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Neuroscience

हिप्पोकैम्पल थीटा बैंड में ट्यूनिंग Published: August 2, 2017 doi: 10.3791/55851
Automatic Translation
1, 1
1Department of Psychiatry, Douglas Mental Health University Institute, McGill University

Summary

यहाँ, हम एक पृथक पूरे हिप्पोकैम्पल तैयारी से लयबद्ध न्यूरोनल नेटवर्क थीटा और गामा दोलन रिकॉर्ड करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। हम क्षेत्र, एकात्मक और पूरे सेल पैच क्लैंप रिकॉर्डिंग के साथ-साथ थीटा ताल के ऑप्टोजेनेटिक पेसिंग के विवरण के लिए हिप्पोकैम्पस की निकासी से प्रयोगात्मक कदम का वर्णन करते हैं।

Abstract

इस प्रोटोकॉल ने थलटा ओसीलेसमेंट के अध्ययन के तरीकों और अनुप्रयोगों में हालिया सुधारों के साथ-साथ, WT और ट्रांसजेनिक चूहों के पृथक पूरे हिप्पोकैम्पस से तैयार करने और रिकॉर्डिंग के लिए प्रक्रियाओं की रूपरेखा की है। पृथक हिप्पोकैम्पल तैयारी का एक सरल लक्षण वर्णन प्रस्तुत किया जाता है जिससे आंतरिक हिप्पोकैम्पल थीटा ऑसिलेटर्स के बीच संबंधों को पिरामिड कोशिकाओं की गतिविधि और कॉर्नो अम्मोनीस -1 (सीए 1) और सबिकुलम (उप) क्षेत्र के गैबर्जर इन्टरनेट्स के साथ जांच की जाती है। कुल मिलाकर, हम दिखाते हैं कि पृथक हिप्पोकैम्पस इन विट्रो में आंतरिक थिटा दोलन पैदा करने में सक्षम है और हिप्पोकैम्पस के भीतर उत्पन्न तालबद्धता को परवलबिमिन-पॉजिटिव (पीवी) इंटरन्युनोन के ऑप्टोजेनेटिक उत्तेजना से ठीक से हेरफेर किया जा सकता है। इन विट्रो पृथक हिप्पोकैम्पल तैयारी नेत्रहीन रूप से पहचाना नू से एक साथ क्षेत्र और इंट्रासेल्युल्युलर पैच-क्लैंप रिकॉर्डिंग का उपयोग करने का एक अनूठा अवसर प्रदान करता हैचूहों थेटा लय पीढ़ी के अंतर्निहित तंत्र को बेहतर ढंग से समझने के लिए।

Introduction

हिप्पोकैम्पल थीटा दोलन (4 - 12 हर्ट्ज) स्तनधारी मस्तिष्क में लयबद्ध गतिविधि के सबसे प्रमुख रूपों में से हैं और माना जाता है कि स्पाटियेटमॉम्रल सूचनाओं के प्रसंस्करण और प्रासंगिक यादों 1 , 2 , 3 के गठन के रूप में संज्ञानात्मक कार्यों में महत्वपूर्ण भूमिका निभाएं। जबकि विवो अध्ययन में कई लोग जो स्थानिक नेविगेशन और घाव के अध्ययन के साथ थीटा-मॉड्यूड प्लेस-कोशिकाओं के रिश्ते को उजागर करते हैं, साथ ही साथ नैदानिक ​​सबूत, हिप्पोकैम्पल थीटा दोलन स्मृति संरचना 4 , 5 , 6 में शामिल हैं , तंत्र से संबंधित हिप्पोकैम्पल थीटा दोलनों के उत्पादन के साथ अभी भी पूरी तरह से समझा नहीं जाता है। विवो जांच के शुरुआती दिनों में सुझाव दिया गया कि थीटा गतिविधि मुख्य रूप से बाहरी थरथरानियों पर निर्भर करती है, विशेष तालबद्ध इनपुट मेंसेप्टम और एंटोराहिनल कॉर्टेक्स 7 , 8 , 9 , 10 जैसे अभिरुचि मस्तिष्क संरचनाओं से। आंतरिक कारकों के लिए एक भूमिका - हिप्पोकैम्पल न्यूरॉन्स के गुणों के साथ हिप्पोकैम्पल न्यूरल नेटवर्क की आंतरिक कनेक्टिविटी - इन विट्रो टिप्पणियों 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 में आधारित थी । हालांकि, कुछ मील का पत्थर अध्ययन 1 9 , 20 , 21 के अलावा , विकासशील दृष्टिकोणों में कठिनाइयां जो इन विट्रो टुकड़ों की तैयारी में आसान में शारीरिक रूप से यथार्थवादी आबादी गतिविधियों को दोहरा सकते हैंलंबे समय तक, हिप्पोकैम्पस और संबंधित क्षेत्रों की आंतरिक क्षमताओं की अधिक विस्तृत प्रयोगात्मक परीक्षा में स्वयं-जनित थिटा दोलनों के लिए लंबित है।

इन विट्रो पतली-टुकड़ा प्रयोगात्मक सेटिंग में मानक के एक महत्वपूर्ण नकारात्मक पक्ष यह है कि मस्तिष्क संरचनाओं के 3 डी सेलुलर और अन्तर्ग्रथनी संगठन आमतौर पर समझौता कर रहे हैं। इसका मतलब है कि स्थानीय समूहों (≤ 1 मिमी त्रिज्या) से एक या अधिक मस्तिष्क क्षेत्रों (> 1 मिमी) में फैले न्यूरॉन्स की आबादी के लिए, विभाजित सेल असेंबलियों के आधार पर ठोस नेटवर्क गतिविधियों के कई रूप समर्थित नहीं हो सकते। इन विचारों को देखते हुए, अध्ययन करने के लिए एक अलग प्रकार के दृष्टिकोण की आवश्यकता थी कि कैसे थिओ ओसीलाइजेशन हिप्पोकैम्पस में उभरकर और संबंधित कॉर्टिकल और उप-आउटपुट आउटपुट संरचनाओं के बारे में फैलता है।

हाल के वर्षों में, द्विदिश आंतों की जांच करने के लिए "पूर्ण septo-hippocampal" तैयारी का प्रारंभिक विकासदो संरचनाओं के अनुच्छेद 22 , और "पृथक हिप्पोकैम्पस" तैयारी के आगामी उत्थान से पता चला है कि आंतरिक थिटा दोलन हिप्पोकैम्पस में सहज होते हैं जो बाहरी लयबद्ध इनपुट 23 की कमी होती है इन तरीकों का मूल्य प्रारंभिक अंतर्दृष्टि पर आधारित है कि इन क्षेत्रों की संपूर्ण कार्यात्मक संरचना इन विट्रो 22 में थीटा ताल जनरेटर के रूप में कार्य करने के लिए संरक्षित की जानी थी।

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Protocol

सभी प्रक्रियाएं मैकगिल यूनिवर्सिटी की पशु देखभाल समिति और कैनेडियन परिषद ऑन एनिमल केयर द्वारा अनुमोदित प्रोटोकॉल और दिशानिर्देशों के अनुसार की गई हैं।

1. विट्रो तैयारी में तीव्र हिप्पोकैम्पस

नोट: अक्षुण्ण हिप्पोकैम्पल तैयारी को अलग करने में तीन प्रमुख कदम शामिल हैं: (1) समाधान और उपकरण तैयार करना, (2) हिप्पोकैम्पस का विच्छेदन और (3) आंतरिक थिटे दोलनों के उत्पादन के लिए आवश्यक तेज प्रत्यारोपण दर प्रणाली की स्थापना करना। इस प्रोटोकॉल में, विच्छेदन से रिकॉर्डिंग के लिए समय-समय पर प्रदर्शन - विशेष रूप से महत्वपूर्ण है क्योंकि अलग-अलग हिप्पोकैम्पस ऐसे घने, लेकिन नाजुक, तैयारी के लिए तैयार है जो इन विट्रो में संरचना की कार्यात्मक कनेक्टिविटी को बनाए रखने के लिए महान देखभाल की आवश्यकता है। सब कुछ पहले से तैयार करना यह सुनिश्चित करता है कि सेल डी को कम करने के लिए जितना जल्दी हो सके छिड़काव का पर्याप्त स्तर उपलब्ध हैशौक और शारीरिक समारोह बनाए रखना

