Summary
Her præsenterer vi en protokol til optagelse af rytmisk neuronalt netværk theta og gamma oscillationer fra et isoleret hele hippocampal præparat. Vi beskriver de eksperimentelle trin fra udvindingen af hippocampus til detaljer af felt-, enheds- og helcelle-patch-klemmeoptagelser samt optogenetisk pacing af theta-rytmen.
Abstract
Denne protokol beskriver fremgangsmåderne til fremstilling og registrering fra den isolerede hele hippocampus, af WT og transgene mus sammen med nylige forbedringer i metoder og anvendelser til undersøgelsen af theta-oscillationer. En simpel karakterisering af det isolerede hippocampale præparat præsenteres, hvorved forholdet mellem interne hippocampale theta-oscillatorer undersøges sammen med aktiviteten af pyramidale celler og GABAergiske interneuroner af cornu ammoni-1 (CA1) og subikulum (SUB) områder. Samlet viser vi, at den isolerede hippocampus er i stand til at generere indre theta-oscillationer in vitro, og at rytmicitet frembragt inden for hippocampus kan manipuleres nøjagtigt ved optogenetisk stimulering af parvalbumin-positive (PV) interneuroner. Det in vitro- isolerede hippocampale præparat giver en enestående mulighed for at anvende samtidige felt- og intracellulære patch-clamp-optagelser fra visuelt identificeret neuRons for bedre at forstå mekanismerne bagved theta rytmegenerering.
Introduction
Hippokampale theta-oscillationer (4-12 Hz) er blandt de mest fremtrædende former for rytmisk aktivitet i pattedyrs hjernen og antages at spille centrale roller i kognitive funktioner som behandling af spatiotemporale oplysninger og dannelse af episodiske minder 1 , 2 , 3 . Mens flere in vivo- undersøgelser, der fremhæver forholdet mellem theta-modulerede stedceller med rumlig navigation og læsionsundersøgelser samt kliniske beviser, understøtter synspunktet om, at hippocampale theta-oscillationer er involveret i hukommelsesdannelse 4 , 5 , 6 , de mekanismer, der er forbundet Med generering af hippocampale theta-oscillationer er stadig ikke fuldt ud forstået. Tidlige in vivo undersøgelser foreslog, at theta-aktivitet hovedsageligt afhænger af ekstrinsiske oscillatorer, især rytmisk inputFra afferente hjerne strukturer såsom septum og entorhinal cortex 7 , 8 , 9 , 10 . En rolle for indre faktorer - intern tilslutning af hippocampale neurale netværk sammen med egenskaberne af hippocampale neuroner - blev også postuleret på basis af in vitro observationer 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 . Men bortset fra nogle få landmærkeundersøgelser 19 , 20 , 21 er der vanskeligheder med at udvikle fremgangsmåder, som kunne replikere fysiologisk realistiske befolkningsaktiviteter i simpel in vitro- skiveforberedelseS har i lang tid forsinket mere detaljeret forsøgsundersøgelse af hippocampus 'indbyggede evner og relaterede områder til selvfrembringende theta-oscillationer.
En vigtig ulempe ved standard in vitro -tyndskiveeksperimentelle indstillinger er, at den 3D-cellulære og synaptiske organisation af hjernestrukturer sædvanligvis kompromitteres. Det betyder, at mange former for samordnede netværksaktiviteter baseret på rumligt fordelte celleanlæg, der spænder fra lokaliserede grupper (≤1 mm radius) til populationer af neuroner spredt over en eller flere hjerneområder (> 1 mm), ikke kan understøttes. I betragtning af disse overvejelser var der behov for en anden type tilgang til at studere, hvordan theta-svingninger dukker op i hippocampus og former for relaterede cortical og subcortical output strukturer.
I de senere år har den indledende udvikling af "komplet septo-hippocampal" -præparatet til at undersøge tovejsinteraCtioner af de to strukturer 22 og den efterfølgende udvikling af det "isolerede hippocampus" -præparat har vist, at intrinsiske theta-oscillationer forekommer spontant i hippocampus, der mangler ekstern rytmisk indgang 23 . Værdien af disse fremgangsmåder ligger på den indledende indsigt, at hele den funktionelle struktur af disse regioner skulle bevares for at fungere som en theta-rytmegenerator in vitro 22 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedurer er blevet udført i henhold til protokoller og retningslinjer godkendt af McGill University Animal Care Committee og Det Canadiske Råd for Dyrlæge.
1. Akut Hippocampus In Vitro Præparat
BEMÆRK: Isolering af det intakte hippocampale præparat involverer tre hovedtrin: (1) Forberedelse af opløsninger og udstyr, (2) Dippektion af hippocampus og (3) Opsætning af det hurtige perfusionshastighedssystem, som er nødvendigt for generering af egentlige theta-oscillationer. I denne protokol er den rettidige udførelse af procedurer - fra dissektion til optagelse - særligt vigtig, fordi den isolerede hippocampus udgør en så tæt, men delikat forberedelse, at opretholdelse af funktionel konnektivitet af strukturen in vitro kræver stor omhu. Forberedelse af alt på forhånd sørger for, at der findes en tilstrækkelig grad af perfusion så tidligt som muligt for at minimere celle dAmage og opretholde fysiologisk funktion.
- Saccharose-baseret kunstig cerebral spinalvæske (aCSF) opløsning
- Forbered 1X stock sucrose opløsning til brug for dissektion og efter-dissektion inkubation. Kombiner alle bestanddele anført i tabel 1, med undtagelse af CaCl2, i 1 I deioniseret vand, og opbevares ved 4 ° C i op til 2 uger.
- Standard aCSF-løsning
- Forbered standard aCSF til høj flow perfusion af den isolerede hippocampus under elektrofysiologiske optagelser. For at gøre det koncentrerede (5X) lager aCSF opløses alle de komponenter, der er anført i tabel 2 , undtagen CaCl 2 , i 2 liter deioniseret vand og opbevares ved 4 ° C.
