Summary
Qui presentiamo un protocollo per registrare la teoria ritmica della rete neuronale e le oscillazioni gamma da una preparazione interamente isolata di ippocampo. Descriviamo le fasi sperimentali dall'estrazione dell'ippocampo ai dettagli del campo, delle registrazioni a blocchi di patch patch unitari e intere cellule, nonché della stimolazione ottogenetica del ritmo theta.
Abstract
Questo protocollo descrive le procedure per la preparazione e la registrazione dall'ippocampo intero isolato, dai topi transgenici e dai topi transgenici, nonché dai recenti miglioramenti nelle metodologie e nelle applicazioni per lo studio delle oscillazioni. Viene presentata una semplice caratterizzazione della preparazione ippocampale isolata, in cui viene analizzata la relazione tra oscillatori ippocampali theta e l'attività delle cellule piramidali e degli interneuroni GABAergici delle aree cornu ammonis-1 (CA1) e subiculum (SUB). Nel complesso mostriamo che l'ippocampo isolato è in grado di generare oscillazioni di theta intrinseche in vitro e che la ritmicità generata all'interno dell'ippocampo può essere manipolata in modo preciso dalla stimolazione ottogenetica di interneuroni parvalbuminici (PV). Il preparato ippocampo isolato in vitro offre un'occasione unica per utilizzare registrazioni simultanee di campo e intracellulari da un patch-clamp da identificazioni visivamente identificatePer capire meglio i meccanismi che sottendono alla generazione del ritmo theta.
Introduction
Le oscillazioni di theta ippocampali (4-12 Hz) sono tra le forme più prevalenti di attività ritmica nel cervello dei mammiferi e si credono a svolgere ruoli chiave nelle funzioni cognitive quali elaborazione di informazioni spaziali e formazione di memorie episodiche 1 , 2 , 3 . Mentre diversi studi in vivo che evidenziano il rapporto delle cellule place-theta modulate con studi di navigazione spaziale e lesioni, nonché prove cliniche, supportano la visione che le oscillazioni ippocampali sono coinvolte nella formazione della memoria 4 , 5 , 6 , i meccanismi associati Con generazione di oscillazioni theta ippocampali non sono ancora completamente compresi. Le prime indagini in vivo suggerivano che l'attività theta dipendesse principalmente da oscillatori estrinseci, in particolare l'ingresso ritmicoDa strutture cerebrali afferenti come il settto e la corteccia entorhina 7 , 8 , 9 , 10 . È stato anche postulato un ruolo per fattori intrinseci - connettività interna delle reti neuronali ippocampali insieme alle proprietà dei neuroni ippocampali - in base alle osservazioni in vitro 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 . Tuttavia, a parte alcuni studi di rilievo 19 , 20 , 21 , difficoltà nello sviluppo di approcci che potrebbero replicare attività fisiologicamente realistiche di popolazione in una semplice preparazione di fetta in vitroSono stati, per lungo tempo, ritardato un esame sperimentale più dettagliato delle abilità intrinseche dell'ippocampo e delle aree correlate per auto generare oscillazioni di theta.
Un importante inconveniente dell'insieme sperimentale in vitro di sottile fetta è che l'organizzazione cellulare e sinaptica 3D delle strutture cerebrali è di solito compromessa. Ciò significa che non possono essere supportate molte forme di attività di rete concertata basate su gruppi di cellule distribuite spazialmente, che vanno da gruppi localizzati (≤1 mm radius) alle popolazioni di neuroni diffusi in una o più aree del cervello (> 1 mm). Tenuto conto di queste considerazioni, è stato necessario un approccio diverso per studiare come le oscillazioni di theta emergono nell'ippocampo e si propagino alle strutture di uscita corticali e subcorticali correlate.
Negli ultimi anni, lo sviluppo iniziale della preparazione completa "septo-ippocampale" per esaminare l'intero bidirezionaleLe due delle strutture 22 e la conseguente evoluzione della preparazione "ippocampo isolato" hanno rivelato che le oscillazioni di theta intrinseca si verificano spontaneamente nell'ippocampo privo di input ritmico esterno 23 . Il valore di questi approcci risiede sulla prima comprensione che tutta la struttura funzionale di queste regioni doveva essere conservata per poter funzionare come un ritmo di theta in vitro 22 .
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Protocol
Tutte le procedure sono state eseguite secondo protocolli e linee guida approvate dal comitato McGill University Animal Care e dal Canadian Council on Animal Care.
1. Preparazione acuta di ippocampo in vitro
NOTA: L'isolamento della preparazione ippocampale intatta comporta tre fasi principali: (1) Preparazione di soluzioni e attrezzature, (2) Dissection dell'ippocampo e (3) Impostazione del sistema di velocità di perfusione veloce necessaria per la generazione di oscillazioni theta intrinseca. In questo protocollo, la tempestiva esecuzione delle procedure - dalla dissezione alla registrazione - è particolarmente importante perché l'ippocampo isolato costituisce una preparazione così densa, ma delicata che mantenendo la connettività funzionale della struttura in vitro richiede grande cura. Preparare tutto in anticipo assicura che sia disponibile un livello adeguato di perfusione il più presto possibile per ridurre al minimo la cellula dAmage e mantenere la funzione fisiologica.
- Soluzione cerebrale cerebrale artificiale a base di saccarosio (aCSF)
- Preparare la soluzione di saccarosio a base di 1X da utilizzare per la dissezione e l'incubazione post-dissezione. Combinare tutti i componenti elencati nella Tabella 1, tranne per CaCl 2, in 1 L di acqua deionizzata, e conservare a 4 ° C fino a 2 settimane.