  1. सुक्रोज-आधारित कृत्रिम सेरेब्रल स्पाइनल फ्लूइड (एसीएसएफ) समाधान
    1. विच्छेदन और बाद के विच्छेदन ऊष्मायन के लिए इस्तेमाल होने वाले 1x स्टॉक सोक्रोस समाधान तैयार करें। 2 सप्ताह के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 CaCl के अलावा तालिका 1 में सूचीबद्ध सभी घटकों, कम्बाइन, विआयनीकृत जल, और स्टोर का 1 एल में।
  2. मानक aCSF समाधान
    1. इलैक्ट्रोफिजियोलॉजिकल रिकॉर्डिंग के दौरान पृथक हिप्पोकैम्पस के उच्च प्रवाह दर छिड़काव के लिए मानक एएसएसएफ तैयार करें। सांद्रित (5 एक्स) स्टॉक एएसएसएफ बनाने के लिए, 2 एलसीई 2 को छोड़कर तालिका 2 में सूचीबद्ध सभी घटकों, विआयनीकृत पानी के 2 एल और 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर को भंग कर दें।
  3. उपकरण तैयार करें
    1. विच्छेदन शुरू करने से पहले, एक बर्फ से भरे प्लास्टिक ट्रे (30 x 20 x 5 सेंटीमीटर) के साथ बेंच क्षेत्र की स्थापना करें, कार्बोज़ से जुड़े टयूबिंग लाइनें और thrई ग्लास पेट्री डिश (10 x 2 सेमी) ( चित्रा 1 देखें)।
    2. 500 एमएल बीकर के लिए 300 एमएल सुक्रोज़ समाधान (1 एक्स स्टॉक) को जोड़ें, कार्बोजेन के साथ बुलबुला करें (95% ओ 2 , 5% सीओ 2 ) और सीए 2+ [1.2 एमएम] जोड़ें।
    3. एक गिलास पेट्री डिश के लिए इस sucrose समाधान के 60 एमएल स्थानांतरण और कमरे के तापमान पर छोड़ दें। 10 के लिए शेष 4 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में रखें - 15 मिनट
    4. विच्छेदन के दौरान कार्बोजेन के साथ बर्फ-ठंडा सूक्रोज समाधान बबल।
    5. सुक्रोज़ समाधान (4 डिग्री सेल्सियस) के साथ दूसरा पेट्री डिश (ठंडे पकड़े हुए चैम्बर) भरें और बर्फ पर रखें।
    6. 50 एमएल बीकर में 30 मिलीलीटर बर्फ-ठंडा सूक्रोज समाधान जोड़ें।

2. पूरे हिप्पोकैम्पस विच्छेदन

नोट: अलग-थलग हिप्पोकैम्पस को विदारक बनाने की विधि मूल रूप से विकसित और वर्णित एक 22 के समान है, लेकिन अतिरिक्त विवरण और पे के संबंध में परिवर्तनों के साथरफूजन दर और रिकॉर्डिंग तकनीक

  1. मस्तिष्क विच्छेदन
    1. पिंजरे में जोड़ा जाता है Ioflurane (100%) के 1 एमएल के साथ भिगो एक छोटे कागज तौलिया के साथ एक धूआं हुड के तहत anesthetize माउस (पी 20 - 35)।
    2. संवेदनाहारी माउस को ठोकर दें और जल्दी से बर्फ-ठंडा सूक्रोज समाधान (50 एमएल बीकर, ~ 5 एस) में सिर को डुबो दें। एक कागज तौलिया पर स्थानांतरण
    3. एक औसत दर्जे का त्वचा चीरा बनाने के लिए एक स्केलपेल का प्रयोग करें (कपाल से द्विपक्षीय) और क्रेनरी को उजागर करने के लिए पक्षों पर त्वचा को दबाएं।
    4. एक छोटी सी कैंची के साथ खोपड़ी को काट लें और मस्तिष्क को तेजी से निकालने के लिए स्पैटुला का इस्तेमाल करें और पेट्री डिश में बर्फ-ठंडा सुक्रोज़ समाधान युक्त डाट करें। मस्तिष्क को ठंडा करने के लिए 1-2 मिनट की अनुमति दें।
    5. जबकि मस्तिष्क ठीक हो रहा है, एक लेंस पेपर पर 2 - 3 एमएल की सुक्रोज़ समाधान को बर्फ में डालकर पेट्री (विच्छेदन) पकवान मिला।
  2. हिप्पोकैम्पस को अलग करना
    1. एक ईमानदार स्थिति में विच्छेदन डिश पर मस्तिष्क रखेंएन।
    2. रेजर ब्लेड से सेरिबैलम और ललाट प्रांतस्था निकालें। मिक्सिगेटल विमान के साथ आधा मस्तिष्क को काट लें और दो पृथक गोलार्द्धों को होल्डिंग चैंबर में लौटें। वसूली के लिए आगे 1 से 2 मिनट की अनुमति दें
    3. विच्छेदन पकवान पर एक ही मस्तिष्क को सीधे रखें।
    4. पकवान को घुमाए रखें जब तक मिडीसिगिटल संरचनाएं निरीक्षक का सामना नहीं करती हैं और सेप्टल कॉम्प्लेक्स की एम्बेडेड रूपरेखा थैलेमस के ऊतक के पूर्वकाल की पतली नाशपाती की परत के रूप में दिखाई देती है।
    5. माइक्रो-स्पाट्यूला के साथ हेमी-पंक्चरित मस्तिष्क को स्थिर रखें और सेप्टल क्षेत्र के पीछे (कोडाल) के तुरंत बाद पॉलीटेट्राफ्लोरोइथाइलीन (पीटीएफई) -छोटे गए रंग के छोटे छोर को रखें।
    6. पोंछ के नीचे लेपित स्पॉटुला डालें और टिप नीचे तक विच्छेदन पकवान तक पहुंचा जाइए। तंतुओं को विभाजित करें जो कपटपूर्ण क्षेत्र को जोड़कर कौडी से जोड़ते हैं पट के पूर्वकाल किनारे पर उसी ऑपरेशन को दोहराएं और मस्तिष्क के सामने वाले हिस्से से कनेक्ट होने वाले फाइबर को काट लें।
    7. एक सीधे स्थिति में हिप्पोकैम्पस के ठीक ऊपर स्थित प्रांतस्था के अंदरूनी भाग को हल्के ढंग से पकड़कर, थैलमिक, हाइपोथैलेमिक और शेष मस्तिष्क स्टेम नाभिक को ध्यान से खींचने के लिए माइक्रोस्पॉटुला का उपयोग करें। कटौती करने के लिए स्पैटुला का उपयोग करें और दूर खींचा ऊतक को निकाल दें।
    8. पृथक गोलार्द्ध को अपने पक्ष में मुड़ें और हिप्पोकैम्पस की रूपरेखा की पहचान करें।
    9. पृष्ठीय हिप्पोकैम्पस के उल्लू के अंत के नीचे, पार्श्व वेंट्रिकल में लेपित स्पेटूला डालें।
    10. हेमी-संप्रदाय वाले मस्तिष्क के मिडसिगिटल विमान के साथ क्षैतिज रूप से गठबंधन वाले रंग को पकड़ो और इसे निलय दीवारों के चिकनी समोच्च के माध्यम से स्लाइड करें, जब तक कि टिप उखड नहीं उतरी हो।
    11. हिप्पोकैम्पस के नीचे स्पॉटुला को पकड़ो और हल्के ढंग से इसे कनेक्टिंग फाइबर पर अंदर की तरफ दबाकर रखें, जहां हिप्पोकैम्पस ओवरलाइन प्रांतस्था के साथ जुड़ जाता है। इस परत के बाहरी तरफ microspatula लागू करें और कनेक्टिंग फाई के माध्यम से टुकड़े टुकड़े करने के लिए लेपित स्पेस के खिलाफ स्लाइड करेंbers।
    12. निष्कर्षण को पूरा करने के लिए, विच्छेदन डिश को घुमाएं और ऊतक हिप्पोकैम्पस के नीचे लेपित स्पॉटुला डालें। स्पॉटुला के साथ कोर्टिक गुना के अंदर हल्के ढंग से पकड़ कर रखें और माइक्रोस्पाटूला के खिलाफ एक टुकड़े टुकड़े की गति का उपयोग करके इन्त्रोरिअल कनेक्शन के माध्यम से काट लें।
      नोट: सम्पूर्ण हिप्पोकैम्पस के तहत लेपित स्पैटुला को रखकर, और नीचे से शेष मस्तिष्क के ऊतकों को निकालने से पूरे सीपोटोपोकैम्पल कॉम्प्लेक्स को हटाया जा सकता है।
    13. एक बार अलगाव पूरा हो जाने पर, हिप्पोकैम्पस को डिश पर आराम कर रखें और इसे ठंडा रखने के लिए बर्फ-ठंडा सूक्रोज समाधान की एक बूंद जोड़ें। किसी भी शेष कॉर्टेक्स और फाइबर को सावधानी से ट्रिम करें और अलग-अलग हिस्सों से हिप्पोकैम्पस अलग-अलग रीन्नर के माध्यम से रेज़र ब्लेड लगाने से पट से अलग करें।
      नोट: यदि पैच क्लैंप रिकॉर्डिंग पिरामिड सेल से की जानी हैं (धारा 4.6 ऑप्टोगैनेटिक नियंत्रण देखें), अलग-थलग हिप्पोकैम्पस को सीए 1 की पिरामिडल परत का पर्दाफाश करने के लिए 45 डिग्री कोण पर काटा जा सकता है ("एंगलई-कट "तैयारी), हिप्पोकैम्पस के शेष हिस्से में स्थानीय नेटवर्क सर्किट के साथ समझौता किए बिना।
    14. कमरे के तापमान सूक्रोज समाधान की तैयारी को स्थानांतरित करें और रिकॉर्डिंग कक्ष को स्थानांतरित करने से पहले इसे 15 से 30 मिनट के लिए पुनर्प्राप्त करें।