- Forbered udstyret
- Før du starter dissektion, skal du oprette bænkområdet med en isfyldt plastbakke (30 x 20 x 5 cm), karbonforbindede rørledninger og thrEe glas petriskåle (10 x 2 cm) (se figur 1 ).
- Tilsæt 300 ml saccharoseopløsning (1X lager) til en 500 ml bægerglas, boble det med carbogen (95% O2, 5% CO2) og tilsæt Ca2 + [1,2 mM].
- Overfør 60 ml af denne saccharoseopløsning til en glas-petriskål og lad den være ved stuetemperatur. Anbring resten i en 4 ° C fryser i 10-15 minutter.
- Boble den iskolde saccharoseopløsning med carbogen gennem dissektionen.
- Fyld en anden petriskål (koldholdig kammer) med saccharoseopløsning (4 ° C) og hold på is.
- Tilsæt 30 ml iskold sucroseopløsning til et 50 ml bægerglas.
2. Hele Hippocampus Dissection
BEMÆRK: Metoden til dissektering af den isolerede hippocampus er i det væsentlige identisk med den udviklede og beskrevet oprindeligt 22 , men med yderligere detaljer og ændringer vedrørende peRfusion sats og optagelsesteknikker.
- Hjernedissektion
- Bedøv musen (P20 - 35) under en gashætte med et lille papirhåndklæde gennemblødt med 1 ml isofluran (100%), der tilsættes i buret.
- Dekapitér den bedøvede mus og nedsænk hurtigt hovedet i iskold sucroseopløsning (50 ml bæger, ~ 5 s). Overfør på et papirhåndklæde.
- Brug en skalpel til at gøre et medialt hudindsnit (caudal til rostral) og skub huden på siderne for at udstille kranen.
- Skær åben kraniet med en lille sakse og brug en spatel til hurtigt at ekstrahere hjernen og slip den i petriskålen med iskold sucroseopløsning. Tillad 1-2 minutter for hjernen at afkøle.
- Mens hjernen er ved at genvinde, tilsættes 2 - 3 ml saccharoseopløsning på en linsepapir dækket Petri (dissektion) skål på is.
- Isolering af hippocampus
- Placer hjernen på dissektionsskålen i en opretstående stillingn.
- Fjern cerebellum og frontal cortex med et barberblad. Klip hjernen halvt over midsagittalplanet og returner de to isolerede halvkugler til holdekammeret. Tillad yderligere 1 - 2 min til genopretning.
- Placer en enkelt hemisected hjerne oprejst på dissektionsskålen.
- Drej opskålen, indtil midsagittale strukturer står over for observatøren, og den indlejrede kontur af septal-komplekset er synlig som et tyndt pæreformet vævslag frem for thalamus.
- Hold den hæmmede hjerne konstant med mikrospatelen, og læg den lille ende af polytetrafluorethylen (PTFE) -belagt spatel umiddelbart bagud (caudal til) septalområdet.
- Indsæt den belagte spatel under septumet og flyt spidsen ned, indtil dissektionsskålen er nået. Fjern de fibre, der forbinder septalområdet caudalt. Gentag den samme operation langs septumets forkant og skær fibrene, der forbinder til den forreste del af hjernen.
- Med spatelen, der holder den indre del af cortex lige over hippocampus i opretstående stilling, skal du bruge mikrospatelen til forsigtigt at trække ned de thalamiske, hypotalamiske og resterende hjernestamkerner. Brug spatelen til at skære af og fjerne det fjernede væv.
- Drej den isolerede halvkugle på sin side og identificer hippocampus 'disposition.
- Indsæt den belagte spatel i lateral ventrikel, under den røde ende af den dorsale hippocampus.
- Hold spatelen i horisontal retning med det hæmmede hjerne midsagittalplan og glid det gennem den glatte kontur af ventrikulære vægge, indtil spidsen kommer frem
- Hold spatelet under hippocampus og tryk let på det på forbindelsesfibrene, langs det indvendige lag, hvor hippocampus forbinder med den overliggende cortex. Påfør mikrospatelet på ydersiden af dette lag og glide mod den belagte spatel for at skære gennem forbindelsesfilenlemmer.
- For at fuldføre ekstraktionen, drej dissektionsskålen og indsæt den belagte spatel under den ventrale hippocampus. Hold let indersiden af den kortikale fold med spatelen og skær gennem de entorhinale forbindelser ved hjælp af en skærebevægelse mod mikrospatelen.
BEMÆRK: Hele septohippocampalkomplekset kan fjernes ved at placere den belagte spatel under hele hippocampus og trække det resterende hjernevæv ud nedenfra. - Når isolationen er færdig, skal du holde hippocampuset på skålen og tilsæt en dråbe iskold sucroseopløsning for at holde det køligt. Trim forsigtigt alle resterende cortex og fibre og adskilt hippocampus fra septumet ved forsigtigt at påføre et barberblad gennem fornixen.
BEMÆRK: Hvis patch clamp optagelser skal udføres fra pyramidale celler (se afsnit 4.6 Optogenetisk kontrol), kan den isolerede hippocampus skæres tværgående i en 45 ° vinkel for at udsætte det pyramide lag af CA1 ("anglE-cut "forberedelse) uden at gå på kompromis med det lokale netværkskredsløb i den resterende del af hippocampus. - Overfør præparatet til stuetemperatursuccroseopløsning og lad det gendanne i 15-30 minutter før overførsel til optagekammeret.
3. Opsæt den hurtige perfusion til optagelse af den isolerede hippocampus
- Opstil det tyngdekraftsmatede perfusionssystem for at muliggøre kontinuerlig højhastighedstilførsel af oxygeneret aCSF ved 20-25 ml / min.
- Klargør aCSF (1X) kolber på forhånd og nedsænk dem i et opvarmningsbad (~ 30 ° C) mindst 15 minutter før forsøgsforsøg. Tænd for in-line-løsningens varmeanlæg (30 ° C).
- Bruge akvarium bubblers og rørledninger forbundet med et carbogen tank for at ilte aCSF hele forsøget, og tilføj CaCl2 [2 mM] før starten af perfusion.