- Soluzione aCSF standard
- Preparare l'aCSF standard per la perfusione di portata elevata dell'ippocampo isolato durante le registrazioni elettrofisiologiche. Per rendere il concentrato (5X) stock aCSF, sciogliere tutti i componenti elencati nella Tabella 2, tranne CaCl 2, in 2 L di acqua deionizzata e conservare a 4 ° C.
- Preparare l'attrezzatura
- Prima di iniziare la dissezione, impostare l'area del banco con un vassoio di plastica riempito di ghiaccio (30 x 20 x 5 cm), linee tubo collegate al carbogeno ePiatti di vetro Petri (10 x 2 cm) (vedi figura 1 ).
- Aggiungere 300 ml di soluzione di saccarosio (scatola 1X) a un bicchiere da 500 ml, bolle con carbogeno (95% O 2 , 5% CO 2 ) e aggiungere Ca 2+ [1,2 mM].
- Trasferire 60 ml di questa soluzione di saccarosio in un piatto di Petri di vetro e lasciare a temperatura ambiente. Mettere il resto in un congelatore da 4 ° C per 10-15 minuti.
- Bolle la soluzione di saccarosio ghiacciata con carbogen durante la dissezione.
- Riempire un secondo piatto di Petri (camera fredda di tenuta) con la soluzione di saccarosio (4 ° C) e mantenerlo in ghiaccio.
- Aggiungere 30 ml di soluzione di saccarosio ghiacciata a un bicchiere da 50 ml.
2. Tutta la dissezione dell'ippocampo
NOTA: Il metodo per la dissezione dell'ippocampo isolato è sostanzialmente identico a quello sviluppato e descritto in origine 22 , ma con ulteriori dettagli e modifiche riguardanti il peVelocità di rotazione e tecniche di registrazione.
- Dissezione cerebrale
- Anestetizzare il mouse (P20 - 35) sotto un cappuccio con un piccolo tovagliolo di carta imbevuto di 1 ml di isoflurano (100%) che viene aggiunto alla gabbia.
- Decapitate il mouse anestetizzato e immergete rapidamente la testa in soluzione di saccarosio ghiacciata (bicchiere da 50 ml, ~ 5 s). Trasferire su un tovagliolo di carta.
- Utilizzare un bisturi per effettuare un'incisione mediale della pelle (caudale al rostral) e spingere la pelle ai lati per esporre il cranio.
- Tagliare il cranio con una piccola forbice e utilizzare una spatola per estrarre rapidamente il cervello e farlo cadere nel piatto di Petri contenente soluzione ghiacciata di saccarosio. Lasciare 1-2 minuti per raffreddare il cervello.
- Mentre il cervello sta recuperando, aggiungere 2 - 3 ml di soluzione di saccarosio su un foglio di carta coperto Petri (dissection) piatto sul ghiaccio.
- Isolamento dell'ippocampo
- Posizionare il cervello sul piatto di dissezione in posizione positivan.
- Rimuovere il cervelletto e la corteccia frontale con una lama di rasoio. Tagliare il cervello a metà lungo il piano midsagittale e restituire i due emisferi isolati alla camera di contenimento. Permettono un ulteriore 1 - 2 min per il recupero.
- Posizionare il cervello singolo emisfero in posizione verticale sul piatto di dissezione.
- Ruotate il piatto finché le strutture midsagittali non si affacciano sull'osservatore e la contorno incorporata del complesso septale è visibile come un sottile strato di pelo a forma di tessuto anteriore al talamo.
- Tenere il cervello cromosomico fisso con la microspatola e mettere la piccola estremità della spatola rivestita con PTFE (politetrafluoroetilene) immediatamente dietro (caudale) alla zona septale.
- Inserire la spatola rivestita sotto il setto e spostare la punta fino a raggiungere il piatto di dissezione. Eliminare le fibre che collegano caudalmente l'area septale. Ripetere la stessa operazione lungo il bordo anteriore del setto e tagliare le fibre che si collegano alla parte frontale del cervello.
- Con la spatola che tiene leggermente la parte interna della corteccia appena sopra l'ippocampo in posizione verticale, utilizza la microspatola per abbassare attentamente i nuclei thalamic, ipotalamici e restanti nuclei del gambo cerebrale. Usate la spatola per tagliare e togliere il tessuto estratto.
- Girare l'emisfero isolato sul fianco e identificare il contorno dell'ippocampo.
- Inserire la spatola rivestita nel ventricolo laterale, sotto l'estremità rostrale dell'ippocampo dorsale.
- Tenere la spatola allineata orizzontalmente con il piano midsagittale del cervello ematico e farlo scorrere attraverso il contorno liscio delle pareti ventricolari finché la punta non emerge caudalmente.
- Tieni la spatola sotto l'ippocampo e premete leggermente sulle fibre di collegamento, lungo lo strato interno dove l'ippocampo si unisce alla corteccia sovrapposta. Applicare la microspasta sul lato esterno di questo strato e far scivolare contro la spatola rivestita per tagliare il filo di collegamentoBers.
- Per completare l'estrazione, ruotare il piatto di dissezione e inserire la spatola rivestita sotto l'ippocampo ventrale. Tenga leggermente l'interno della piega corticale con la spatola e taglia attraverso le connessioni entorhinal utilizzando un movimento di taglio contro la microspatola.