3. पृथक हिप्पोकैम्पस रिकॉर्डिंग के लिए फास्ट इन्सुलेशन स्थापित करें

  1. 20 - 25 एमएल / मिनट में ऑक्सीजन युक्त एसीएसएफ की लगातार उच्च गति वाले इन्फ्लो को सक्षम करने के लिए गुरुत्व-फेड से छुटनी प्रणाली को स्थापित करें।
    1. एसीएसएफ (1 एक्स) फ्लास्क को अग्रिम में तैयार करें और प्रयोग शुरू होने से कम से कम 15 मिनट पहले वार्मिंग स्नान (~ 30 डिग्री सेल्सियस) में विसर्जित करें। इन-लाइन समाधान हीटर सिस्टम चालू करें (30 डिग्री सेल्सियस)।
    2. प्रयोग के दौरान एसीआरएसएफ ऑक्सीजन के लिए एक कार्बोजेन टैंक से जुड़े एक्वैरियम बॉबर्स और टयूबिंग लाइनों का उपयोग करें, और छिड़काव की शुरुआत से पहले CaCl 2 [2 mM] जोड़ें।
    3. एएसएसएफ के प्रवाह को रोकें और हिप्पोकैम्पस को विस्तृत रूप से रिकॉर्डिंग कक्ष में स्थानांतरित करेंग्लास विंदुक के अंत सोक्रोस संतृप्त तैयारी को सिंक करने और तल पर व्यवस्थित करने की अनुमति दें।
    4. सीए 1 की चिकनी सतह के साथ रिकॉर्डिंग चैम्बर (इनलेट-आउटलेट अक्ष के साथ लाइन में) के बीच में तैयारी रखें और शीर्ष पर स्थित करें सेप्टल और लौकिक extremities में छोटे वजन के साथ हिप्पोकैम्पस को स्थिर और aCSF प्रवाह को पुनरारंभ करें

