Summary
Her presenterer vi en protokoll for opptak av rytmisk nevronnettverk theta og gamma-svingninger fra et isolert helhippocampalpreparat. Vi beskriver de eksperimentelle trinnene fra utvinning av hippocampus til detaljer om felt-, enhetlig og helcelle patch clamp opptak samt optogenetic pacing av theta rytmen.
Abstract
Denne protokollen skisserer prosedyrene for å forberede og registrere fra den isolerte hele hippocampus, av WT og transgene mus, sammen med nyere forbedringer i metoder og anvendelser for studiet av theta-oscillasjoner. En enkel karakterisering av det isolerte hippocampale preparatet presenteres, hvor forholdet mellom interne hippokampale teta-oscillatorer undersøkes sammen med aktiviteten til pyramidale celler og GABAergiske interneuroner, av cornu ammoni-s (CA1) og subikulum (SUB) områder. Samlet viser vi at den isolerte hippocampus er i stand til å generere indre teta-svingninger in vitro, og at rytmicitet generert i hippocampuset kan manipuleres nøyaktig ved optogenetisk stimulering av parvalbumin-positive (PV) interneuroner. In vitro- isolert hippokamppreparat gir en unik mulighet til å bruke samtidige felt- og intracellulære patch-klemmeopptak fra visuelt identifisert neuRons for bedre å forstå mekanismene som ligger til grund for theta rytmgenerering.
Introduction
Hippokampale theta-oscillasjoner (4-12 Hz) er blant de mest fremtredende former for rytmisk aktivitet i pattedyrs hjernen, og antas å spille nøkkelrolle i kognitive funksjoner som behandling av spatiotemporale opplysninger og dannelse av episodiske minner 1 , 2 , 3 . Mens flere in vivo- studier som fremhever forholdet mellom theta-modulerte stedceller med romlig navigasjon og lesjonstudier, samt klinisk bevis, støtter synspunktet om at hippokampale theta-svingninger er involvert i minnesdannelse 4 , 5 , 6 , mekanismene forbundet med Med generering av hippocampale theta-svingninger er fortsatt ikke fullt ut forstått. Tidlige in vivo undersøkelser foreslo at thetaaktivitet hovedsakelig var avhengig av ekstrinsiske oscillatorer, særlig rytmisk inngangFra afferente hjernestrukturer som septum og entorhinal cortex 7 , 8 , 9 , 10 . En rolle for inneboende faktorer - intern tilkobling av hippokampale nevrale nettverk sammen med egenskapene til hippocampale nevroner - ble også postulert basert på in vitro observasjoner 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 . Men bortsett fra noen få landemerkeundersøkelser 19 , 20 , 21 , vanskeligheter med å utvikle tilnærminger som kunne replikere fysiologisk realistiske populasjonsaktiviteter i enkel in vitro- skiveforberedelseS har lenge forsinket mer detaljert eksperimentell undersøkelse av hippokampusens indre evner og relaterte områder til selv-genererende theta-svingninger.
En viktig ulempe ved standard in vitro tynn-skiveeksperimentell innstilling er at 3D-cellulær og synaptisk organisering av hjernestrukturer vanligvis blir kompromittert. Dette betyr at mange former for samordnet nettverksvirksomhet basert på romlig distribuerte cellesamlinger, fra lokaliserte grupper (≤1 mm radius) til populasjoner av nevroner spredt over en eller flere hjerner (> 1 mm), ikke kan støttes. På grunn av disse overvektene var det nødvendig med en annen type tilnærming for å studere hvordan theta-svingninger dukker opp i hippocampus og propagere til relaterte kortikale og subkortiske utgangsstrukturer.
I de siste årene har den første utviklingen av "komplett septo-hippocampal" -preparatet undersøkt toveisinteraCtions av de to strukturer 22 og den etterfølgende utviklingen av det "isolerte hippocampus" -preparatet har vist at intrinsiske theta-oscillasjoner forekommer spontant i hippocampus som mangler ekstern rytmisk inngang 23 . Verdien av disse tilnærmingene ligger på den innledende innsikt at hele funksjonelle strukturen i disse områdene måtte bevares for å fungere som en teta rytmegenerator in vitro 22 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle prosedyrer er utført i henhold til protokoller og retningslinjer godkjent av McGill University Animal Care Committee og Canadian Council on Animal Care.
