本文介绍了一种从离体全海马组织中记录节律性神经元网络theta和gamma振荡的实验方案。我们详细描述了从海马提取到局部场电位、单细胞单位放电以及全细胞膜片钳记录的实验步骤，同时涵盖了theta节律的光遗传学调控方法。
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本文内容
摘要
摘要
本方案概述了制备和记录野生型及转基因小鼠离体全海马组织的实验步骤，以及近期在方法学和θ振荡研究应用方面的改进。本文介绍了一种简单的离体海马组织表征方法，通过该方法可同时研究海马内部θ振荡发生器之间的关系，以及齿状回-1区（CA1）和下托（SUB）区域锥体细胞与GABA能中间神经元的活动。总体而言，我们证明离体海马组织能够在体外（in vitro）产生内在的θ振荡，并且可通过光遗传学刺激小清蛋白阳性（PV）中间神经元，精确调控海马内产生的节律性活动。in vitro离体海马制备技术为同时进行场电位记录和全细胞膜片钳记录提供了独特的机会，结合视觉识别的神经元，有助于深入理解θ节律生成的潜在机制。
引言
海马θ振荡（4 - 12 Hz）是哺乳动物大脑中最显著的节律性活动形式之一，被认为在认知功能中发挥关键作用，例如时空信息的处理以及情景记忆的形成1,2,3. 尽管有几种 体内 强调theta调制的位置细胞与空间导航之间关系的研究、损毁研究以及临床证据均支持海马theta振荡参与记忆形成的观点4,5,6，与海马theta振荡产生相关的机制仍未完全阐明。早期 体内 研究表明，θ活动主要依赖于外在振荡器，特别是来自隔区和内嗅皮层等传入脑结构的节律性输入7,8,9,10内在因素的作用——即海马神经网络的内部连接性以及海马神经元的特性——也被推测可能参与其中，其依据来源于 体外 观察11,
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方案
所有操作均根据麦吉尔大学动物护理委员会和加拿大动物护理委员会批准的方案和指南进行。
1. 急性海马 体外 准备
注意：分离完整的海马组织包括三个主要步骤：（1）溶液与设备的准备，（2）海马的解剖分离，（3）建立快速灌流系统，以产生内在的θ节律振荡。在本实验方案中，从解剖到记录各步骤的时间控制尤为关键，因为分离的海马组织结构致密而脆弱，需维持其功能连接的完整性。 体外 需要格外谨慎。提前准备好所有物品，可尽早确保充分的灌注水平，从而最大限度地减少细胞损伤并维持生理功能。
- 基于蔗糖的人工脑脊液（aCSF）溶液
- 配制用于解剖及解剖后孵育的1X储存蔗糖溶液。将表1中列出的所有组分（除CaCl2外）加入1 L去离子水中，4 °C保存，最长可保存2周。
- 标准aCSF溶液
- 配制用于电生理记录期间对离体海马进行高流速灌注的标准aCSF。配制浓缩（5X）储存液aCSF时，将表2中列出的所有组分（除CaCl2外）溶解于2 L去离子水中，并于4 °C保存。
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结果
本部分展示了通过研究小鼠离体海马组织中θ振荡所能获得的结果示例 体外分离海马体的解剖操作步骤如图所示。 图1利用该制备方法，可在放置多个场电极的同时，检测离体海马不同区域和层次中神经元群体的整体活动及同步突触输入的内在theta振荡。图2). 以同时进行的全细胞膜片钳记录与细胞外记录的代表性结果，表征特定细胞类型在海马区自发θ振荡期间的放电特性与突触特性图3），以及在对节律性活动进行光遗传学操控期间（图 4).
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讨论
尽管对急性海马脑片进行电生理记录是一种标准的体外技术，但本文所介绍的方法与经典方法存在显著差异。与能够直接观察表面特定细胞层的薄切片制备不同，完整的海马制备更接近于体内结构，电极需穿过各个细胞层，逐步插入目标脑区。该方法在保留海马完整性的同时，也维持了局部神经元群体的功能连接性和生理特性，从而为研究海马中小规模和大规模神经网络振荡提供了一个复杂而有力的工具。例如，网络中预设的环路结构与特定细胞类型的特性共同作用，可自发产生内在的θ波和γ波节律性振荡，模拟了海马体内活动的重要特征。通过本实验方案所述方法，可快速从啮齿类动物脑中分离海马组织，并在快速灌流的人工脑脊液（aCSF）环境中维持数小时的活性。研究人员可直接应用基础电生理技术，探究特定神经元类型的同步活动和突触功能如何影响海马网络的动力学行为。
我们的实验程序首次提供了系统研究海马体全段隔颞（背腹）轴上局部场电位振荡动态特性的机会 in vitro（参见参考文献22,
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披露
作者声明不存在任何竞争性的商业或财务利益。
致谢
本工作由加拿大卫生研究院和自然科学研究院资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 试剂 | |||
| 氯化钠 | Sigma Aldrich | S9625 | |
| 蔗糖 | Sigma Aldrich | S9378 | |
| 碳酸氢钠 | Sigma Aldrich | S5761 | |
| NaH2PO4 - 磷酸二氢钠 | Sigma Aldrich | S8282 | |
| 硫酸镁 | Sigma Aldrich | M7506 | |
| 氯化钾 | Sigma Aldrich | P3911 | |
| D-(+)-葡萄糖 | Sigma Aldrich | G7528 | |
| 二水合氯化钙 | Sigma Aldrich | C5080 | |
| 抗坏血酸钠 | Sigma Aldrich | A7631-25G | |
| 名称 | 公司 | 目录编号 | 备注 |
| 设备 | |||
| 标准解剖剪刀 | Fisher Scientific | 08-951-25 | 脑组织提取 |
