Este protocolo descreve um método para coletar fluido intersticial cardíaco a partir do coração de rato perfundido e isolado. Para separar fisicamente o transudado intersticial do perfusado de efluente venoso coronário, o coração perfundido de Langendorff é invertido e o transudado (fluido intersticial) formado na superfície cardíaca é coletado usando um tampão de látex macio.
O presente protocolo descreve uma abordagem única que permite a coleta de transudado cardíaco (TC) a partir do coração de rato isolado e com solução salina perfundida. Após o isolamento e a perfusão retrógrada do coração de acordo com a técnica de Langendorff, o coração é invertido em uma posição de cabeça para baixo e é mecanicamente estabilizado por um cateter de balão inserido no ventrículo esquerdo. Então, uma fina tampa de látex – previamente moldada para coincidir com o tamanho médio do coração do rato – é colocada sobre a superfície epicárdica. A saída da tampa de látex está conectada a tubos de silício, com a abertura distal 10 cm abaixo do nível de base do coração, criando leve sucção. O CT produzido continuamente na superfície epicárdica é coletado em frascos refrigerados com gelo para análise posterior. A taxa de formação de CT variou de 17 a 147 μL / min (n = 14) no coração de controle e infarto, o que representa 0,1-1% do perfusado de efluente venoso coronário. Análise proteômica e alto perfoA cromatografia líquida rmance (HPLC) revelou que a TC coletada contém um amplo espectro de proteínas e metabolitos purinérgicos.
A insuficiência cardíaca (HF) é a principal causa de morte em seres humanos em todo o mundo 1 . HF freqüentemente ocorre devido a miocardite, insetos isquêmicos ao miocárdio e remodelamento ventricular esquerdo, levando à deterioração progressiva da função contrátil cardíaca e da qualidade de vida dos pacientes. Embora os avanços em cardiologia e cirurgia cardíaca tenham diminuído notavelmente a mortalidade por insuficiência cardíaca, eles apenas servem como "retardantes" transitórios de um processo de doença inevitavelmente progressivo que traz morbidade significativa. Portanto, a atual falta de tratamento efetivo ressalta a necessidade de identificar novos alvos moleculares que podem prevenir ou mesmo reverter a HF. Isso inclui mudanças na matriz extracelular, resposta imune cardíaca não controlada e interações entre células cardíacas e não cardíacas 2 .
É importante reconhecer que o microambiente que as células cardíacas estão expostas à direçãoForja as respostas imunes e regenerativas do coração ferido. No coração isolado, perfumado com solução salina, a TC é gerada na superfície do coração sob a forma de pequenas gotículas derivadas do espaço fluídico intersticial ( ou seja, microambiente), tanto em condições fisiológicas quanto fisiopatológicas 3 , 4 , 5 . Portanto, a análise da TC ( ou seja, o fluido intersticial) pode ajudar a identificar fatores que regulam o metabolismo cardíaco e a função contrátil 6 ou influenciam as funções das células imunes após a migração para o coração ferido. Potencialmente, isso pode levar ao desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas para o tratamento da HF.
A coleção de CT de corações murinos é tecnicamente desafiadora. Em corações regulares de Langendorff, a coleção exclusiva de TC é difícil porque a mistura da TC com coronarO perfusor de efluente venoso dilata imprevisivelmente qualquer concentração de metabolitos / enzimas liberadas do espaço intersticial. Uma possível estratégia para superar esta limitação é excluir o efluente venoso por canulação do pulmão e simultaneamente ligando a veia pulmonar 7 . No entanto, esse método enfrenta dificuldades associadas à canulação e à ligação da artéria pulmonar e da veia, causando potencial vazamento de efluente venoso no transudado cardíaco. O conceito de usar um modelo de coração reverso foi introduzido pela primeira vez pelo grupo de Kammermeier, que inverteu o coração isolado e perfundido em uma posição de cabeça para baixo e colocou uma fina tampa de látex na superfície epicárdica para amostrar continuamente a TC sem a contaminação do efluente venoso 8 , 9 . Usando este procedimento, a CT mostrou fornecer uma medida muito sensível dos metabolitos liberados do coração 9 ,A transferência capilar de ácidos gordurosos 8 e partículas virais 10 .
Mais recentemente, fatores paracrinos que podem regular a resposta imune local e aumentar a angiogênese cardíaca 11 foram implicados nos efeitos benéficos da terapia com células-tronco para doenças cardíacas. A análise da TC no coração invertido pode ajudar a identificar quimicamente esses fatores paracrinos individuais. Além disso, a TC pode ajudar a identificar os fatores envolvidos na ativação in vivo de células imunes no coração.
A descrição detalhada da coleta de CT da superfície do coração, fornecida aqui, é experimentalmente útil para pesquisadores que estudam a interação de células imunes, fibroblastos, células endoteliais e cardiomiócitos em relação à função cardíaca geral. Como mencionado acima, o fluido intersticial carrega a informação para comunicação célula a célula dentro do coração, whQue pode ser convenientemente avaliado pela coleção de CT. A descrição técnica detalhada, incluindo um protocolo de vídeo de como coletar CT a partir do coração invertido, deve facilitar a aplicação futura desta técnica única.
O modelo de coração invertido baseia-se na técnica de perfusão de coração de Langendorff bem estabelecida 12 e é realizado simplesmente invando o coração para uma posição de cabeça para baixo e mantendo esta posição usando um cateter de balão intra-ventricular rígido. De forma tal, o transudato intersticial cardíaco pode ser fisicamente separado do perfusado de efluente venoso coronário, goteando pela gravidade da base do coração 9 . A TC pode ser colet…
The authors have nothing to disclose.
Este estudo foi financiado pela NSFC 81570244, FoKo 23/2013 e SFB 1116 / B01 e pelo Cardiovascular Research Institute de Düsseldorf (CARID).
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