4. पृथक हिप्पोकैम्पस में इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी

  1. इन विट्रो हिप्पोकैम्पल थीटा दोलनों में बाह्य रिकॉर्डिंग
    1. इन विट्रो पृथक हिप्पोकैम्पस से स्थानीय फील्ड क्षमता (एलएफपी) या सिंगल-यूनिट की बाहरी निगरानी के लिए, एसीएसएफ से भरे कांच माइक्रोप्रोपेटेस (1-3 एमयू) का उपयोग करें। कम-शोर एसी-युग्मित फ़ील्ड संभावित पैकेट क्लैंप एम्पलीफायर के साथ लाभ x1000, ऑनलाइन बैंड-पास फ़िल्टरिंग 0.1 - 500 हर्ट्ज और 5-20 किलोहर्ट्ज़ का नमूना दर।
      नोट: इस प्रोटोकॉल में प्रयुक्त कस्टम-निर्मित माइक्रोस्कोपहिप्पोकैम्पस के कम-आरेखण दृश्य के साथ-साथ अवरक्त वीडियो माइक्रोस्कोपी और एकल कोशिका मान्यता के लिए एफ़िफ़्लोरेसेंस के कम- (2.5 एक्स) और उच्च-बढ़ाई (40 एक्स) उद्देश्यों से लैस है। इस प्रणाली के घटकों में ईमानदार प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप, प्रतिदीप्ति फिल्टर क्यूब्स, एक एनालॉग वीडियो कैमरा और इमेजिंग सॉफ्टवेयर के साथ डिजिटल फ्रेम हड़धारक, एक ऑन-स्टेज कस्टम इरिफेसेशन चैंबर ( चित्रा 2 ए , इनसेट आई) और न्यूरॉनल रिकॉर्डिंग के लिए उच्च-सटीक माइक्रोमैनिपुलर्स शामिल हैं। ऑप्टिक फाइबर प्लेसमेंट
    2. खुर्दबीन पर लगाए गए कैमरे का उपयोग करें और कम विस्तार (2.5x) के तहत हिप्पोकैम्पल तैयारी का निरीक्षण करने के लिए कंप्यूटर प्रदर्शन से जुड़ा हुआ है और तेजी से जांच लें कि बाहरी सतह पर कोई अंडरकट या क्षति नहीं है। सीए 1 की चिकनी सतह के साथ एल्वस फाइबर के तिरछे उन्मुख व्यवस्था दिखाई देनी चाहिए ( चित्रा 2 ए , इनसेट ii) जब हिप्पोकैम के माध्यम से संचरित प्रकाश चमकता होमवाद।
    3. पृथक हिप्पोकैम्पस को देखने और विशिष्ट रिकॉर्डिंग स्थानों में एलएफपी इलेक्ट्रोड की नियुक्ति देखने के लिए कम-बढ़ाई व्यापक-क्षेत्र उद्देश्य का उपयोग करें।
      नोट: पृथक हिप्पोकैम्पल तैयारी के एक लेआउट, विभिन्न रिकॉर्डिंग स्थानों में रखे गए कई इलेक्ट्रोड के साथ चित्रा 2 ए में दिखाया गया है।
    4. स्नान में एलएफ़पी इलेक्ट्रोड कम करें जब तक कि यह सीए 1 क्षेत्र की सतह (एल्विस) को छू लेता है।
      नोट: यह आम तौर पर एसी-युग्मित रिकॉर्डिंग में तेजी से क्षणिक पैदा करता है जैसे कि रिकॉर्डिंग मीडिया के साथ इलेक्ट्रोड के संपर्क में आने पर क्या होता है। इस चरण के बाद एलएफपी चैनल सिग्नल सुनने के लिए एक ऑडियो मॉनिटर उपयोगी हो सकता है।
      नोट: बार-बार, गतिविधि के प्रारंभिक लक्षण केवल 10-15 मिनट के बाद दिखाई देंगे, इसलिए तैयारी में जल्दी से आगे नहीं बढ़ाना महत्वपूर्ण है। यदि इस अवधि के बाद की सतह एलएफपी इलेक्ट्रोड अभी भी गतिविधि नहीं उठा रही है, तो आगे की कक्षाओं के माध्यम से थोड़ा और आगे बढ़ेंऔर समय-समय पर रोकें यह देखने के लिए कि प्राथमिक कोशिका परत पर पहुंचने के दौरान किसी भी प्रकार की गतिविधि उत्पन्न होती है या नहीं। अगर 5 से 10 मिनट के बाद कुछ भी पता नहीं चला तो ध्यान से इलेक्ट्रोड को वापस ले लें और उसी क्षेत्र के साथ कहीं और जगह दें।
    5. पिरामिडल परत के माध्यम से एलएफपी इलेक्ट्रोड को अग्रिम करें। ध्यान दें कि बाहरी स्पाइकिंग गतिविधि शुरू में व्यक्तिगत न्यूरॉन्स (ज्यादातर पिरामिड और निरोधात्मक टोकरी कोशिकाओं) से एकल-इकाई निर्वहन का पता चला है। आगे इलेक्ट्रोड को कम करें और ध्यान दें कि स्पिकिंग फिर से फीका शुरू हो जाती है क्योंकि टिप रेडिएटम में पार हो जाती है। ध्यान दें कि थीटा-फ़्रिक्वेंसी रेंज (4-12 हर्ट्ज) में स्पष्ट रूप से दिखाई देने वाले नेटवर्क दोलन स्पष्ट हो जाता है और अधिकतम आयाम (~ 100-300 μV) तक पहुंच जाता है क्योंकि रिकॉर्डिंग स्थान रेडिएटम के माध्यम से कम हो जाता है।
  2. एक क्षेत्र भर में थीटा दोलन
    1. सीए 1 क्षेत्र में सहज थिओ दोलनों के स्थानिक गुणों का परीक्षण करने के लिए, टिप ओ को रखेंएफई के संदर्भ में एक औसत दर्जे का सीए 1 साइट में एलएफपी इलेक्ट्रोड (मध्यकाल में अनुदैर्ध्य सेप्टो-अस्थायी धुरी के साथ स्थित) और इसे पहले वर्णित अनुसार रेडिएटम में कम किया गया था।
    2. सीए 1 साइट में एक दूसरा एलएफपी इलेक्ट्रोड रखें (200 से 800 माइक्रोन सेप्टल या पहले एलएफपी से लौकिक) और निरीक्षण करें कि सीए 1 थिटा ओएसिसिलेशन्स अपेक्षाकृत बड़ी दूरी पर सिंक्रनाइज़ कर सकते हैं।
  3. परतों में थीटा दोलन
    1. हिप्पोकैम्पल परतों में थीटा दोलनों के गुणों का परीक्षण करने के लिए, एक सीए 1 रेडियटम साइट में संदर्भ एलएफपी इलेक्ट्रोड छोड़ दें। स्ट्रैटम ऑरिएंन्स के ठीक ऊपर से शुरू होने से, पिरामिड सेल परत में एक दूसरे इलेक्ट्रोड को कम और रेडिएटम के माध्यम से। पिरामिडल परत में एलएफपी सिग्नल (सापेक्ष चरण रिवर्सल) के क्रमिक उलटाव का निरीक्षण करें।
      नोट: इस प्रकार की गतिविधि के प्रतिनिधि उदाहरणों के लिए, चित्रा 2 बी देखें लामिना / गहराई प्रोफाइल और वर्तमान स्रोत घनत्व (सीएसडी) के विश्लेषण के उदाहरणअलग-अलग हिप्पोकैम्प में चरण उलटा होने की साइट को दर्शाता है 23 , 24 , 25 से पहले प्रकाशित किया गया है।
  4. अक्षत हिप्पोकैम्पस में गामा दोलन और थीटा-गामा युग्मन
    1. CA1 / SUB सीमा पर फ़ील्ड इलेक्ट्रोड रखें और जब तक यह पिरामिडल और आणविक परतों के बीच इंटरफ़ेस पर बैठे तब तक इसे कम न करें। इस स्तर पर, एक क्षेत्र संभावित स्पष्ट गामा दोलनों परिवर्तन के साथ आयाम में स्थानीय थीटा ताल पर कि चरण-लॉक प्रदर्शित 24 दर्ज किया जा सकता। थीटा-गामा युग्मन के धीमे समय के स्तर को देखने के लिए स्केलिंग समायोजित करें। ध्यान दें कि गामा फट दो विशिष्ट आवृत्ति बैंड में होते हैं, जो बैंड-पास द्वारा धीमा (25 - 50 हर्ट्ज) और तेज गामा (150-250 हर्ट्ज) रेंज में चल रहे एलएफपी सिग्नल को छानने के द्वारा दिखाया जा सकता है (प्रतिनिधि फ़िल्टर्ड के लिए चित्र 2C देखें) निशान)।
  5. इन विट्रो हिप्पोकैम्पल थीटा दोलनों के दौरान पूरे सेल पैच क्लैंप रिकॉर्डिंग
    नोट: प्रोटोकॉल के इस भाग में, लक्ष्य पीवी प्रमोटर के नियंत्रण में फ्लोरोसेंट प्रोटीन, टीडीटाटोमो को व्यक्त ट्रांसजेनिक पीवी-टॉम चूहों से पृथक हिप्पोकैम्बी में पहचानी गई इन्टर्यूनों से नेत्रहीन निर्देशित पूरे सेल पैच क्लैंप रिकॉर्डिंग प्राप्त करना है (के लिए अधिक विवरण सामग्री और रेफरी 26 देखें )।
    1. पीवी-टॉम माउस ( चित्रा 3 ) से एक हिप्पोकैम्पल तैयारी की सतह के पास स्थित टीडीटैमेटो-पॉजिटिव इन्टरूरोनन्स को देखने के लिए कम (2.5 एक्स) और हाई पावर (40 एक्स) बढ़ाई वाली प्रतिदीप्ति वीडियो-माइक्रोस्कोपी का उपयोग करें। ध्यान दें कि पीवी-टॉम न्यूरॉन्स को एल्वस (100 माइक्रोन तक) के माध्यम से पैच के लिए सफलतापूर्वक विज़ुअलाइज़ किया गया और लक्षित किया जा सकता है, जबकि गैर-फ्लोरोसेंट पिरामिड कोशिकाओं को अपेक्षाकृत आसानी से पहुंचा जा सकता है जब हिप्पोकैम्पस को कोण-कट तकनीक के साथ तैयार किया जाता है (देखें धारा 2.2.14 नोट)।
    2. हिप्पोकैम्पस के निम्न बढ़ाई दृश्य के तहत, पैच क्लैंप प्रयोगों की तैयारी करते समय सीए 1 / एसयूबी में थिओ ओसीलेसमेंट्स मॉनिटर करने के लिए एलएफपी इलेक्ट्रोड रखें।
    3. 40X बढ़ाई पर जाएं और लक्ष्य क्षेत्र पर उद्देश्य को विसर्जित करें; ऊपर की परतें दिखाई देने तक इसे कम करें विपरीत दिशा से पैच विंदुक दृष्टिकोण के लिए पर्याप्त खुली पहुंच सुनिश्चित करने के लिए सूक्ष्मदर्शी की स्थिति में हेरफेर करें।
    4. प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के तहत, एक फ्लोरोसेंट पीवी-टॉम सेल का चयन करें और इसे मानक इंट्रासेल्युलर समाधान से भरा पैच विंदुक (2-3 एमयू) के साथ देखें।
    5. पिपेट को हल्का सकारात्मक दबाव लागू करने के लिए मुंह का टुकड़ा का प्रयोग करें और प्रतिरोध को मॉनिटर करें क्योंकि इलेक्ट्रोड को सेल पर कम किया जाता है। जब टिप लक्ष्य कोशिका का सामना करता है, तो विंदुक प्रतिरोध बढ़ जाता है और झिल्ली पर धनात्मक दबाव धराशायी होता है। दबाव जारी करें और जांचें कि मौजूदा पल्स के रूप में मुहर के रूप में सील शुरू होता है। तुरंत सीएलएक हाइपरपरॉलराइज्ड क्षमता (-70 एमवी) के लिए एम्प, और एक बार जीई सील प्राप्त हो जाने पर, पिपेट धारक के माध्यम से लागू की जाने वाली छोटी मात्रा में नकारात्मक दबाव के साथ सेल झिल्ली का टूटना।
    6. एक बार पूरे सेल कॉन्फिगरेशन में, सहज हिप्पोकैम्पल दोलन ( चित्रा 3 बी ) के दौरान पहचाने गए पीवी सेल के शारीरिक गुणों की जांच करें।
    7. ध्यान रखें कि पीवी कोशिकाओं से इंट्रासेल्युलर झिल्ली की संभावित रिकॉर्डिंग तेज-स्पिकिंग व्यवहार और चल रही सीए 1 / एसयूएच थिटा ताल से सिंक्रनाइज़ किए जाने वाले एक्शन पॉजिटिव के फटने से होती है।
    8. वोल्टेज-क्लैंप पर स्विच करें और आंतरिक लयबद्ध गतिविधि द्वारा उत्पन्न उत्तेजक बनाम अवरोधी अन्तर्ग्रथनी धाराओं के अनुपात को चिह्नित करने के लिए अलग-अलग झिल्ली क्षमता पर सेल को पकड़ो। पिरामिड सेल से पैच दबाना रिकॉर्डिंग का एक उदाहरण चित्रा 3 ए में तुलना के लिए दिखाया गया है।
  6. पृथक हिप्पोकैम्पस में ऑप्टोगैनेटिक नियंत्रण नोट: हिप्पोकैम्पल नेटवर्क गतिविधि के ऑप्टोजेनेटिक नियंत्रण के लिए, पीवी युक्त गैबार्जिक कोशिकाओं के लयबद्ध सक्रियण को शामिल करने वाली एक सेल-प्रकार की विशिष्ट रणनीति यहां उपयोग की जाती है क्योंकि इन कोशिकाओं को पृथक हिप्पोकैम्पस 25 में प्रमुख सेल आबादी को सिंक्रनाइज़ करने में एक प्रमुख भूमिका निभाई गई थी। पीवी कोशिकाओं में उत्तेजक चैनलरहादोपसिन -2 (सीआरआर 2) की चयनात्मक अभिव्यक्ति पीवी-क्री माउस लाइन को चूहों के साथ सीआरआर 2 क्र-निर्भरता (एआई 32) को व्यक्त करके हासिल की जाती है, जिससे पीवी-च्य चयना पैदा होती है। वैकल्पिक रूप से, सीए 1 / एसयूबी इंटरन्युनों में उत्तेजक ऑप्सिन की अभिव्यक्ति को चलाने के लिए वायरल वेक्टर निर्माण ( जैसे एएवीडीजे-चेटा-ईआईएफपी) पीवी-क्री या पीवी-टीएम चूहों (पी 15-16) के हिप्पोकैम्पस में लगाया जा सकता है ( चित्रा 4 ए )।
    नोट: इस रणनीति को पहले 25 बता दिया गया है।
    1. सीए 1 / एसयूबी क्षेत्र में एलएफपी इलेक्ट्रोड रखें और पृथक हिप्पोक में पास के पिरामिड सेल को पैच करें।पीयू इंटरन्यॉन में नीले-हल्के संवेदनशील उत्तेजक ऑप्शन चआर 2 को व्यक्त करने वाले एक माउस का एपस।
    2. हिप्पोकैम्पल तैयारी के ऊपर एक ऑप्टिक फाइबर प्रकाश गाइड (0.2 - 1 मिमी व्यास) रखें और इसे दर्ज किए गए क्षेत्र पर केन्द्रित करें। ऑप्टटाईजेनेटिक उत्तेजना के लिए एक एलईडी स्रोत से नीले प्रकाश (473 एनएम) का प्रयोग करें, जिसमें प्रकाश दालों (10-20 एमएस, ट्रांजिस्टर ट्रांजिस्टर लॉजिक सिग्नल द्वारा ट्रिगर) या सीना वेव वोल्टेज कमांड जो थीटा आवृत्तियों (4-12 हर्ट्ज) में वितरित किए गए हैं।
      नोट: कस्टम एलईडी-आधारित प्रकाश उत्तेजना विधानसभा को कहीं और 25 का वर्णन किया गया है।
    3. वर्तमान दबाना पर स्विच करें और सहजता वाले थिओ दोलन के दौरान पिरामिड की गतिविधि को चिह्नित करें।
    4. उत्तेजना प्रोटोकॉल शुरू करें और प्रकाश प्रतिक्रियाओं को रिकॉर्ड करें। दर्ज करें न्यूरॉन में क्षेत्रीय दोलन और अन्तर्ग्रथनी गतिविधि ऑप्टोगैनीक उत्तेजना के दौरान तेजी से सिंक्रनाइज़ हो जाती हैं और पीवी कोशिकाओं के लयबद्ध पेसिंग परिणाम दोनों के एक मजबूत नियंत्रण में होते हैंएन्सी और थिटा दोलनों की शक्ति ( चित्रा 4 )।