NOTA: L'intero complesso septohippocampale può essere rimosso posizionando la spatola rivestita sotto l'intero ippocampo e tirando fuori il tessuto cerebrale rimanente da sotto. - Una volta che l'isolamento è completo, mantenere l'ippocampo appoggiato sul piatto e aggiungere una goccia di soluzione di saccarosio ghiacciata per mantenerlo fresco. Tagliare con cautela qualsiasi residua corteccia e fibre e separare l'ippocampo dal setto applicando delicatamente una lama del rasoio attraverso il fornix.
NOTA: Se le coppie di patch patch devono essere eseguite da celle piramidali (vedi sezione 4.6 Controllo ottogenetico), l'ippocampo isolato può essere tagliato trasversalmente ad un angolo di 45 ° per esporre lo strato piramidale di CA1 ("anglE-cut ") senza compromettere la circuiteria di rete locale nella parte rimanente dell'ippocampo. - Trasferire la preparazione a soluzione a saccarosio a temperatura ambiente e lasciarlo ripristinare per 15 - 30 minuti prima di trasferirla nella camera di registrazione.
3. Impostare la Perfusione veloce per la registrazione dell'Ippocampo Isolato
- Impostare il sistema di perfusione alimentato a gravità per consentire un flusso continuo ad alta velocità di aCSF ossigenato a 20-25 mL / min.
- Preparare in anticipo i fiaschi aCSF (1X) e immergerli in un bagno di riscaldamento (~ 30 ° C) almeno 15 minuti prima dell'inizio dell'esperimento. Accendere il sistema di riscaldamento in linea (30 ° C).
- Utilizzare gorgogliatori acquari e linee tubo collegato ad un serbatoio carbogeno per ossigenare aCSF tutto l'esperimento, e aggiungere CaCl 2 [2 mM] prima dell'inizio della perfusione.
- Arrestare il flusso aCSF e trasferire l'ippocampo nella camera di registrazione utilizzando l'ampioFine di una pipetta di vetro. Lasciare che la preparazione satura di saccarosio si affonda e si deposita in fondo.
- Posizionare la preparazione al centro della camera di registrazione (in linea con l'asse di entrata) con la superficie liscia di CA1 e SUB sulla parte superiore. Stabilizzare l'ippocampo con piccoli pesi alle estremità septali e temporali e riavviare il flusso aCSF.
4. Elettrofisiologia nell'Ippocampo Isolato
- Registrazione extracellulare delle oscillazioni di theta ippocampo in vitro
- Per il monitoraggio extracellulare del potenziale di campo locale (LFP) o l'attività di un singolo gruppo dall'ippocampo isolato in vitro , utilizzare micropipette di vetro (1-3 MΩ) riempite con aCSF. Registri i segnali di potenziale di campo accoppiati a basso rumore con un amplificatore a strappo di gain x1000, filtro a banda in linea da 0,1 a 500 Hz e una frequenza di campionamento di 5-20 kHz.
NOTA: Il microscopio personalizzato utilizzato in questo protocolloÈ dotato di obiettivi bassi (2,5X) e ad alta magnificazione (40X) per una visione a basso ingrandimento dell'ippocampo, nonché la microscopia a raggi infrarossi e l'epifluorescenza per il riconoscimento singolo cellulare. I componenti di questo sistema includono il microscopio a fluorescenza verticale, i cubi dei filtri a fluorescenza, una videocamera analogica e il grabber digitale con software di imaging, una camera di perfusione personalizzata in fase ( figura 2A , inset) e micromanipulatori ad alta precisione per le registrazioni neuronali Collocazione di fibre ottiche. - Utilizzare la fotocamera montata sul microscopio e collegata a un display del computer per controllare la preparazione ippocampale a bassa ingrandimento (2,5x) e verificare rapidamente che non ci siano sottostanti o danni alla superficie esterna. La disposizione orientata diagonalmente di fibre alvee lungo la superficie liscia di CA1 dovrebbe essere visibile ( Figura 2A , insetto ii) quando brilla la luce trasmessa attraverso l'hippocampus.
- Utilizzare l'obiettivo a campo largo di ingrandimento per visualizzare l'ippocampo isolato e il posizionamento degli elettrodi LFP in posizioni di registrazione specifiche.
NOTA: Un disegno della preparazione ippocampale isolato con più elettrodi disposti in diverse posizioni di registrazione è illustrato nella Figura 2A . - Abbassare un elettrodo LFP nel bagno fino a toccare la superficie (alveo) dell'area CA1.
NOTA: in genere produce un transitorio veloce nella registrazione accoppiata ad AC simile a ciò che accade quando l'elettrodo viene a contatto con il supporto di registrazione. Un monitor audio può essere utile per ascoltare il segnale del canale LFP dopo questo passaggio.
NOTA: Spesso, segni precoci di attività appariranno solo dopo 10 - 15 minuti, quindi è importante non avanzare rapidamente nella preparazione. Se dopo questo periodo l'elettrodo LFP di superficie non sta ancora prendendo l'attività, avanzando un po 'più in basso attraverso gli strati oriensE metti in pausa periodicamente per vedere se si crea una qualsiasi forma di attività mentre si avvicina allo strato principale della cellula. Se non viene rilevato nulla dopo altri 5-10 minuti, attentamente tirare l'elettrodo e posizionarlo altrove nella stessa regione. - Avanzate l'elettrodo LFP attraverso lo strato piramidale. Osserva che l'attività di spiking extracellulare inizialmente aumenta in quanto si rileva una scarica unitaria da singoli neuroni (per lo più cellule cestate piramidali e inibitorie). Abbassare ulteriormente l'elettrodo e notare che il picco comincia a sbiadirsi mentre la punta attraversa il radiato. Osservate che una oscillazione della rete chiaramente visibile nella gamma di frequenza theta (4-12 Hz) diventa apparente e raggiunge l'ampiezza massima (~ 100 - 300 μV) poiché la posizione di registrazione viene abbassata attraverso il radiato.