- Stop aCSF flow og overfør hippocampus til optagekammeret med det bredeEnden af en glaspipette. Lad det saccharose-mættede præparat synke og slå sig ned i bunden.
- Placer forberedelsen i midten af optagekammeret (i overensstemmelse med indløbsaksen) med den glatte overflade af CA1 og SUB på toppen. Stabiliser hippocampus med små vægte ved septal og tidsmæssige ekstremiteter og genstart aCSF flow.
4. Elektrofysiologi i den isolerede hippocampus
- Ekstracellulær optagelse af in vitro hippocampale theta-oscillationer
- Ved ekstracellulær overvågning af lokalfeltpotentiale (LFP) eller enhedsaktivitet fra den in vitro- isolerede hippocampus anvendes glasmikropipetter (1 - 3 MΩ) fyldt med aCSF. Optag støjstøj AC-koblede feltpotentiale signaler med en patch clamp forstærker for gain x1000, online bandpass filtrering 0,1 - 500 Hz og en samplingshastighed på 5-20 kHz.
BEMÆRK: Det specialbyggede mikroskop, der anvendes i denne protokolEr udstyret med lav-(2,5x) og høj forstørrelse (40X) mål for lav forstørrelse visning af hippocampus, samt infrarød video mikroskopi og epifluorescens til single celle genkendelse. Komponenterne i dette system indbefatter det opretstående fluorescensmikroskop, fluorescensfilterkuber, et analog videokamera og digital frame grabber med billedbehandling software, et on-stage tilpasset perfusionskammer ( figur 2A , indsats i) og høj præcision mikromanipulatorer til neuronal optagelser og Optisk fiberplacering. - Brug kameraet monteret på mikroskopet og tilsluttet til en computerskærm for at inspicere hippocampalpræparatet under lav forstørrelse (2.5X) og kontroller hurtigt, at der ikke er nogen underskæringer eller beskadigelse på den ydre overflade. Det diagonalt orienterede arrangement af alveusfibre langs den glatte overflade af CA1 skal være synlig ( Figur 2A , indlæsning ii), når det skinner transmitteret lys gennem hippocammenpus.
- Brug det lille forstørrelsesbrede feltmål for at se den isolerede hippocampus og placeringen af LFP-elektroder på bestemte optagelsessteder.
BEMÆRK: Et layout af det isolerede hippocampale præparat med flere elektroder placeret i forskellige registreringssteder er illustreret i figur 2A . - Sænk en LFP-elektrode ind i badet, indtil den berører overfladen (alveus) i CA1-området.
BEMÆRK: Dette producerer normalt en hurtig forbigående i den AC-koblede optagelse svarende til hvad der sker, når elektroden kommer i kontakt med optagemediet. En lydskærm kan være nyttig til at lytte til LFP-kanalsignalet efter dette trin.
BEMÆRK: Ofte vil tidlige tegn på aktivitet kun vises efter 10-15 minutter, derfor er det vigtigt ikke hurtigt at komme ind i præparatet. Hvis overfladen LFP-elektroden efter denne periode ikke optager aktiviteten, forskydes lidt længere nede gennem stratum orienterneOg pause regelmæssigt for at se om nogen form for aktivitet opstår, når du nærmer dig det primære cellelag. Hvis der ikke opdages noget efter yderligere 5 - 10 minutter, trækkes elektroden forsigtigt tilbage og placeres andetsteds i samme område. - Forlæng LFP-elektroden gennem det pyramide lag. Vær opmærksom på, at ekstracellulær spikingaktivitet i begyndelsen øges, da enhedsladning fra individuelle neuroner (for det meste pyramide og hæmmende kurvceller) detekteres. Sænk elektroden yderligere og bemærk at spiking begynder at falme igen, når spidsen krydser ind i radiatumet. Bemærk, at en tydelig synlig netværksoscillation i theta-frekvensområdet (4-12 Hz) bliver tydelig og når maksimal amplitude (~ 100 - 300 μV), da optagelsesstedet sænkes gennem radiatum.
- Ved ekstracellulær overvågning af lokalfeltpotentiale (LFP) eller enhedsaktivitet fra den in vitro- isolerede hippocampus anvendes glasmikropipetter (1 - 3 MΩ) fyldt med aCSF. Optag støjstøj AC-koblede feltpotentiale signaler med en patch clamp forstærker for gain x1000, online bandpass filtrering 0,1 - 500 Hz og en samplingshastighed på 5-20 kHz.
- Theta-svingninger på tværs af en enkelt region
- For at teste de rumlige egenskaber ved spontane theta-oscillationer på tværs af CA1-regionen, skal du placere spidsen oFa reference LFP-elektrode i et medial CA1-sted (medialt placeret langs den langsgående septotemporale akse) og sænke den i radiatum som beskrevet tidligere.
- Placer en anden LFP-elektrode i et CA1-sted (200 - 800 μm septal eller tidsmæssigt fra den første LFP) og observer, at CA1 theta-oscillationer kan synkronisere over relativt store afstande.
- Theta-svingninger på tværs af lag
- For at teste egenskaberne af theta-oscillationer på tværs af hippocampale lag, efterlad en reference LFP-elektrode på et CA1-radiatumsted. Start fra lige over stratum orienterne, sænk en anden elektrode ind i pyramidcellelaget og gennem radiatumet. Overhold en gradvis inversion af LFP-signalet (relativ faseomkørsel) over det pyramide lag.
BEMÆRK: For repræsentative eksempler på disse typer aktiviteter, se Figur 2B . Eksempler på laminar / dybdeprofiler og Current Source Density (CSD) analyseIllustrerer stedet for faseomvendelse i isoleret hippocampi er blevet offentliggjort tidligere 23 , 24 , 25 .
- For at teste egenskaberne af theta-oscillationer på tværs af hippocampale lag, efterlad en reference LFP-elektrode på et CA1-radiatumsted. Start fra lige over stratum orienterne, sænk en anden elektrode ind i pyramidcellelaget og gennem radiatumet. Overhold en gradvis inversion af LFP-signalet (relativ faseomkørsel) over det pyramide lag.