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Representative Results

यह खंड उन उदाहरणों के उदाहरणों को दर्शाता है जो इन विट्रो में पृथक हिप्पोकैम्पल तैयारी में थिटा ओसीलेलेशन का अध्ययन करके प्राप्त किया जा सकता है। पृथक हिप्पोकैम्पस निकालने की विच्छेदन प्रक्रिया चित्रा 1 में सचित्र है। इस तैयारी का उपयोग करते हुए, आंतरिक थिटा दोलन विभिन्न क्षेत्रों के इलेक्ट्रोड के प्लेसमेंट के दौरान, समग्र गतिविधि को रिकॉर्ड करने और पृथक हिप्पोकैम्पस ( चित्रा 2 ) के विभिन्न क्षेत्रों और परतों में न्यूरोनल आबादी के लिए सिंक्रनाइज़ किए गए अन्तर्ग्रथनी आदानों के दौरान जांच की जा सकती है। एक साथ पूरे सेल पैच दबाना और बाह्य रिकॉर्डिंग से प्रतिनिधि परिणाम, सहज हिप्पोकैम्प थिटा दोलन ( चित्रा 3 ) के दौरान, विशेष रूप से सेल प्रकार के विशिष्ट प्रकार के फायरिंग और अन्तर्ग्रथनी गुणों को चिह्नित करने के लिए प्रस्तुत किये जाते हैं, साथ ही तालबद्ध गतिविधि के ऑप्टोगैनेटिक हेरफेर के दौरान भीG "> चित्रा 4)।