- Per il monitoraggio extracellulare del potenziale di campo locale (LFP) o l'attività di un singolo gruppo dall'ippocampo isolato in vitro , utilizzare micropipette di vetro (1-3 MΩ) riempite con aCSF. Registri i segnali di potenziale di campo accoppiati a basso rumore con un amplificatore a strappo di gain x1000, filtro a banda in linea da 0,1 a 500 Hz e una frequenza di campionamento di 5-20 kHz.
- Oscillazioni Theta in una singola regione
- Per testare le proprietà spaziali delle oscillazioni theta spontanee attraverso la regione CA1, posizionare la punta oFa l'elettrodo LFP di riferimento in un sito CA1 mediale (posizionato medialmente lungo l'asse septo-temporale longitudinale) e abbassarlo nella radiata come descritto in precedenza.
- Inserire un secondo elettrodo LFP in un sito CA1 (sezionato da 200 a 800 μm o temporale dal primo LFP) e osservare che le oscillazioni di CA1 possono essere sincronizzate su distanze relativamente grandi.
- Oscillazioni Theta attraverso strati
- Per testare le proprietà delle oscillazioni theta attraverso gli strati ippocampali, lasciare un elettrodo LFP di riferimento in un sito di radiotum CA1. Partendo da appena sopra gli strati di oriens, abbassare un secondo elettrodo nello strato di cellule piramidali, e attraverso il radiato. Osservare una graduale inversione del segnale LFP (inversione di fase relativa) attraverso lo strato piramidale.
NOTA: per esempi rappresentativi di questi tipi di attività, vedere la Figura 2B . Esempi di profili laminari / profondità e analisi di densità di origine (CSD)Sta illustrando il sito di inversione di fase in ippocampi isolati sono stati pubblicati in precedenza 23 , 24 , 25 .
- Per testare le proprietà delle oscillazioni theta attraverso gli strati ippocampali, lasciare un elettrodo LFP di riferimento in un sito di radiotum CA1. Partendo da appena sopra gli strati di oriens, abbassare un secondo elettrodo nello strato di cellule piramidali, e attraverso il radiato. Osservare una graduale inversione del segnale LFP (inversione di fase relativa) attraverso lo strato piramidale.
- Oscillazioni gamma e accoppiamento theta-gamma nell'ippocampo intatto
- Posizionare un elettrodo del campo al bordo CA1 / SUB e abbassarlo finché non si posiziona sull'interfaccia tra gli strati piramidali e molecolari. A questo livello, un potenziale di campo che visualizza oscillazioni gamma chiare con variazioni di ampiezza che possono essere registrate dal blocco di fase al ritmo locale di theta 24 . Regolare la scala per osservare la scala temporale lenta dell'accoppiamento theta-gamma. Si noti che le bande gamma si verificano in due distinte bande di frequenza, che possono essere rivelate mediante filtraggio a banda passante, filtrando il segnale LFP in corso nell'ampliamento lento (25-50 Hz) e gamma veloce (150-250 Hz) (vedere la figura 2C per il rappresentante filtrato tracce).
- Registrazione di morsetti per patch intere cellule durante oscillazioni theta ippocampali in vitro
NOTA: In questa parte del protocollo, l'obiettivo è quello di ottenere registrazioni di clamp di patch a cellule visivamente guidate da interneuroni identificati in ippocampi isolati da topi PV-TOM transgenici che esprimono la proteina fluorescente, tdTomato, sotto il controllo del promotore PV Maggiori dettagli vedere i materiali e Rif 26 ).- Utilizzare microscopia video a fluorescenza con ingrandimento basso (2,5X) e potenza elevata (40X) per visualizzare i interneuridi tdTomato positivi situati vicino alla superficie di una preparazione ippocampale da un topo PV-TOM ( Figura 3 ). Si noti che mentre i neuroni PV-TOM possono essere visualizzati con successo e mirati per la patch attraverso l'alveo (fino a 100 μm), le cellule piramidali non fluorescenti possono essere raggiunte anche relativamente facilmente quando l'ippocampo viene preparato con la tecnica di taglio ad angolo (vedere Sezione 2.2.14 nota).
- Sotto la vista a ingrandimento a bassa dell'ippocampo, posizionare un elettrodo LFP in CA1 / SUB per monitorare le oscillazioni di theta durante la preparazione per esperimenti di morsetti patch.
- Passare a 40x ingrandimento e immergere l'obiettivo sulla regione di destinazione; Abbassarlo finché gli strati superiori diventano visibili. Manipolare la posizione del microscopio per garantire un sufficiente accesso aperto per l'applicazione della pipetta patch dal lato opposto.
- Sotto la microscopia a fluorescenza, selezionare una cellula fluorescente PV-TOM e avvicinarla con una pipetta patch (2 - 3 MΩ) riempita con soluzione standard intracellulare.
- Utilizzare un boccaglio per applicare pressione positiva alla pipetta e monitorare la resistenza quando l'elettrodo viene abbassato sulla cella. Quando la punta incontra la cella bersaglio, la resistenza della pipetta aumenta e una fessura chiara appare come pressione positiva spinge sulla membrana. Rilasciare la pressione e verificare che l'impulso attuale si appiattisca come una guarnizione inizia a formarsi. Immediatamente clAmplificatore ad un potenziale iperpolarizzato (-70 mV) e una volta ottenuta una sigillatura GΩ, rottura la membrana cellulare con una piccola quantità di pressione negativa applicata attraverso il porta pipetta.