- Gamma oscillationer og theta-gamma kobling i den intakte hippocampus
- Placer en feltelektrode ved CA1 / SUB-grænsen og sænk den, indtil den sidder ved grænsefladen mellem de pyramide og molekylære lag. På dette niveau kan et feltpotentiale, der viser klare gamma-svingninger med ændringer i amplitude, som faselås til den lokale theta-rytme, optages 24 . Juster skalering for at observere den langsomme tidsskala af theta-gamma-koblingen. Bemærk at gammaudbrud forekommer i to forskellige frekvensbånd, hvilket kan afsløres ved båndpasfiltrering af det igangværende LFP-signal i langsom (25 - 50 Hz) og hurtig gamma (150-250 Hz) rækkevidde (Se figur 2C for repræsentativt filtreret spor).
- Hele-celle patch clamp optagelse under in vitro hippocampal theta oscillationer
BEMÆRK: I denne del af protokollen er målet at opnå visuelt styrede helcelle-patch-klemmeoptagelser fra identificerede interneuroner i isoleret hippocampi fra transgene PV-TOM-mus, der udtrykker det fluorescerende protein, tdTomato, under kontrol af PV-promotoren (for Flere detaljer se materialer og Ref 26 ).- Brug fluorescensvideomikroskopi med lav (2,5x) og høj effekt (40x) forstørrelse for at visualisere TDTomato-positive interneuroner placeret nær overfladen af et hippocampalt præparat fra en PV-TOM mus ( figur 3 ). Bemærk, at mens PV-TOM-neuroner med succes kan visualiseres og målrettes til plaster gennem alveen (op til 100 μm), kan ikke-fluorescerende pyramidale celler også nås relativt nemt, når hippocampus fremstilles med vinkelsnitteknikken (se Afsnit 2.2.14 note).
- Under lav forstørrelsesvisning af hippocampus skal du placere en LFP-elektrode i CA1 / SUB for at overvåge theta-oscillationer, mens du forbereder dig til patch clamp eksperimenter.
- Skift til 40X forstørrelse og formindsk målet over målområdet; Sænk det, indtil de øverste lag bliver synlige. Manipuler mikroskopets position for at sikre tilstrækkelig åben adgang til patchpipette-tilgang fra den modsatte side.
- Under fluorescensmikroskopi skal du vælge en fluorescerende PV-TOM-celle og nærme den med en patchpipette (2 - 3 MΩ) fyldt med standard intracellulær opløsning.
- Brug et mundstykke til at anvende let positivt tryk på pipetten og overvåge modstanden, da elektroden sænkes ned på cellen. Når spidsen møder målcellen, øges pipettemodstanden, og der vises et tydeligt spidse som et positivt tryk skubber på membranen. Frigør trykket og kontroller, at den aktuelle puls flader som en forsegling begynder at danne. Umiddelbart klForstærker til et hyperpolariseret potentiale (-70 mV), og når en GΩ-forsegling er opnået, ødelægger cellemembranen med en lille mængde negativt tryk påført gennem pipetteholderen.
- Én gang i helcellekonfiguration undersøge de fysiologiske egenskaber hos identificeret PV-celle under spontane hippocampale oscillationer ( Figur 3B ).
- Vær opmærksom på, at intracellulær membranpotentialeoptagelse fra PV-celler er kendetegnet ved hurtig spikingadfærd og udbrud af aktionspotentialer synkroniseret med den igangværende CA1 / SUB-theta-rytme.
- Skift til spændingsklemme og hold cellen ved forskellige membranpotentialer for at karakterisere forholdet mellem excitatoriske og inhiberende synaptiske strømme, der genereres af den egentlige rytmiske aktivitet. Et eksempel på patch clamp optagelse fra en pyramide celle er vist i figur 3A til sammenligning.
- Optogenetisk kontrol i den isolerede hippocampus BEMÆRK: Til optogenetisk kontrol af hippocampal netværksaktivitet anvendes en celletype-specifik strategi, der involverer rytmisk aktivering af PV-holdige GABAerge celler, da disse celler blev vist at spille en vigtig rolle ved synkronisering af hovedcellepopulationer i den isolerede hippocampus 25 . Selektiv ekspression af det excitatoriske channelrhodopsin-2 (ChR2) i PV-celler opnås ved at krydse PV-Cre-muselinien med mus, som konstitutivt udtrykker ChR2 Cre-afhængig (Ai32), hvorved der produceres PV-ChY-mus. Alternativt kan virale vektorkonstruktioner ( f.eks . AAVdj-ChETA-eYFP) injiceres i hippocampus af PV-Cre eller PV-TOM-mus (P15-16) for at drive ekspression af excitatorisk opsin i CA1 / SUB-interneuroner ( Figur 4A ).
BEMÆRK: Denne strategi er blevet beskrevet tidligere 25 .- Anbring en LFP-elektrode i CA1 / SUB-området og læg en nærliggende pyramidcelle i den isolerede hippocAmpus af en mus, der udtrykker den blålysfølsomme excitatoriske opsin ChR2 i PV-interneuroner.
- Anbring en optisk fiberlysstyring (0,2-1 mm diameter) over hippocampalpræparatet og centrer det på det optagede område. Brug blåt lys (473 nm) fra en LED-kilde til optogenetisk stimulering, der består af lysimpulser (10-20 ms, udløst af et transistor-transistorlogisk signal) eller sinusbølge-spændingskommandoer leveret ved theta-frekvenser (4-12 Hz).
BEMÆRK: Den brugerdefinerede LED-baserede lysstimuleringsenhed er beskrevet andetsteds 25 . - Skift til nuværende klemme og karakteriser pyramidalets aktivitet under spontane theta-svingninger.