आकृति 1
चित्रा 1: पृथक बरकरार हिप्पोकैम्पस तैयारी के लिए विच्छेदन प्रक्रिया।
( ए ) विच्छेदन सेटअप का सामान्य दृश्य शीर्ष सही: कार्बोनेजेटेड बर्फ-ठंडा सुक्रोज़ समाधान फ्लास्क (1); नीचे बायें: बर्फ से भरी हुई प्लास्टिक ट्रे (2) लेंस पेपर (3) से युक्त विच्छेदन डिश धारण; शक्कर युक्त चैम्बर जिसमें सूक्रोज समाधान (4) होता है; और सर्जिकल उपकरण का एक सेट (5)। ( बी ) विच्छेदन डिश पर हेमिसक्शन से पहले माउस के दिमाग का दृश्य। ( सी ) पर्णिका के नीचे लेपित स्पेटूला के छोटे से छोर को सम्मिलित करने से पहले ठंडे पकड़े हुए चैम्बर में हिमाच्छेदित मस्तिष्क की पुनर्प्राप्ति और बाएं मस्तिष्क गोलार्ध के ज़ूम इन व्यू (इनसेट) ( डी ) सीए 1 / उप क्षेत्र के साथ अलग-अलग मस्तिष्क के साथ पृथक हिप्पोकैम्पस के नीचे रखा गया लेपित स्पेटूलाऊतक नीचे से बाहर खींच लिया है इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्र 2
चित्रा 2: जलमग्न रिकॉर्डिंग चैंबर में इंटैक्ट हिप्पोकैम्पल तैयारी से इन विट्रो थेटा ऑस्लीलेशन में रिकॉर्डिंग के लिए सेटअप की कॉन्फ़िगरेशन
( ए ) पृथक हिप्पोकैम्पस को हिप्पोकैम्पल क्षेत्रों के एक लेआउट के साथ दिखाया गया है और कई अलग-अलग इलेक्ट्रोड को चार अलग-अलग रिकॉर्डिंग साइट्स में रखा गया है, जो सेप्टोटेमोरॉर्ली (सफेद तारांकनों द्वारा इंगित) वितरित किया गया था। उपरोक्त दिखाए गए रिकार्डिंग चैंबर प्लेटफॉर्म को देखते हुए, फास्ट-पेर्फ़्युजन फ्लो के लिए इनलेट और आउटलेट संख्या (1, 2) से दर्शाए गए हैं। नीचे दिखाए गए हिप्पोकैम्पस की बढ़ी हुई छवि (इनसेट ii) में, एक इलेक्ट्रोड मध्य में रखा जाता हैसिपेटोटेम्पोरल सीए 1 और एल्व्यू के फाइबर आसानी से दिखाई देते हैं, उपरिकुम की तरफ चल रहे हैं। एस: सेप्टल, टी: लौकिक, एफ / एफएक्स: फेम्ब्रिआ-फोर्निक्स ( बी ) प्रतिनिधि एलएफपी निशान के साथ सीए 1 परतों के संगठन के योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व स्ट्रैटम ऑरियंस (ग्रे) और स्ट्रैटम रेडियटम (काला) से एक साथ दर्ज किए गए हैं। दो परतों के बीच के संकेतों के उल्टे चरण को नोट करें Alv: स्ट्रेटम एलेवस, पीआर: स्ट्रेटम पिरामिडेल, एसआर: स्टेरैटम रेडिएटम। एसएलएम: स्ट्रैटम लेकुनोसम अणिकारी ( सी ) उदाहरण एलएफपी सीए 1 / एसयूबी क्षेत्र (20 सेकंड सेगमेंट) और 2 सेकंड विस्तारित सेगमेंट (नीचे) से अनफ़िल्टर्ड सिग्नल से दर्ज उत्कंठित थीटा दोलन दिखा रहा है; थिटा फ्रीक्वेंसी के लिए बैंड-पास फ़िल्टर (0.5 - 12 हर्ट्ज); धीमा गामा (25 - 55 हर्ट्ज); और तेज गामा (125-250 हर्ट्ज)। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें


चित्रा 3: एक पीवी-टॉम माउस से इंटैक्ट हिप्पोकैम्पल तैयारी के दौरान सहज-थिआ थिस्टा ऑसिलिलेशन के दौरान पिरामिड सेल और पीवी इंटरन्योनन की सेल-प्रकार की विशिष्ट गतिविधि
( ए ) थीटा दोलनों के दौरान एक पिरामिड सेल से दर्ज सिनैप्टिक गतिविधि। वर्तमान क्लैंप निशान (बाएं पैनल) सहज, लेकिन आराम से लयबद्ध फायरिंग नहीं दिखाते हैं, और निरोधक पोस्टअन्तैप्टीक क्षमता (आईपीएसएस) जो स्पष्ट रूप से धीरे-धीरे उभरते एलएफपी दोलन के साथ सिंक्रनाइज़ नहीं किए गए थे। वोल्ट-क्लैंप रिकॉर्डिंग (दाएं पैनल) से पता चलता है कि संगत अवरोधी पोस्टअन्सेप्टिक धाराओं (आईपीसीसी) के पास लगभग -70 एमवी प्रतिवर्ती क्षमता है। ( बी ) थीटा दोलनों के दौरान तेज गति से फ्लोरोसेंट पीवी इंटरयूरन से दर्ज की गई सिनैप्टिक गतिविधि। वर्तमान-दबाना (बाएं) में, यह कक्ष अनायास आराम से फायरिंग था और जोरदार लयबद्ध उत्तेजक पोताएसएससीएनएप्टिक क्षमता (ईपीएसपी) जो स्थिर एलएफपी दोलन के साथ चरण-लॉक थे वोल्टेज-दबाना रिकॉर्डिंग (दाएं) में, उत्तेजक पोस्टअन्तर्ग्रथनी वर्तमान रिवर्सल क्षमता लगभग 0 एमवी थी। शीर्ष पर योजनाबद्ध चित्र CA1 / SUB और रिकॉर्ड किए गए पिरामिड सेल और फ्लोरोसेंट पीवी इंटरयूरॉन की ऊंची (40 एक्स) बढ़ाई गई छवियों में पैच और फील्ड इलेक्ट्रोड की नियुक्ति के साथ प्रयोगात्मक सेटअप को दिखाते हैं। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्रा 4
चित्रा 4: एकल सीए 1 / एसआईबी पिरामिडल और पीवी न्यूरॉन्स से पृथक हिप्पोकैम्पस में सहज और ऑप्टोगैनेटिकली-संचालित थिटा ऑस्सीलेशन के दौरान स्थानीय क्षेत्र संभावित और एक साथ पैच क्लैंप रिकॉर्डिंग।
( ए बी ) एक पिरामिड न्यूरॉन का लक्षण दिखाते हुए दर्ज किए गए सेल (नीचे) की विशिष्ट नियमित-स्पिकिंग (आरएस) गुण (शीर्ष) और उच्च बढ़ाई (40 एक्स) छवि दिखाती है। ( सी ) एलओपीपी सिग्नल (ग्रे) के साथ विप्रोर्लाइज्ड झिल्ली क्षमता (काला) पर एक ही सेल का नमूना वर्तमान-दबाना रिकॉर्डिंग और सहज-दोलन (बाएं) के दौरान और थिटे-फ़्रिक्वेंसी (6 हर्ट्ज) प्रकाश उत्तेजना के दौरान सिंक्रोनाइज तालबद्ध आईपीएसपी ( सही)। प्रकाश उत्तेजना (नीली छायांकन) का पैटर्न वोल्टेज निशान के ऊपर दर्शाया गया है। ( डी ) एक 6 हर्ट्ज प्रकाश सिमुलेशन (बेसलाइन, उत्तेजित, पोस्ट) के पहले और बाद में एलएफपी तरंग के स्पेक्ट्रोमोग्राफ और शक्ति स्पेक्ट्रा। ( ई ) कम बढ़ाई उज्ज्वल क्षेत्र और अलग-अलग प्रतिदीप्ति छवियाँएड हिप्पोकैम्पल तैयारी सीए 1 / एसयूबी क्षेत्र में स्थानीय स्तर पर ईआईएफपी प्रतिदीप्ति (हरे रंग में) दिखाती है। ( एफ ) एक मौजूदा पीवी-टॉम इंटर्न्यूरन (नीचे 40 एक्स फ्लोरोसेंस छवि) के फास्ट-स्पिकिंग (एफएस) व्यवहार दिखा रहा है। ( जी ) झिल्ली संभावित रिकॉर्डिंग बड़े EPSPs और रिकॉर्ड किए गए पीवी सेल के लयबद्ध फायरिंग को स्वस्थ क्षेत्र दोलन (बाएं) के दौरान एलएफपी सिग्नल के साथ सिंक्रनाइज़ करता है और 3 हर्ट्ज पर प्रकाश उत्तेजना (दाएं) के दौरान। ( एच ) सीए 1 / एसयूपी एलएफपी सिग्नल पर पीवी सेल स्पाइक्स के फ़ील्ड ट्रिगरेड औसत (एफटीए)। एकाधिक परीक्षणों (एलएफपी चोटियों पर केन्द्रित) पर पीवी सेल का निर्वहन, स्वस्फूर्त दोलन (बेसलाइन) के दौरान दर्ज किए गए स्पाइक्स और प्रकाश उत्तेजना (उत्तेजित) के दौरान एफटीए में परिवर्तित हो गया। मध्य और निम्न ग्राफ़ स्पाइक्स और स्पाइक संभावना हिस्टोग्राम के रेखापुंज भूखंड दिखाते हैं (औसत संभावना लाल रंग में दिखायी जाती है) सबसे ऊपर के ग्राफ औसत एलएफपी सिग्नल के भूखंड दिखाते हैं जो लीग के दौरान बिजली में बढ़ता हैपीवी सेल के अत्यधिक सिंक्रनाइज़ किए गए फायरिंग के साथ समानांतर में एचटी उत्तेजना चरण-एलएफपी दोलन के शिखर पर बंद हुआ। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