- Una volta nella configurazione a cellule intere, esaminare le proprietà fisiologiche della cellula PV identificata durante oscillazioni ippocampali spontanei ( Figura 3B ).
- Osservare che la registrazione delle potenzialità delle membrane intracellulari dalle cellule fotovoltaiche è caratterizzata da comportamenti rapidi e da bursts di potenziali d'azione sincronizzati con il ritmo continuo di CA1 / SUB.
- Passare al morsetto di tensione e tenere la cella a diversi potenziali della membrana per caratterizzare il rapporto delle correnti sinaptiche eccitatrici e inibitorie generate dall'attività intrinseca ritmica. Un esempio di registrazione di morsetti di patch da una cella piramidale è mostrato nella Figura 3A per il confronto.
- Controllo ottogenetico nell'ippocampo isolato NOTA: Per il controllo ottogenetico dell'attività di rete ippocampale, viene utilizzata una strategia specifica di tipo cellulare che coinvolge l'attivazione ritmica delle cellule GABAergiche contenenti PV, poiché queste cellule sono state mostrate per svolgere un ruolo importante nella sincronizzazione delle popolazioni delle cellule principali nell'ippocampo isolato 25 . L'espressione selettiva del channelrhodopsin-2 (ChR2) eccitatorio nelle cellule PV è ottenuta attraversando la linea del mouse di PV-Cre con topi che esprimono costantemente ChR2 Cre-dipendente (Ai32), generando così i topi PV-ChY. In alternativa, i costruttori di virus virali ( es . AAVdj-ChETA-eYFP) possono essere iniettati nell'ippocampo dei topi PV-Cre o PV-TOM (P15-16) per guidare l'espressione dell'opsina eccitatoria negli interneuroni CA1 / SUB ( Figura 4A ).
NOTA: Questa strategia è stata descritta in precedenza 25 .- Posizionare un elettrodo LFP nell'area CA1 / SUB e patch una cella piramidale vicina nell'ippo isolatoAmpio di un topo che esprime l'opsina eccitatorica sensitiva blu-chiara ChR2 negli interneuroni fotovoltaici.
- Posizionare una guida ottica di fibre ottiche (diametro 0,2 - 1 mm) sopra la preparazione ippocampale e centrarla sulla regione registrata. Usare la luce blu (473 nm) da una sorgente a LED per la stimolazione ottogenetica, composta da impulsi di luce (10-20 ms, innescato da un segnale di transistor-transistore logico) o comandi di tensione sinusoidale erogati alle frequenze di tensione (4-12 Hz).
NOTA: L'assemblaggio personalizzato di stimolazione luminosa a LED è stato descritto altrove 25 . - Passare alla pinza corrente e caratterizzare l'attività della piramide durante le oscillazioni spontanee theta.
- Avviare il protocollo di stimolazione e registrare le risposte di luce. Tenendo presente che le oscillazioni di campo e l'attività sinaptica nel neurone registrato diventano sempre più sincronizzate durante la stimolazione ottogenetica e che la stimolazione ritmica delle cellule PV produce un controllo robusto di entrambe le frequenzeEncy e potenza delle oscillazioni theta ( Figura 4 ).
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Representative Results
Questa sezione illustra esempi di risultati che possono essere ottenuti studiando le oscillazioni di theta nella preparazione ippocampale isolata in mouse in vitro . La procedura di dissezione per estrarre l'ippocampo isolato è illustrata in Figura 1 . Utilizzando questa preparazione, le oscillazioni di theta intrinseca possono essere esaminate durante il posizionamento di elettrodi di campo multiplo, registrando l'attività complessiva e gli ingressi sinaptici sincroni a popolazioni neuronali in diverse regioni e strati dell'ippocampo isolato ( Figura 2 ). Sono stati presentati risultati rappresentativi di morsetti di patch a cellule simultanee e registrazioni extracellulari per caratterizzare le proprietà di cottura e sinaptiche di tipi specifici di cellule durante oscillazioni ita ippocampali ( Figura 3 ), nonché durante la manipolazione ottogenetica dell'attività ritmica (G "> Figura 4).
Figura 1: Procedura di dissezione per la preparazione isolata di ippocampo intatto.
(A) Veduta generale del setup dissezione. In alto a destra: bottiglia di soluzione di saccarosio ghiacciata ghiacciata (1); In basso a sinistra: vassoio di plastica riempito di ghiaccio (2) tenendo il piatto di dissezione coperto con la carta dell'obiettivo (3); La camera di contenimento a freddo contenente la soluzione di saccarosio (4); E un set di strumenti chirurgici (5). ( B ) Vista del cervello del mouse prima dell'emisezione sul piatto di dissezione. ( C ) Recupero del cervello emisferito nella camera di ritenzione fredda e vista ingrandita (insetto) dell'emisfero sinistro del cervello prima di inserire la piccola estremità della spatola rivestita sotto il setto. ( D ) Spatola rivestita posta sotto l'ippocampo isolato, lungo la regione CA1 / SUB, con il restante cervelloIl tessuto è tirato fuori da sotto. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Configurazione dell'installazione per la registrazione in vitro Theta oscillazioni dalla preparazione ippocampale intatta nella camera di registrazione sommersa.