- Start stimuleringsprotokollen og optag lysresponserne. Kontroller at feltoscillationer og synaptisk aktivitet i den registrerede neuron bliver mere og mere synkroniseret under optogenetisk stimulering, og at rytmisk pacing af PV-celler resulterer i en robust styring af begge frekvenserEnce og magt af theta-oscillationer ( figur 4 ).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dette afsnit illustrerer eksempler på resultater, som kan opnås ved at studere theta-oscillationer i det mus-isolerede hippocampale præparat in vitro . Dissektionsproceduren til ekstraktion af den isolerede hippocampus er illustreret i figur 1 . Ved anvendelse af dette præparat kan intrinsiske theta-oscillationer undersøges under placering af multiple feltelektroder, optagelse af overordnet aktivitet og synkroniserede synaptiske input til neuronpopulationer i forskellige regioner og lag af den isolerede hippocampus ( figur 2 ). Repræsentative resultater fra samtidige helcelleplasteklemmer og ekstracellulære optagelser præsenteres for at karakterisere de brændende og synaptiske egenskaber af specifikke celletyper under spontane hippokampale theta-oscillationer ( figur 3 ) såvel som under optogenetisk manipulation af rytmisk aktivitet (G "> Figur 4).
Figur 1: Dissektionsprocedure for den isolerede intakte hippocampus-fremstilling.
( A ) Generel visning af dissektionsopsætningen. Øverst til højre: karboneret iskold saccharose opløsningskolbe (1); Nederst til venstre: Isfyldt plastbakke (2), der holder dissektionsskålen dækket med linsepapir (3); Det kolde fastholdelseskammer indeholdende saccharoseopløsning (4); Og et sæt kirurgiske værktøjer (5). ( B ) Visning af musens hjerne før hemisektion på dissektionsskålen. ( C ) Gendannelse af hemisected hjerne i det kolde holderum og zoomet visning (indsats) i venstre hjernehalvdel, inden du indsætter den lille ende af den belagte spatel under septum. ( D ) Coated spatel anbragt under den isolerede hippocampus langs CA1 / SUB regionen med den resterende hjerneVæv trækkes ud nedenfra. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Konfiguration af opsætningen til optagelse af in vitro- theta-oscillationer fra den intakte hippokampepræparation i den nedsænkte optagekammer.
( A ) Den isolerede hippocampus er vist med et layout af hippocampale regioner og multiple elektroder anbragt i fire forskellige registreringssteder fordelt septotemporalt (angivet med hvide stjerner). I betragtning af optagekammerplatformen vist ovenfor (indsats i) er indløb og udløb for hurtigperfusionsstrømmen angivet med tal (1, 2). I det forstørrede billede af hippocampus vist nedenfor (indsats ii) er en enkelt elektrode placeret i midtenSepetotemporal CA1 og fibre af alveus er let synlige, kører diagonalt mod subikulumet. S: septal, T: temporal, f / fx: fimbria-fornix. ( B ) Skematisk repræsentation af organisationen af CA1 lag med repræsentative LFP spor registreret samtidigt fra stratum oriens (grå) og stratum radiatum (sort). Bemærk den omvendte fase af signaler mellem de to lag. Alv: stratum alveus, PR: stratum pyramidale, SR: stratum radiatum. SLM: Stratum Lacunosum Moleculare. ( C ) Eksempel LFP-spor, der viser spontan theta-oscillation optaget fra CA1 / SUB-området (20 sek segment) og 2 sek ekspanderede segmenter (nedenfor) fra ufiltreret signal; Band-pass filtreret for theta frekvenser (0,5-12 Hz); Langsom gamma (25 - 55 Hz); Og hurtig gamma (125 - 250 Hz). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Celtypespecifik aktivitet af pyramidcelle og PV-interneuron under spontane theta-oscillationer i den intakte hippocampale præparation fra en PV-TOM-mus.
( A ) Synaptisk aktivitet registreret fra en pyramidcelle under theta-oscillationer. Spændingsspor (venstre panel) viser spontan, men ikke rytmisk afbrænding i hvile og hæmmende postsynaptiske potentialer (iPSP'er), der ikke klart synkroniseredes med den langsomt voksende LFP-oscillation. Spændingsklemmeoptagelser (højre panel) viser, at de tilsvarende hæmmende postsynaptiske strømme (iPSC'er) har deres reverseringspotentiale omkring -70 mV. ( B ) Synaptisk aktivitet registreret fra en hurtigt spiking fluorescerende PV interneuron under theta oscillationer. I nuværende klemme (til venstre) brændte denne celle spontant i ro og blev stærkt drevet af rytmisk excitatorisk poStsynaptiske potentialer (ePSP'er), som blev faselåst med den stabile LFP-oscillation. I spændingsklemmeoptagelser (højre) var det excitatoriske postsynaptiske nuværende reverseringspotentiale ca. 0 mV. Skematiske tegninger øverst viser forsøgsopsætningen sammen med placeringen af patch- og feltelektroder i CA1 / SUB og high (40X) forstørrelsesbillederne af den registrerede pyramidcelle og fluorescerende PV interneuron. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Lokale feltpotentiale og samtidige patch-optagelser fra enkelt CA1 / SUB-pyramidale og PV-neuroner under spontane og optogenetisk drevne theta-oscillationer i den isolerede hippocampus.
( A B ) Karakterisering af et pyramidalt neuron, der viser typiske Regular-Spiking (RS) egenskaber (top) og høj forstørrelse (40X) billede af den optagne celle (bund). ( C ) Prøvestrømklemmeoptagelse af den samme celle ved depolariseret membranpotentiale (sort) sammen med LFP-signalet (grå) og viser synkroniserede rytmiske IPSP'er under spontan oscillation (venstre) og under teta-frekvens (6 Hz) lysstimulering ( højre). Mønsteret lysstimulering (blå skygger) er afbildet oven på spændingssporene. ( D ) Spectrogram og power spektra af LFP waveform før, under og efter en 6 Hz lys simulering (baseline, stim, post). ( E ) Lav forstørrelse lysfelt og fluorescensbilleder af isolatetEd hippocampal præparation viser eYFP fluorescens (i grøn) lokaliseret i CA1 / SUB regionen. ( F ) Aktuelle trin karakterisering viser Fast-Spiking (FS) opførsel af et optaget PV-TOM interneuron (40X fluorescens billede nedenfor). G ) Membranpotentiale, der viser store EPSP'er og rytmisk affyring af den registrerede PV-celle synkroniseret med LFP-signalet under spontan feltoscillation (venstre) og under lysstimulering (højre) ved 3 Hz. ( H ) Field Triggered Average (FTA) af PV-cellespidser over CA1 / SUB LFP-signalet. Udledningen af PV-cellen over flere forsøg (centreret på LFP-toppe) blev omdannet til en FTA af pigge optaget under spontan oscillation (basislinie) og under lysstimulering (stim). Mellem- og bundgrafer viser raster-plotterne med pigge og spids sandsynlighedshistogrammer (gennemsnitlig sandsynlighed vises rødt). Øverste grafer viser tegninger af det gennemsnitlige LFP signal, som øges i strøm under ligHt stimulering parallelt med højsynkroniseret fyring af PV-cellen, faset låst til toppen af LFP-oscillationen. Klik her for at se en større version af denne figur.