एसोसिएटेड हिपपोकाम्पस के लिए SUCROSE समाधान (1 एक्स)
(शेयर समाधान)
यौगिक मेगावाट अंतिम संयोग (मिमी) 1 एल (जी) के लिए राशि
सुक्रोज 342.3 252 86.26 जी
नाहको 3 84.01 24 2.020 ग्राम
शर्करा 180.2 10
KCl 74.55 3 0.223 ग्राम
एमजीएसओ 4 120.4 2 0.241 ग्राम
नहे 2 पीओ 4 120 1.25 0.150 ग्राम
CaCl 2 .2 एच 2 ओ [1 एम] स्टॉक 147 1.2 120 μL / 0.1 एल *
* 0.3 एल ऑक्सीजन युक्त सुक्रोज़ समाधान के लिए 360 μL CaCl 2 [1 M] जोड़ें
पीएच = 7.4 ऑक्सीजन युक्त, ओएसएम 310-320

तालिका एक।

धारणा के लिए मानक एसीएसएफ समाधान (5 एक्स)
(शेयर समाधान)
यौगिक मेगावाट अंतिम संयोग (मिमी) 2 एल 5 एक्स की राशि
सोडियम क्लोराइड 58.44 126 73.6
नाहको 3 84.01 24 20.2
शर्करा 180.2 10 18
KCl 74.55 ♦ 4.5 3.355
एमजीएसओ 4 120.4 2 2.41
नहे 2 पीओ 4 120 1.25 1.5
एस्कोर्बेट 176.1 0.4 0.705
CaCl 2 .2 एच 2 ओ [1 एम] स्टॉक 147 2 2 एमएल / एल *
* 1 एल एसीएसएफ (1 एक्स) ऑक्सीजन युक्त समाधान के लिए 2 एमएल CaCl 2 [1 M] जोड़ें
पीएच = 7.4 ऑक्सीजन युक्त, ओएसएम 310-320
♦ हिप्पोकैम्पल नेटवर्क की उत्तेजना बढ़ाने के लिए एटीसीएफ़ समाधान (सामान्य एसीएसएफ 2.5 मि.मी. के.के.एल. की तुलना में) के लिए थोड़ी ऊंचा [के + ] ओ का उपयोग किया जाता है और थिटा दोलन के उद्भव की सुविधा प्रदान करता है।

सारणी 2।

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Discussion

जबकि तीव्र हिप्पोकैम्पल स्लाइस से इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल रिकॉर्डिंग इन विट्रो तकनीक में एक मानक हैं, यहां प्रस्तुत विधियां क्लासिक दृष्टिकोण से काफी भिन्न हैं। पतली टुकड़े की तैयारी के विपरीत जहां विशिष्ट सेल परत सतह पर दिखाई दे रहे हैं और सीधे जांच की जा सकती है, अलग-अलग परतों के माध्यम से पार करते हुए विद्युत् निषिद्ध मस्तिष्क क्षेत्रों में इलेक्ट्रोड को कम किया जाता है जहां विवो कॉन्फ़िगरेशन में बरकरार हिप्पोकैम्पल तैयारी अधिक होती है। हिप्पोकैम्पस की अखंडता को कार्यात्मक कनेक्टिविटी और स्थानीय न्यूरोनल आबादी के गुणों के साथ एक साथ संरक्षित रखा गया है। यह हिप्पोकैम्पस में छोटे और बड़े पैमाने पर नेटवर्क दोलनों की जांच करने के लिए एक जटिल और शक्तिशाली टूल प्रदान करता है उदाहरण के लिए, नेटवर्क में prewired circuitry और cell-type विशिष्ट गुणों का संयोजन आंतरिक रूप से और सहज रूप से निर्मित तालबद्ध थीटा और गामा दोलन पैदा करता है जो कि हिप्पोका की महत्वपूर्ण विशेषताओं की नकल करता है।विवो में मेपल गतिविधि इस प्रोटोकॉल में प्रस्तुत विधियों का उपयोग करते हुए, हिप्पोकैम्पस को कृंतक मस्तिष्क से जल्दी से निकाला जा सकता है और एएससीएफ पर्यावरण में तेजी से बहने वाले कई घंटे तक व्यवहार्य रह सकता है। बेसिक इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल तकनीकों की जांच के लिए आसानी से लागू किया जाता है कि कैसे विशिष्ट न्यूरोनल प्रकार के सिंक्रोनस गतिविधि और अन्तर्ग्रथनी कार्य हिप्पोकैम्पल गतिशीलता को प्रभावित करते हैं।

हमारी प्रक्रिया ने विट्रो में हिप्पोकैम्पस के पूरे सीपो-अस्थायी (डोरो-वेंट्रल) अक्ष में स्थानीय क्षेत्र संभावित दोलनों की गतिशीलता को व्यवस्थित रूप से एक्सप्लोर करने का पहला अवसर प्रदान किया है (देखें रेफ्यू 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27 , 28 )। नेटवर्क और शारीरिक स्तर पर, बरकरार तैयारी सुरक्षित रखता है: 1) कार्यात्मक सिनाआवृत्ति रेंज और विवो में थीटा तरंगों के प्रोफाइल के साथ आंतरिक नेटवर्क दोलनों को मज़बूती से समर्थन करने के लिए आवश्यक कोशिकाओं के बीच पीटीक अंतःक्रिया, 2) स्ट्रेटम पिरामिडेल के स्तर पर थीटा दोलन के सापेक्ष चरण में तेज परिवर्तन, 3) स्थानिक वितरण और थीटा की जुटना हिप्पोकैम्पस में दोलन और स्थानीय गामा आवृत्ति लय के साथ इसकी बातचीत, 4) थिटा / गामा तरंगों के आयाम-चरण संबंध और 5) क्षेत्रीय संभावित थिटा दोलनों के साथ प्रमुख सेल और इंटर्न्यूरॉन फायरिंग के विशिष्ट अस्थायी संघ।