(A) L'ippocampo isolato è mostrato con un layout di regioni ippocampali ed elettrodi multipli disposti in quattro diversi siti di registrazione distribuite septotemporally (indicata da un asterisco bianchi). Nella vista della piattaforma della camera di registrazione mostrata sopra (inserto i), l'ingresso e l'uscita per il flusso di perfusione rapida sono indicati con i numeri (1, 2). Nell'immagine ingrandita dell'ippocampo mostrato di seguito (inset ii), un singolo elettrodo è posto nella metàCA1 sepetotemporal e le fibre dell'alveo sono facilmente visibili, in diagonale verso il sotticulum. S: septale, T: temporale, f / fx: fimbria-fornix. ( B ) Rappresentazione schematica dell'organizzazione di strati CA1 con tracce rappresentative di LFP registrate simultaneamente dagli strati di oriens (grigio) e stratum radiatum (nero). Si noti la fase invertita dei segnali tra i due strati. Alv: stratum alveus, PR: stratum pyramidale, SR: stratum radiatum. SLM: Stratum Lacunosum Moleculare. ( C ) Esempio di traccia LFP che mostra l'oscillazione spettanea di theta registrata dall'area CA1 / SUB (segmento di 20 sec) e segmenti espansi di 2 secondi (sotto) dal segnale non filtrato; Banda passata filtrata per le frequenze theta (0,5-12 Hz); Gamma lenta (25-55 Hz); E gamma veloce (125 - 250 Hz). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Attività specifica di cellule della cellula piramidale e dell'Interneuron PV durante oscillazioni spontanee di Theta nella preparazione ippocampale intatta da un topo PV-TOM.
(A) Synaptic attività registrata da una cellula piramidale durante theta oscillazioni. Le tracce di bloccaggio delle correnti (pannello sinistro) mostrano spartizione spontanea, ma non ritmica, e potenziali postinaptici inibitori (iPSP) non sincronizzati sinceramente con l'oscillazione lentamente in fase di LFP. Le registrazioni delle tensioni di tensione (pannello a destra) mostrano che le corrispondenti correnti postinaptiche inibitori (iPSC) hanno il loro potenziale di inversione intorno a -70 mV. ( B ) Attività sinaptica registrata da un interneuron FV fluorescente veloce in fase di oscillazioni. Nel blocco corrente (a sinistra), questa cella è stata spontanea a riposo e è stata fortemente guidata da un ritmo eccitatorioPotenziali stsynaptici (ePSP) che sono stati bloccati con l'oscillazione LFP stabile. Nelle registrazioni di tensione-morsetto (a destra), il potenziale di inversione della corrente postsinaptica eccitatoria era di circa 0 mV. I disegni schemati riportati in alto mostrano la configurazione sperimentale insieme al posizionamento degli elettrodi patch e campo nelle immagini di ingrandimento CA1 / SUB e ad alta (40X) della cella piramidale registrata e dell'interneuron PV fluorescente. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Registrazioni di morsetti di patch localmente potenziali e simultanei da singoli CA1 / SUB piramidali e PV neuroni durante oscillazioni Theta in Spontaneo e Optogenetically nell'Ippocampo Isolato.
(un B ) Caratterizzazione di un neurone piramidale che mostra le proprietà tipiche di Normal-Spiking (top) e l'alta ingrandimento (40x) della cella registrata (in basso). ( C ) Registrazione della corrente-morsetto di campionamento della stessa cella al potenziale membrane depolarizzato (nero) insieme al segnale LFP (grigio) e mostrando IPSP ritmici sincronizzati durante l'oscillazione spontanea (sinistra) e durante la stimolazione luminosa a frequenza theta-frequenza (6 Hz) destra). Il modello di stimolazione della luce (ombreggiatura blu) è rappresentato in cima alle tracce di tensione. D ) Spectrogram e spettri di potenza della forma d'onda LFP prima, durante e dopo una simulazione di luce da 6 Hz (linea di base, stim, post). ( E ) Immagini a basso campo di ingrandimento luminoso e fluorescenti dell'isolatoPreparato ippocampale che mostra la fluorescenza eYFP (in verde) localizzata nella regione CA1 / SUB. ( F ) Caratterizzazione della fase corrente che mostra il comportamento di Fast-Spiking (FS) di un interneuron PV-TOM registrato (immagine di fluorescenza 40X di seguito). ( G ) Registrazione del potenziale del membrane che mostra ampie EPSP e la scansione ritmica della cella fotovoltaica sincronizzata con il segnale LFP durante l'oscillazione del campo spontaneo (a sinistra) e durante la stimolazione luminosa (a destra) a 3 Hz. ( H ) Campo di Triggered Field (FTA) di picchi di cellule PV sul segnale CA1 / SUB LFP. La scarica della cella fotovoltaica su più prove (centrata sui picchi LFP) è stata convertita in un FTA di picchi registrati durante oscillazione spontanea (basale) e durante stimolazione luminosa (stim). I grafici al centro e al basso mostrano le trame raster di picchi e istogrammi di probabilità di picco (probabilità media è mostrata in rosso). I grafici più alti mostrano tracciati del segnale LFP medio che aumenta in potenza durante il corso di ligStimolazione in parallelo con la cottura altamente sincronizzata della fase a celle fotovoltaiche bloccata al picco dell'oscillazione LFP. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| SOLUZIONE DI SUCROSE (1X) PER HIPPOCAMPUS ISOLATO | |||
| (Soluzione madre) | |||
| Composto | MW | Final Conc. (mM) | Importo per 1 L (g) |
| saccarosio | 342,3 | 252 | 86,26 g |
| NaHCO 3 | 84.01 | 24 | 2,020 g |
| glucosio | 180,2 | 10 | |
| KCl | 74.55 | 3 | 0,223 g |
| MgSO 4 | 120.4 | 2 | 0,241 g |
| NaH 2 PO 4 | 120 | 1.25 | 0,150 g |
| CaCl 2, 2 H 2 O [1 M] | 147 | 1.2 | 120 μL / 0,1 L * |
| * Aggiungere 360 ml di CaCl 2 [1 M] per 0,3 L di saccarosio soluzione ossigenata | |||
| PH = 7.4 quando ossigenato, Osm 310-320 | |||
Tabella 1.