| SUCROSE LØSNING (1X) TIL ISOLERET HIPPOCAMPUS | |||
| (Stockopløsning) | |||
| Forbindelse | MW | Endelig Conc. (mM) | Beløb for 1 L (g) |
| saccharose | 342,3 | 252 | 86,26 g |
| NaHCO3 | 84.01 | 24 | 2,020 g |
| glucose | 180,2 | 10 | |
| KCI | 74,55 | 3 | 0,223 g |
| MgSO4 | 120,4 | 2 | 0,241 g |
| NaH 2 PO4 | 120 | 1,25 | 0,150 g |
| CaCl2 .2H2O [1 M] lager | 147 | 1.2 | 120 μl / 0,1 l * |
| * Tilsæt 360 μL CaCl 2 [1 M] til 0,3 L oxygeneret saccharoseopløsning | |||
| PH = 7,4, når iltet, Osm 310 - 320 | |||
Tabel 1.
| STANDARD ACSF LØSNING (5X) TIL PERFUSION | |||
| (Stockopløsning) | |||
| Forbindelse | MW | Endelig Conc. (mM) | Beløb for 2 L 5X |
| NaCl | 58,44 | 126 | 73,6 |
| NaHCO3 | 84.01 | 24 | 20.2 |
| glucose | 180,2 | 10 | 18 |
| KCI | 74,55 | ♦ 4.5 | 3,355 |
| MgSO4 | 120,4 | 2 | 2,41 |
| NaH 2 PO4 | 120 | 1,25 | 1.5 |
| ascorbat | 176,1 | 0,4 | 0,705 |
| CaCl2 .2H2O [1 M] lager | 147 | 2 | 2 ml / l * |
| * Tilsættes 2 ml CaCl2 [1 M] i 1 L aCSF (1x) iltet opløsning | |||
| PH = 7,4, når iltet, Osm 310 - 320 | |||
| ♦ En lidt forhøjet [K + ] o anvendes til denne aCSF-opløsning (sammenlignet med normal aCSF 2,5 mM KCl) for at øge excitabiliteten af hippocampale netværk og lette fremkomsten af theta-oscillationer. | |||
Tabel 2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mens elektrofysiologiske optagelser fra akutte hippocampale skiver udgør en standard in vitro- teknik, adskiller de her fremlagte metoder sig væsentligt fra den klassiske tilgang. I modsætning til de tynde skivepræparater, hvor specifikke cellelag er synlige på overfladen og kan undersøges direkte, er de intakte hippocampale præparater mere beslægtede med in vivo konfigurationer, hvor elektroder sænkes til målrettede hjerneområder, mens de krydser gennem individuelle lag. Hippocampus integritet bevares sammen med funktionel tilslutning og egenskaber hos lokale neuronpopulationer. Dette giver et komplekst og kraftfuldt værktøj til at undersøge små og store netværksoscillationer i hippocampus. For eksempel producerer kombinationen af forudgående kredsløb og celletypespecifikke egenskaber i netværket iboende og spontant genererede rytmiske theta- og gamma-svingninger, der efterligner vigtige træk ved hippokasMpal aktivitet in vivo . Ved hjælp af de metoder, der præsenteres i denne protokol, kan hippocampus ekstraheres hurtigt fra gnaverhjerne og forblive levedygtig i flere timer i et hurtigt flydende aCSF-miljø. Grundlæggende elektrofysiologiske teknikker anvendes let for at undersøge, hvordan synkron aktivitet og synaptisk funktion af specifikke neurontyper påvirker hippocampal dynamik.
Vores procedure har givet den første mulighed for systematisk at undersøge dynamikken i lokale feltpotentielle svingninger på tværs af hele septotemporale (dorso-ventral) akse i hippocampus in vitro (se Refs 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27 , 28 ). På netværket og fysiologiske niveauer bevares det intakte præparat: 1) Den funktionelle synaPtic-interaktioner mellem celler, der kræves for pålideligt at understøtte indre netoscillationer med frekvensområdet og profilen af theta-bølger in vivo , 2) den skarpe ændring i den relative fase af theta-oscillation ved niveauet af stratumpyramidale, 3) den rumlige fordeling og kohærens af theta Oscillation i hippocampus og dens interaktion med lokale gammafrekvensrytmer, 4) Amplitudfaseforholdet mellem theta / gamma bølger og 5) Den specifikke tidsmæssige tilknytning af hovedcellens og interneuronfyring med feltpotentiale-theta-oscillationer.
Mens fraværet af ekstern input til hippocampus kan forekomme som en begrænsning til teknikken, tillader det også undersøgelsen af hippocampus interne dynamik på en måde, som ikke kan gøres in vivo . Derudover kan eksterne indgange efterlignes ved optogenetisk stimulering af specifikke fiberterminaler og afferente veje. Intakte præparater giver nye muligheder for at studereHvordan netværksaktiviteter udbreder og interagerer i store netværk med hippocampus og andre tilsluttede strukturer. Som sådan er en hovedanvendelse af den intakte forberedelsesteknik undersøgelsen af funktionelt netværkstilslutning inden for eller mellem hjerneområder. Brug af in vitro intakt hippocampus bør derfor ikke kun give yderligere information om hippocampus cellulære og netværksegenskaber, men også kaste lys på, hvordan disse interagerer for at forme behandling, integration og generering af information i hjernen.