जबकि हिप्पोकैम्पस में बाह्य इनपुट की अनुपस्थिति तकनीक के लिए एक सीमा के रूप में प्रकट हो सकती है, यह हिप्पोकैम्पस की आंतरिक गतिशीलता के एक तरीके से अध्ययन की अनुमति देती है जो कि vivo में नहीं किया जा सकता है। इसके अलावा, बाहरी निविष्टियां विशिष्ट फाइबर टर्मिनलों और अभिवाही मार्गों के ऑप्टोगैनेटिक उत्तेजना से नकल कर सकती हैं। निरंतर तैयारी अध्ययन करने के लिए नई संभावनाएं प्रदान करती हैहिप्पोकैम्पस और अन्य कनेक्टेड संरचनाओं से जुड़े बड़े पैमाने के नेटवर्कों में नेटवर्क की गतिविधियों का प्रसार और बातचीत कैसे की जाती है। जैसे, बरकरार तैयारी तकनीक का एक मुख्य अनुप्रयोग मस्तिष्क क्षेत्रों के भीतर या उसके बीच कार्यात्मक नेटवर्क कनेक्टिविटी की जांच है। इन विट्रो बरकरार हिप्पोकैम्पस का उपयोग करना चाहिए न केवल हिप्पोकैम्पस के सेलुलर और नेटवर्क गुणों के बारे में अधिक जानकारी प्रदान करना चाहिए, बल्कि यह भी प्रकाश डाला कि ये कैसे मस्तिष्क के भीतर प्रसंस्करण, एकीकरण और सूचना जनरेट कर रहे हैं।

बड़े न्यूरोनल स्नैम्बल्स के समन्वित इलेक्ट्रो-केमिकल सिग्नलिंग में लयबद्ध नेटवर्क दोलन एन्कोडिंग, भंडारण और मस्तिष्क क्षेत्रों के भीतर और मस्तिष्क क्षेत्रों में जानकारी के लिए एक केंद्रीय तंत्र के रूप में कार्य करते हैं। हिप्पोकैम्पल दोलन स्पीतिओमपॉररल सूचना, एन्कोडिंग और मेमोरी के प्रसंस्करण के लिए महत्वपूर्ण माना जाता है। इसके विपरीत, हिप्पोकैम्पल डिसफंक्शन को विकारों को सफलता हासिल करना माना जाता हैज अल्जाइमर की बीमारी और स्किज़ोफ्रेनिया है, जो कि दोलनित दोलन पैटर्न 29 के साथ जुड़ा हुआ है। जैसे, आत्मनिर्भर हिप्पोकैम्पल तैयारी का इस्तेमाल करते हुए स्वयं-जनित हिप्पोकैम्पल दोलनों का अध्ययन तंत्रिका तंत्र समारोह और शिथिलता के बुनियादी गुणों को स्पष्ट करने के लिए एक नया माध्यम बन गया है।

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Disclosures

लेखक कोई प्रतिस्पर्धी वाणिज्यिक या वित्तीय हितों की घोषणा नहीं करते हैं

Acknowledgments

यह काम कनाडा के स्वास्थ्य अनुसंधान और प्राकृतिक विज्ञान संस्थानों द्वारा समर्थित था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
Sodium Chloride Sigma Aldrich S9625
Sucrose Sigma Aldrich S9378
Sodium Bicarbonate Sigma Aldrich S5761
NaH2PO4 - sodium phosphate monobasic Sigma Aldrich S8282
Magnesium sulfate Sigma Aldrich M7506
Potassium Chloride Sigma Aldrich P3911
D-(+)-Glucose Sigma Aldrich G7528
Calcium chloride dihydrate Sigma Aldrich C5080
Sodium Ascorbate Sigma Aldrich A7631-25G
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Standard Dissecting Scissors Fisher Scientific 08-951-25 brain extraction
Scalpel Handle #4, 14 cm WPI 500237 brain extraction
Filter forceps, flat jaws, straight (11 cm) WPI 500456 brain extraction
Paragon Stainless Steel Scalpel Blades #20 Ultident 02-90010-20 brain extraction
Fine Point Curved Dissecting Scissors Thermo Fisher Scientific 711999 brain extraction
Teflon (PTFE) -coated thin spatula VWR 82027-534 hippocampal preparation
Hayman Style Microspatula Fisher Scientific 21-401-25A hippocampal preparation
Lab spoon Fisher Scientific 14-375-20 hippocampal preparation
Borosilicate Glass Pasteur Pipets Fisher Scientific 13-678-20A hippocampal preparation
Droper Fisher Scientific hippocampal preparation
Razor blades Single edged VWR 55411-055 hippocampal preparation
Lens paper (4 x 6") VWR 52846-001 hippocampal preparation
Glass petri dishes (100 x 20 mm) VWR 25354-080 hippocampal preparation
Plastic tray for ice; size 30 x 20 x 5 cm n.a. n.a. hippocampal preparation
Single Inline Solution Heater Warner Instruments SH-27B perfusion system
Aquarium air stones for bubbling n.a. n.a. perfusion system
Tygon E-3603 tubing (ID 1/16 OD 1/8) Fisherbrand 14-171-129 perfusion system
Electric Skillet Black & Decker n.a. perfusion system
95% O2/5% CO2 gas mixture (carbogen)  Vitalaire SG466204A perfusion system
Glass bottles/flasks (4 x 1 L) n.a. n.a. perfusion system
Submerged recording Chamber custom design (FM) n.a. Commercial alternative may be used
Glass pipettes (1.5/0.84 OD/ID (mm) ) WPI 1B150F-4 electrophysiology
Hum Bug 50/60 Hz Noise Eliminator Quest Scientific Q-Humbug electrophysiology
Multiclamp 700B patch-clamp amplifier Molecular devices MULTICLAMP electrophysiology
Multiclamp 700B Commander Program Molecular devices MULTICLAMP electrophysiology
Digital/Analogue converter Molecular devices DDI440 electrophysiology
PCLAMP10 Molecular devices PCLAMP10 electrophysiology
Vibration isolation table  Newport n.a. electrophysiology
Micromanipulators (manually operated ) Siskiyou  MX130 electrophysiology (LFP)
Micromanipulators (automated) Siskiyou  MC1000e electrophysiology (patch)
Audio monitor  A-M Systems Model 3300 electrophysiology
Micropipette/Patch pipette puller Sutter P-97 electrophysiology
Custom-built upright fluorescence microscope Siskiyou n.a. Imaging
Analogue video camera COHU 4912-2000/0000 Imaging
Digital frame grabber with imaging software EPIX, Inc PIXCI-SV7 Imaging
Olympus 2.5X objective Olympus MPLFLN Imaging
Olympus 40X water immersion objective Olympus UIS2 LUMPLFLN Imaging
Custom-made Light-Emitting Diode (LED) system  custom n.a. optogenetic stimulation (Amhilon et al., 2015)
Name Company Catalog Number Comments
Animals
PV::Cre (KI) mice Jackson Laboratory stock number 008069 Allow  Cre-directed gene expression in PV interneurons
Constitutive-conditional Ai9 mice (R26-lox-stop-lox-tdTomato (KI)) Jackson Laboratory stock number 007905 Express TdTomato following Cre-mediated recombination
Ai32 mice (R26-lox-stop-lox-ChR2(H134R)-EYFP Jackson Laboratory stock
number 012569		 Express the improved channelrhodopsin-2/EYFP fusion protein following exposure to Cre recombinase
PVChY mice In house breeding n.a. Offspring obtained from cross-breeding the PV-Cre line with Ai32 mice (R26-lox-stop-lox-ChR2(H134R)-EYFP

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References

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हिप्पोकैम्पल थीटा बैंड में ट्यूनिंग<em&gt; विट्रो में</em&gt;: अलगाववादी कृंतक सेप्टोशिपोकैम्पल सर्किट से रिकॉर्डिंग के लिए तरीके
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Manseau, F., Williams, S. Tuning in… More

Manseau, F., Williams, S. Tuning in the Hippocampal Theta Band In Vitro: Methodologies for Recording from the Isolated Rodent Septohippocampal Circuit. J. Vis. Exp. (126), e55851, doi:10.3791/55851 (2017).

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