| SOLUZIONE STANDARD ACSF (5X) PER LA PERFUSIONE | |||
| (Soluzione madre) | |||
| Composto | MW | Final Conc. (mM) | Importo per 2 L 5X |
| NaCl | 58,44 | 126 | 73,6 |
| NaHCO 3 | 84.01 | 24 | 20.2 |
| glucosio | 180,2 | 10 | 18 |
| KCl | 74.55 | ♦ 4.5 | 3.355 |
| MgSO 4 | 120.4 | 2 | 2.41 |
| NaH 2 PO 4 | 120 | 1.25 | 1.5 |
| ascorbato | 176,1 | 0.4 | 0,705 |
| CaCl 2, 2 H 2 O [1 M] | 147 | 2 | 2 mL / L * |
| * Aggiungere 2 ml di CaCl 2 [1 M] per 1 L aCSF (1x) soluzione ossigenata | |||
| PH = 7.4 quando ossigenato, Osm 310-320 | |||
| ♦ Una soluzione leggermente elevata [K + ] o è utilizzata per questa soluzione aCSF (rispetto al normale aCSF 2,5 mM KCl) per aumentare l'eccitabilità delle reti ippocampali e facilitare l'emersione delle oscillazioni di theta. | |||
Tavolo 2.
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Discussion
Mentre le registrazioni elettrofisiologiche da fette acute di ippocampo costituiscono una tecnica standard in vitro , i metodi presentati qui differiscono sostanzialmente dal metodo classico. A differenza delle preparazioni sottili di fetta dove sono visibili strati cellulari specifici sulla superficie e possono essere esaminati direttamente, i preparati ippocampali intatti sono più simili alle configurazioni in vivo in cui gli elettrodi vengono abbassati in regioni cerebrali mirate attraversando singoli livelli. L'integrità dell'ippocampo è preservata insieme alla connettività funzionale e alle proprietà delle popolazioni neuronali locali. Questo fornisce uno strumento complesso e potente per indagare le piccole e grandi scala oscillanti di rete nell'ippocampo. Ad esempio, la combinazione di circuiti prefabbricati e proprietà specifiche di tipo cellulare nella rete produce le tonalità ritmiche teatiche e oscillanti gamma che nascono in modo spontaneo che imitano le caratteristiche importanti dell'ippaAttività mpal in vivo . Utilizzando i metodi presentati in questo protocollo, l'ippocampo può essere estratto rapidamente dal cervello del roditore e rimanere in vita per diverse ore in un ambiente aCSF in rapido flusso. Le tecniche elettrofisiologiche di base sono facilmente applicate per indagare come l'attività sincrona e la funzione sinaptica di specifici tipi neuronali influenzano la dinamica ippocampale.
La nostra procedura ha fornito la prima opportunità di esplorare sistematicamente le dinamiche delle oscillazioni potenziali del campo locale in tutto l'asse septo-temporale (dorso-ventrale) dell'ippocampo in vitro (cfr. Rif. 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27 , 28 ). A livello di rete e livelli fisiologici, la preparazione intatta conserva: 1) la syna funzionaleInterazioni ptic tra cellule necessarie per supportare in modo affidabile le oscillazioni della rete intrinseca con la gamma di frequenza e il profilo delle onde theta in vivo , 2) la forte alterazione della fase relativa della oscillazione theta a livello dello stratum piramidale, 3) la distribuzione spaziale e la coerenza delle theta Oscillazione nell'ippocampo e la sua interazione con i ritmi di frequenza gamma locale, 4) la relazione ampiezza-fase delle onde / the gamma e 5) l'associazione temporale specifica della cella principale e dell'interneuron con oscillazioni di potenziale del campo.
Mentre l'assenza di input esterni all'ippocampo può apparire come una limitazione alla tecnica, consente anche lo studio delle dinamiche interne dell'ippocampo in un modo che non può essere fatto in vivo . Inoltre, gli input esterni possono essere imitati dalla stimolazione ottogenetica di terminali di fibra specifici e di percorsi afferenti. Le preparazioni intatte offrono nuove possibilità di studioCome le attività di rete si propagano e interagiscono in reti su larga scala che coinvolgono l'ippocampo e altre strutture connesse. In quanto tale, un'applicazione principale della tecnica di preparazione intatta è l'indagine della connettività di rete funzionale all'interno o tra le regioni del cervello. Utilizzando l'ippocampo in vitro intatto non dovrebbe solo fornire ulteriori informazioni sulle proprietà cellulari e di rete dell'ippocampo, ma anche dare luce su come questi interagiscono per formare l'elaborazione, l'integrazione e la generazione di informazioni all'interno del cervello.