Rytmiske netværksoscillationer involverer den koordinerede elektrokemiske signalering af store neuronale ensembler virker som en central mekanisme til kodning, lagring og overførsel af information inden for og på tværs af hjerneområder. Hippocampale oscillationer anses for at være afgørende for behandling af spatiotemporale informationer, kodning og hukommelse. Omvendt menes hippocampus dysfunktion at være underlagt sygdommeH som Alzheimers sygdom og skizofreni, som er forbundet med ændrede oscillationsmønstre 29 . Som sådan er undersøgelsen af selvgenererede hippocampale oscillationer ved anvendelse af intakte hippocampale præparater blevet et fornyet middel til at belyse grundlæggende egenskaber ved nervesystemfunktionen og dysfunktionen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen konkurrerende kommercielle eller finansielle interesser.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af de canadiske institutter for sundhedsforskning og naturvidenskab.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Sodium Chloride | Sigma Aldrich | S9625 | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S9378 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma Aldrich | S5761 | |
| NaH2PO4 - sodium phosphate monobasic | Sigma Aldrich | S8282 | |
| Magnesium sulfate | Sigma Aldrich | M7506 | |
| Potassium Chloride | Sigma Aldrich | P3911 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma Aldrich | G7528 | |
| Calcium chloride dihydrate | Sigma Aldrich | C5080 | |
| Sodium Ascorbate | Sigma Aldrich | A7631-25G | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Standard Dissecting Scissors | Fisher Scientific | 08-951-25 | brain extraction |
| Scalpel Handle #4, 14 cm | WPI | 500237 | brain extraction |
| Filter forceps, flat jaws, straight (11 cm) | WPI | 500456 | brain extraction |
| Paragon Stainless Steel Scalpel Blades #20 | Ultident | 02-90010-20 | brain extraction |
| Fine Point Curved Dissecting Scissors | Thermo Fisher Scientific | 711999 | brain extraction |
| Teflon (PTFE) -coated thin spatula | VWR | 82027-534 | hippocampal preparation |
| Hayman Style Microspatula | Fisher Scientific | 21-401-25A | hippocampal preparation |
| Lab spoon | Fisher Scientific | 14-375-20 | hippocampal preparation |
| Borosilicate Glass Pasteur Pipets | Fisher Scientific | 13-678-20A | hippocampal preparation |
| Droper | Fisher Scientific | hippocampal preparation | |
| Razor blades Single edged | VWR | 55411-055 | hippocampal preparation |
| Lens paper (4 x 6") | VWR | 52846-001 | hippocampal preparation |
| Glass petri dishes (100 x 20 mm) | VWR | 25354-080 | hippocampal preparation |
| Plastic tray for ice; size 30 x 20 x 5 cm | n.a. | n.a. | hippocampal preparation |
| Single Inline Solution Heater | Warner Instruments | SH-27B | perfusion system |
| Aquarium air stones for bubbling | n.a. | n.a. | perfusion system |
| Tygon E-3603 tubing (ID 1/16 OD 1/8) | Fisherbrand | 14-171-129 | perfusion system |
| Electric Skillet | Black & Decker | n.a. | perfusion system |
| 95% O2/5% CO2 gas mixture (carbogen) | Vitalaire | SG466204A | perfusion system |
| Glass bottles/flasks (4 x 1 L) | n.a. | n.a. | perfusion system |
| Submerged recording Chamber | custom design (FM) | n.a. | Commercial alternative may be used |
| Glass pipettes (1.5/0.84 OD/ID (mm) ) | WPI | 1B150F-4 | electrophysiology |
| Hum Bug 50/60 Hz Noise Eliminator | Quest Scientific | Q-Humbug | electrophysiology |
| Multiclamp 700B patch-clamp amplifier | Molecular devices | MULTICLAMP | electrophysiology |
| Multiclamp 700B Commander Program | Molecular devices | MULTICLAMP | electrophysiology |
| Digital/Analogue converter | Molecular devices | DDI440 | electrophysiology |
| PCLAMP10 | Molecular devices | PCLAMP10 | electrophysiology |
| Vibration isolation table | Newport | n.a. | electrophysiology |
| Micromanipulators (manually operated ) | Siskiyou | MX130 | electrophysiology (LFP) |
| Micromanipulators (automated) | Siskiyou | MC1000e | electrophysiology (patch) |
| Audio monitor | A-M Systems | Model 3300 | electrophysiology |
| Micropipette/Patch pipette puller | Sutter | P-97 | electrophysiology |
| Custom-built upright fluorescence microscope | Siskiyou | n.a. | Imaging |
| Analogue video camera | COHU | 4912-2000/0000 | Imaging |
| Digital frame grabber with imaging software | EPIX, Inc | PIXCI-SV7 | Imaging |
| Olympus 2.5X objective | Olympus | MPLFLN | Imaging |
| Olympus 40X water immersion objective | Olympus | UIS2 LUMPLFLN | Imaging |
| Custom-made Light-Emitting Diode (LED) system | custom | n.a. | optogenetic stimulation (Amhilon et al., 2015) |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Animals | |||
| PV::Cre (KI) mice | Jackson Laboratory | stock number 008069 | Allow Cre-directed gene expression in PV interneurons |
| Constitutive-conditional Ai9 mice (R26-lox-stop-lox-tdTomato (KI)) | Jackson Laboratory | stock number 007905 | Express TdTomato following Cre-mediated recombination |
| Ai32 mice (R26-lox-stop-lox-ChR2(H134R)-EYFP | Jackson Laboratory | stock number 012569 |
Express the improved channelrhodopsin-2/EYFP fusion protein following exposure to Cre recombinase |
| PVChY mice | In house breeding | n.a. | Offspring obtained from cross-breeding the PV-Cre line with Ai32 mice (R26-lox-stop-lox-ChR2(H134R)-EYFP |
References
- Buzsaki, G. Theta rhythm of navigation: link between path integration and landmark navigation, episodic and semantic memory. Hippocampus. 15 (7), 827-840 (2005).
