong, K. K., Tsia, K. K. Optofluidic time-stretch imaging - an emerging tool for high-throughput imaging flow cytometry. Lab Chip. 16 (10), 1743-1756 (2016).
- Lau, A. K. S., Tang, A. H. L., Xu, J., Wong, X. W., Y, K. K., Tsia, K. K. Optical Time Stretch for High-Speed and High-Throughput Imaging - From Single-Cell to Tissue-Wide Scales. IEEE J. Sel. Top. in Quant. Electron. 22 (4), (2016).
- Lei, C., Guo, B., Cheng, Z., Goda, K. Optical time-stretch imaging: Principles and applications. Appl Phys Rev. 3 (1), 011102 (2016).
- Lei, C., Guo, B., Cheng, Z., Goda, K. Optical time-stretch imaging: Principles and applications. Applied Physics Reviews. 3 (011102), (2016).
- Goda, K., et al. High-throughput single-microparticle imaging flow analyzer. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (29), 11630-11635 (2012).
- Goda, K., Solli, D. R., Tsia, K. K., Jalali, B. Theory of amplified dispersive Fourier transformation. Physical Review A. 80 (4), 043821 (2009).
- Goda, K., et al. High-throughput single-microparticle imaging flow analyzer. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (29), 11630-11635 (2012).
- Lai, Q. T. K., et al. High-throughput time-stretch imaging flow cytometry for multi-class classification of phytoplankton. Opt. Express. 24 (25), 28170-28184 (2016).
- Chen, C. L., et al. Deep Learning in Label-free Cell Classification. Sci Rep. 6, 21471 (2016).
- Fard, A. M., et al. Nomarski serial time-encoded amplified microscopy for high-speed contrast-enhanced imaging of transparent media. Biomed Opt Express. 2 (12), 3387-3392 (2011).
- Lau, A. K., et al. Interferometric time-stretch microscopy for ultrafast quantitative cellular and tissue imaging at 1 mum. J Biomed Opt. 19 (7), 76001 (2014).
- Mahjoubfar, A., Chen, C., Niazi, K. R., Rabizadeh, S., Jalali, B. Label-free high-throughput cell screening in flow. Biomed Opt Express. 4 (9), 1618-1625 (2013).
- Wong, T. T., et al. Asymmetric-detection time-stretch optical microscopy (ATOM) for ultrafast high-contrast cellular imaging in flow. Sci Rep. 4, 3656 (2014).
- Mata, T. M., Martins, A. A., Caetano, N. S. Microalgae for biodiesel production and other applications: A review. Renew Sustainable Energy Rev. 14 (1), 217-232 (2010).
- Irigoien, X., Huisman, J., Harris, R. P. Global biodiversity patterns of marine phytoplankton and zooplankton. Nature. 429 (6994), 863-867 (2004).
- Wei, X., et al. Coherent Laser Source for High Frame-Rate Optical Time-Stretch Microscopy at 1.0 µm. IEEE J. Sel. Top. Quantum Electron. 20 (5), 384-389 (2014).
- Wei, X., et al. Breathing laser as an inertia-free swept source for high-quality ultrafast optical bioimaging. Opt. Lett. 39 (23), 6593-6596 (2014).
- Xu, Y., Wei, X., Ren, Z., Wong, K. K. Y., Tsia, K. K. Ultrafast measurements of optical spectral coherence by single-shot time-stretch interferometry. Sci Rep. 6, 27937 (2016).
- Tsia, K. K., Goda, K., Capewell, D., Jalali, B. Performance of serial time-encoded amplified microscope. Opt. Express. 18 (10), 10016-10028 (2010).
- Alix-Panabières, C., Pantel, K. Challenges in circulating tumour cell research. Nat Rev Cancer. 14 (9), 623-631 (2014).
- Kling, J.
- Hodgkinson, C. L., et al. Tumorigenicity and genetic profiling of circulating tumor cells in small-cell lung cancer. Nat Med. 20 (8), 897-903 (2014).
- Ozkumur, E., et al. Inertial focusing for tumor antigen-dependent and -independent sorting of rare circulating tumor cells. Sci Transl Med. 5 (179), (2013).
- Hou, H. W., et al. Isolation and retrieval of circulating tumor cells using centrifugal forces. Scientific Reports. 3, 1259 (2013).
- Karabacak, N. M., et al. marker-free isolation of circulating tumor cells from blood samples. Nat. Protocols. 9 (3), 694-710 (2014).
- Krebs, M. G., et al. Molecular analysis of circulating tumour cells-biology and biomarkers. Nat Rev Clin Oncol. 11 (3), 129-144 (2014).
- Wu, J., et al. Ultrafast Laser-Scanning Time-Stretch Imaging at Visible Wavelengths. Light Sci Appl. , (2016).