Le oscillazioni ritmiche della rete che coinvolgono la segnalazione elettrochimica coordinata di grandi gruppi neuronali agiscono come un meccanismo centrale per la codifica, la memorizzazione e il trasferimento di informazioni all'interno e tra le aree del cervello. Le oscillazioni dell'ippocampo sono ritenute cruciali per l'elaborazione di informazioni, codifica e memoria spatiotemporali. Al contrario, la disfunzione ippocampale è considerata come base di disordiniH come la malattia di Alzheimer e la schizofrenia, che sono associati a alterati modelli di oscillazione 29 . In quanto tale, lo studio delle oscillazioni ippocampali auto-generate utilizzando preparati ippocampali intatti è diventato un mezzo rinnovato per chiarire le proprietà fondamentali della funzione del sistema nervoso e della disfunzione.
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Disclosures
Gli autori non dichiarano alcun interesse commerciale o finanziario concorrente.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto dagli Istituti Canadesi di Salute e Scienze Naturali.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Sodium Chloride | Sigma Aldrich | S9625 | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S9378 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma Aldrich | S5761 | |
| NaH2PO4 - sodium phosphate monobasic | Sigma Aldrich | S8282 | |
| Magnesium sulfate | Sigma Aldrich | M7506 | |
| Potassium Chloride | Sigma Aldrich | P3911 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma Aldrich | G7528 | |
| Calcium chloride dihydrate | Sigma Aldrich | C5080 | |
| Sodium Ascorbate | Sigma Aldrich | A7631-25G | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Standard Dissecting Scissors | Fisher Scientific | 08-951-25 | brain extraction |
| Scalpel Handle #4, 14 cm | WPI | 500237 | brain extraction |
| Filter forceps, flat jaws, straight (11 cm) | WPI | 500456 | brain extraction |
| Paragon Stainless Steel Scalpel Blades #20 | Ultident | 02-90010-20 | brain extraction |
| Fine Point Curved Dissecting Scissors | Thermo Fisher Scientific | 711999 | brain extraction |
| Teflon (PTFE) -coated thin spatula | VWR | 82027-534 | hippocampal preparation |
| Hayman Style Microspatula | Fisher Scientific | 21-401-25A | hippocampal preparation |
| Lab spoon | Fisher Scientific | 14-375-20 | hippocampal preparation |
| Borosilicate Glass Pasteur Pipets | Fisher Scientific | 13-678-20A | hippocampal preparation |
| Droper | Fisher Scientific | hippocampal preparation | |
| Razor blades Single edged | VWR | 55411-055 | hippocampal preparation |
| Lens paper (4 x 6") | VWR | 52846-001 | hippocampal preparation |
| Glass petri dishes (100 x 20 mm) | VWR | 25354-080 | hippocampal preparation |
| Plastic tray for ice; size 30 x 20 x 5 cm | n.a. | n.a. | hippocampal preparation |
| Single Inline Solution Heater | Warner Instruments | SH-27B | perfusion system |
| Aquarium air stones for bubbling | n.a. | n.a. | perfusion system |
| Tygon E-3603 tubing (ID 1/16 OD 1/8) | Fisherbrand | 14-171-129 | perfusion system |
| Electric Skillet | Black & Decker | n.a. | perfusion system |
| 95% O2/5% CO2 gas mixture (carbogen) | Vitalaire | SG466204A | perfusion system |
| Glass bottles/flasks (4 x 1 L) | n.a. | n.a. | perfusion system |
| Submerged recording Chamber | custom design (FM) | n.a. | Commercial alternative may be used |
| Glass pipettes (1.5/0.84 OD/ID (mm) ) | WPI | 1B150F-4 | electrophysiology |
| Hum Bug 50/60 Hz Noise Eliminator | Quest Scientific | Q-Humbug | electrophysiology |
| Multiclamp 700B patch-clamp amplifier | Molecular devices | MULTICLAMP | electrophysiology |
| Multiclamp 700B Commander Program | Molecular devices | MULTICLAMP | electrophysiology |
| Digital/Analogue converter | Molecular devices | DDI440 | electrophysiology |
| PCLAMP10 | Molecular devices | PCLAMP10 | electrophysiology |
| Vibration isolation table | Newport | n.a. | electrophysiology |
| Micromanipulators (manually operated ) | Siskiyou | MX130 | electrophysiology (LFP) |
| Micromanipulators (automated) | Siskiyou | MC1000e | electrophysiology (patch) |
| Audio monitor | A-M Systems | Model 3300 | electrophysiology |
| Micropipette/Patch pipette puller | Sutter | P-97 | electrophysiology |
| Custom-built upright fluorescence microscope | Siskiyou | n.a. | Imaging |
| Analogue video camera | COHU | 4912-2000/0000 | Imaging |
| Digital frame grabber with imaging software | EPIX, Inc | PIXCI-SV7 | Imaging |
| Olympus 2.5X objective | Olympus | MPLFLN | Imaging |
| Olympus 40X water immersion objective | Olympus | UIS2 LUMPLFLN | Imaging |
| Custom-made Light-Emitting Diode (LED) system | custom | n.a. | optogenetic stimulation (Amhilon et al., 2015) |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Animals | |||
| PV::Cre (KI) mice | Jackson Laboratory | stock number 008069 | Allow Cre-directed gene expression in PV interneurons |
| Constitutive-conditional Ai9 mice (R26-lox-stop-lox-tdTomato (KI)) | Jackson Laboratory | stock number 007905 | Express TdTomato following Cre-mediated recombination |
| Ai32 mice (R26-lox-stop-lox-ChR2(H134R)-EYFP | Jackson Laboratory | stock number 012569 |
Express the improved channelrhodopsin-2/EYFP fusion protein following exposure to Cre recombinase |
| PVChY mice | In house breeding | n.a. | Offspring obtained from cross-breeding the PV-Cre line with Ai32 mice (R26-lox-stop-lox-ChR2(H134R)-EYFP |
References
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