| 4号手术刀柄，14 cm | WPI | 500237 | 脑组织提取 |
| 平头直镊（11 cm） | WPI | 500456 | 脑组织提取 |
| Paragon 不锈钢手术刀片 #20 | Ultident | 02-90010-20 | 脑组织提取 |
| 精细弯头解剖剪刀 | Thermo Fisher Scientific | 711999 | 脑组织提取 |
| 聚四氟乙烯（PTFE）涂层薄刮刀 | VWR | 82027-534 | 海马组织制备 |
| Hayman 型微型刮刀 | Fisher Scientific | 21-401-25A | 海马组织制备 |
| 实验室小勺 | Fisher Scientific | 14-375-20 | 海马组织制备 |
| 硼硅酸盐玻璃巴斯德移液管 | Fisher Scientific | 13-678-20A | 海马组织制备 |
| 滴管 | Fisher Scientific | 海马组织制备 | |
| 单刃剃须刀片 | VWR | 55411-055 | 海马组织制备 |
| 镜头纸（4 x 6"） | VWR | 52846-001 | 海马组织制备 |
| 玻璃培养皿（100 x 20 mm） | VWR | 25354-080 | 海马组织制备 |
| 冰用塑料托盘；尺寸 30 x 20 x 5 cm | n.a. | n.a. | 海马组织制备 |
| 单通道串联溶液加热器 | Warner Instruments | SH-27B | 灌流系统 |
| 水族箱用曝气石 | n.a. | n.a. | 灌流系统 |
| Tygon E-3603 管（内径 1/16，外径 1/8） | Fisherbrand | 14-171-129 | 灌流系统 |
| 电热锅 | Black & Decker | n.a. | 灌流系统 |
| 95% O2/5% CO2 气体混合物（碳合气） | Vitalaire | SG466204A | 灌流系统 |
| 玻璃瓶/烧瓶（4 x 1 L） | n.a. | n.a. | 灌流系统 |
| 浸没式记录室 | 定制设计（FM） | n.a. | 可使用商用替代品 |
| 玻璃移液管（1.5/0.84 外径/内径（mm）） | WPI | 1B150F-4 | 电生理学 |
| Hum Bug 50/60 Hz 噪声消除器 | Quest Scientific | Q-Humbug | 电生理学 |
| Multiclamp 700B 膜片钳放大器 | Molecular devices | MULTICLAMP | 电生理学 |
| Multiclamp 700B Commander 程序 | Molecular devices | MULTICLAMP | 电生理学 |
| 数模转换器 | Molecular devices | DDI440 | 电生理学 |
| PCLAMP10 | Molecular devices | PCLAMP10 | 电生理学 |
| 防震台 | Newport | n.a. | 电生理学 |
| 显微操作器（手动） | Siskiyou | MX130 | 电生理学（LFP） |
| 显微操作器（自动） | Siskiyou | MC1000e | 电生理学（膜片钳） |
| 音频监测器 | A-M Systems | Model 3300 | 电生理学 |
| 微移液管/膜片钳移液管拉制仪 | Sutter | P-97 | 电生理学 |
| 定制直立式荧光显微镜 | Siskiyou | n.a. | 成像 |
| 模拟视频摄像机 | COHU | 4912-2000/0000 | 成像 |
| 带成像软件的数字图像采集卡 | EPIX, Inc | PIXCI-SV7 | 成像 |
| Olympus 2.5X 物镜 | Olympus | MPLFLN | 成像 |
| Olympus 40X 水浸物镜 | Olympus | UIS2 LUMPLFLN | 成像 |
| 定制LED光源系统 | 定制 | n.a. | 光遗传学刺激（Amhilon et al., 2015） |
| 名称 | 公司 | 目录编号 | 备注 |
| 动物 | |||
| PV::Cre (KI) 小鼠 | Jackson Laboratory | stock number 008069 | 允许 在PV中间神经元中进行Cre介导的基因表达 |
| 组成型-条件型 Ai9 小鼠（R26-lox-stop-lox-tdTomato (KI)） | Jackson Laboratory | stock number 007905 | 在Cre介导的重组后表达TdTomato |
| Ai32 小鼠（R26-lox-stop-lox-ChR2(H134R)-EYFP | Jackson Laboratory | stock number 012569 | 在Cre重组酶作用后表达改良的通道视紫红质-2/EYFP融合蛋白 |
| PVChY 小鼠 | 本实验室繁育 | n.a. | 通过将PV-Cre品系与Ai32小鼠（R26-lox-stop-lox-ChR2(H134R)-EYFP）杂交获得的后代 |
参考文献
- Buzsaki, G. Theta rhythm of navigation: link between path integration and landmark navigation, episodic and semantic memory. Hippocampus. 15 (7), 827-840 (2005).
- Sanders, H., Renno-Costa, C., Idiart, M., Lisman, J.
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