- Sanders, H., Renno-Costa, C., Idiart, M., Lisman, J. Grid Cells and Place Cells: An Integrated View of their Navigational and Memory Function. Trends Neurosci. 38 (12), 763-775 (2015).
- O'Keefe, J., Recce, M. L. Phase relationship between hippocampal place units and the EEG theta rhythm. Hippocampus. 3 (3), 317-330 (1993).
- Winson, J. Loss of hippocampal theta rhythm results in spatial memory deficit in the rat. Science. 201 (4351), 160-163 (1978).
- M'Harzi, M., Jarrard, L. E. Strategy selection in a task with spatial and nonspatial components: effects of fimbria-fornix lesions in rats. Behav Neural Biol. 58 (3), 171-179 (1992).
- Osipova, D., et al. Theta and gamma oscillations predict encoding and retrieval of declarative memory. J Neurosci. 26 (28), 7523-7531 (2006).
- Stumpf, C., Petsche, H., Gogolak, G. The significance of the rabbit's septum as a relay station between the midbrain and the hippocampus. II. The differential influence of drugs upon both the septal cell firing pattern and the hippocampus theta activity. Electroencephalogr Clin Neurophysiol. 14, 212-219 (1962).
- Mitchell, S. J., Ranck, J. B. Generation of theta rhythm in medial entorhinal cortex of freely moving rats. Brain Res. 189 (1), 49-66 (1980).
- Alonso, A., Garcia-Austt, E. Neuronal sources of theta rhythm in the entorhinal cortex of the rat. I. Laminar distribution of theta field potentials. Exp Brain Res. 67 (3), 493-501 (1987).
- Vertes, R. P., Kocsis, B. Brainstem-diencephalo-septohippocampal systems controlling the theta rhythm of the hippocampus. Neuroscience. 81 (4), 893-926 (1997).
- Bland, B. H., Colom, L. V., Konopacki, J., Roth, S. H. Intracellular records of carbachol-induced theta rhythm in hippocampal slices. Brain Res. 447 (2), 364-368 (1988).
- Cobb, S. R., Buhl, E. H., Halasy, K., Paulsen, O., Somogyi, P. Synchronization of neuronal activity in hippocampus by individual GABAergic interneurons. Nature. 378 (6552), 75-78 (1995).
- Williams, J. H., Kauer, J. A. Properties of carbachol-induced oscillatory activity in rat hippocampus. J Neurophysiol. 78 (5), 2631-2640 (1997).
- Chapman, C. A., Lacaille, J. C. Cholinergic induction of theta-frequency oscillations in hippocampal inhibitory interneurons and pacing of pyramidal cell firing. J Neurosci. 19 (19), 8637-8645 (1999).
- Strata, F. Intrinsic oscillations in CA3 hippocampal pyramids: physiological relevance to theta rhythm generation. Hippocampus. 8 (6), 666-679 (1998).
- Kocsis, B., Bragin, A., Buzsaki, G. Interdependence of multiple theta generators in the hippocampus: a partial coherence analysis. J Neurosci. 19 (14), 6200-6212 (1999).
- Fellous, J. M., Sejnowski, T. J. Cholinergic induction of oscillations in the hippocampal slice in the slow (0.5-2 Hz), theta (5-12 Hz), and gamma (35-70 Hz) bands. Hippocampus. 10 (2), 187-197 (2000).
- Gillies, M. J., et al. A model of atropine-resistant theta oscillations in rat hippocampal area CA1. J Physiol. 543 (Pt 3), 779-793 (2002).
- Gloveli, T., et al. Orthogonal arrangement of rhythm-generating microcircuits in the hippocampus. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (37), 13295-13300 (2005).
- Konopacki, J., Eckersdorf, B., Kowalczyk, T., Golebiewski, H. Firing cell repertoire during carbachol-induced theta rhythm in rat hippocampal formation slices. Eur J Neurosci. 23 (7), 1811-1818 (2006).
- Hajos, N., et al. Maintaining network activity in submerged hippocampal slices: importance of oxygen supply. Eur J Neurosci. 29 (2), 319-327 (2009).
- Manseau, F., Goutagny, R., Danik, M., Williams, S. The hippocamposeptal pathway generates rhythmic firing of GABAergic neurons in the medial septum and diagonal bands: an investigation using a complete septohippocampal preparation in vitro. J Neurosci. 28 (15), 4096-4107 (2008).
- Goutagny, R., Jackson, J., Williams, S. Self-generated theta oscillations in the hippocampus. Nat Neurosci. 12 (12), 1491-1493 (2009).
- Jackson, J., Goutagny, R., Williams, S. Fast and slow gamma rhythms are intrinsically and independently generated in the subiculum. J Neurosci. 31 (34), 12104-12117 (2011).
- Amilhon, B., et al. Parvalbumin Interneurons of Hippocampus Tune Population Activity at Theta Frequency. Neuron. 86 (5), 1277-1289 (2015).
- Huh, C. Y., et al. Excitatory Inputs Determine Phase-Locking Strength and Spike-Timing of CA1 Stratum Oriens/Alveus Parvalbumin and Somatostatin Interneurons during Intrinsically Generated Hippocampal Theta Rhythm. J Neurosci. 36 (25), 6605-6622 (2016).
- Gu, N., et al. NMDA-dependent phase synchronization between septal and temporal CA3 hippocampal networks. J Neurosci. 33 (19), 8276-8287 (2013).
- Jackson, J., et al. Reversal of theta rhythm flow through intact hippocampal circuits. Nat Neurosci. 17 (10), 1362-1370 (2014).
- Gonzalez-Burgos, G., Lewis, D. A. GABA neurons and the mechanisms of network oscillations: implications for understanding cortical dysfunction in schizophrenia. Schizophr Bull. 34 (5), 944-961 (2008).