1. Akutt Hippocampus In Vitro Preparat
MERK: Isolering av det intakte hippokampepreparatet innebærer tre hovedtrinn: (1) Klargjøring av løsninger og utstyr, (2) Disseksjon av hippocampus og (3) Oppsett av hurtig perfusjonshastighetssystem som er nødvendig for generering av indre teta-svingninger. I denne protokollen er det rett og slett å utføre prosedyrer - fra disseksjon til opptak - spesielt viktig fordi den isolerte hippocampus utgjør en så tett, men delikat forberedelse at vedlikehold av funksjonell tilkobling av strukturen in vitro krever stor omhu. Forbereder alt på forhånd, sikrer at et tilstrekkelig nivå av perfusjon er tilgjengelig så tidlig som mulig for å minimere celle dAmage og opprettholde fysiologisk funksjon.
- Sukrose-basert kunstig cerebral spinalvæske (aCSF) løsning
- Forbered 1X lager sukroseoppløsning som skal brukes til disseksjon og post-disseksjon inkubasjon. Kombiner alle komponenter som er oppført i tabell 1 , unntatt CaCl 2 , i 1 liter deionisert vann, og lagre ved 4 ° C i opptil 2 uker.
- Standard aCSF løsning
- Klargjør standard aCSF for høyflytnings perfusjon av den isolerte hippocampus under elektrofysiologiske opptak. Oppløs alle komponentene oppført i tabell 2 , unntatt CaCl 2 , i 2 liter deionisert vann og lagre ved 4 ° C for å lage den konsentrerte (5X) lager aCSF.
- Forbered utstyret
- Før du starter disseksjonen, sett opp benkområdet med en isfylt plastskuff (30 x 20 x 5 cm), karbonforbindede rørledninger og thrEe glass petriskål (10 x 2 cm) (se figur 1 ).
- Tilsett 300 ml med sukroseløsning (1X lager) til et 500 ml begerglass, boble den med karbogen (95% O2, 5% CO2) og tilsett Ca 2+ [1,2 mM].
- Overfør 60 ml av denne sukroseoppløsningen til en glass-petriskål og la den stå ved romtemperatur. Plasser resten i en 4 ° C fryser i 10-15 min.
- Boble den iskalde sukroseoppløsningen med karbogen gjennom disseksjonen.
- Fyll en ny petriskål (kaldholdig kammer) med sukroseoppløsning (4 ° C) og hold på is.
- Tilsett 30 ml iskald sukroseoppløsning til en 50 ml beger.
2. Hele Hippocampus Disseksjon
MERK: Metoden for dissektering av den isolerte hippocampus er i det vesentlige identisk med den som er utviklet og beskrevet opprinnelig 22 , men med ytterligere detaljer og endringer angående peRfusion rate og opptak teknikker.
- Hjernespredning
- Bedøv musen (P20 - 35) under en avtrekksdeksel med et lite papirhåndkle fuktet med 1 ml isofluran (100%) som legges i buret.
- Dekapitér den bedøvede musen og raskt senk hodet i iskald sukroseoppløsning (50 ml beger, ~ 5 s). Overfør på et papirhåndkle.
- Bruk en skalpell for å lage et medialt hudinnsnitt (caudal til rostral) og press huden på sidene for å utsette kranen.
- Klipp åpne skallen med en liten sakse og bruk en spatel for raskt å trekke ut hjernen og slipp den inn i petriskålen som inneholder iskaldt sukroseoppløsning. Tillat 1-2 minutter for hjernen å avkjøles.
- Mens hjernen er å gjenopprette, legg 2 - 3 ml sukroseoppløsning på en linsepapir dekket Petri (disseksjon) parabolen på is.
- Isolering av hippocampus
- Plasser hjernen på disseksjonsretten i en oppreist stillingn.
- Fjern cerebellum og frontal cortex med et knivblad. Skjær hjernen halvveis langs midsagittalplanet og returner de to isolerte halvkugler til holdekammeret. Tillat ytterligere 1 - 2 min for gjenoppretting.
- Plasser enkelt hemisected hjerne oppreist på disseksjonsretten.
- Roter parabolen inntil midsagittale strukturer står overfor observatøren, og den innebygde konturen av septal-komplekset er synlig som et tynt pæreformet lag av vev fremre for thalamus.
- Hold den hemiseksjonerte hjernen stabil med mikrospatelen og legg den lille enden av polytetrafluoretylen (PTFE) -belagt spatel umiddelbart bak (caudal til) septalområdet.
- Sett den belagte spatelet under septumet og flytt spissen ned til disseksjonsretten er nådd. Fjern fibrene som forbinder septalområdet caudalt. Gjenta den samme operasjonen langs den fremre kanten av septumet og kutt fibrene som forbinder til den fremre delen av hjernen.
- Med spatelen som holder den indre delen av cortexen rett over hippocampus i oppreist stilling, bruk mikrospatelen til å forsiktig trekke ned de thalamiske, hypotalamiske og gjenværende hjernestammen kjerner. Bruk spatelen til å kutte av og fjern det fjernede vevet.
- Vri den isolerte halvkule på sin side og identifiser omrisset av hippocampus.
- Sett den belagte spatelen i sidekammeret, under den røde enden av dorsal hippocampus.
- Hold spatelen i horisontal retning med det midtsagittale flyet til den hemiseksjonerte hjernen og skyv den gjennom den glatte konturen til ventrikulære vegger til spissen kommer fram i caudalt.
- Hold spatelen under hippocampus og trykk det lett på forbindelsesfibrene, langs innsiden, hvor hippocampus knytter seg til den overliggende cortexen. Påfør mikrospatelet på utsiden av dette laget og skyv mot den belagte spatelen for å skjære gjennom tilkoblingsfilenlemmer.
- For å fullføre ekstraksjonen, roter disseksjonsfatet og sett den belagte spatelen under ventral hippocampus. Hold lett innsiden av den kortikale folden med spatelen og kutt gjennom entorhinalforbindelsene ved hjelp av en skivebevegelse mot mikrospatelet.
MERK: Hele septohippocampalkomplekset kan fjernes ved å plassere den belagte spatelen under hele hippocampus og trekke ut det gjenværende hjernevevet fra under. - Når isoleringen er fullført, hold hippocampuset på pannen og legg til en dråpe iskall sukroseoppløsning for å holde det avkjølt. Tøm forsiktig av eventuell gjenværende cortex og fibre og skille hippocampus fra septumet ved forsiktig å påføre et knivblad gjennom fornixen.
MERK: Hvis patch clamp-opptak skal utføres fra pyramidale celler (se avsnitt 4.6 Optogenetisk kontroll), kan den isolerte hippocampus kuttes på tvers av 45 ° vinkel for å eksponere det pyramide lag av CA1 ("anglE-cut "-preparasjon), uten å kompromittere det lokale nettverkskretsene i den gjenværende delen av hippocampus. - Overfør preparatet til romtemperatur sukroseoppløsning og la det gjenopprette i 15 - 30 minutter før overføring til opptakskammeret.
3. Sett opp den raske perfusjonen for opptak av den isolerte hippocampusen
- Sett opp gravitasjonsmatet perfusjonssystem for å muliggjøre kontinuerlig høyhastighets innstrømning av oksygenert aCSF ved 20-25 ml / min.
- Forbered aCSF (1X) kolber på forhånd og senk dem i et oppvarmingsbad (~ 30 ° C) minst 15 minutter før forsøkets start. Slå på in-line-oppvarmingssystemet (30 ° C).
- Bruk akvarium boblere og rør linjer som er koblet til en karbogen tank for å oksygenere aCSF gjennom hele eksperimentet, og tilsett CaCl2 [2 mM] før begynnelsen av perfusjonen.
- Stopp aCSF-strømmen og overfør hippocampus til opptakskammeret ved hjelp av det bredeEnden av en glasspipett. La sukrose-mettet preparat synke og slå seg ned på bunnen.
- Plasser forberedelsen i midten av opptakskammeret (i tråd med innløpsaksen) med den glatte overflaten på CA1 og SUB på toppen. Stabiliser hippocampus med små vekter ved septal og temporale ekstremiteter og start aCSF-strømmen på nytt.
4. Elektrofysiologi i den isolerte hippocampus
- Ekstracellulær registrering av in vitro hippocampale theta-oscillasjoner
- For ekstracellulær overvåkning av lokalfeltpotensial (LFP) eller enkeltenhetsaktivitet fra in vitro- isolert hippocampus, bruk glassmikropipetter (1 - 3 MΩ) fylt med aCSF. Ta opp støyaktige AC-koblede feltpotensielle signaler med en patch clamp forsterker av forsterkning x1000, online bandpass filtrering 0,1 - 500 Hz og en samplingshastighet på 5-20 kHz.
MERK: Det spesialbygde mikroskopet som brukes i denne protokollenEr utstyrt med lav- (2,5x) og høy forstørrelse (40X) mål for lav forstørrelsesvisning av hippocampus, samt infrarød videomikroskopi og epifluorescens for enkeltcellegenkjenning. Komponentene i dette systemet inkluderer det oppreiste fluorescensmikroskopet, fluorescensfilterkubene, et analogt videokamera og en digital rammegraver med bildebehandling, et tilpasset perfusjonskammer på scenen ( figur 2A , innsettet i) og mikrofomanipulatorer med høy presisjon for neuronal opptak og Optisk fiber plassering. - Bruk kameraet montert på mikroskopet og koblet til en dataskjerm for å inspisere hippocampalpreparatet under lav forstørrelse (2.5X), og kontroller raskt at det ikke er noen underkutt eller skade på den ytre overflaten. Det diagonalt orienterte arrangementet av alveusfibre langs den glatte overflaten av CA1 skal være synlig ( figur 2A , innsett ii) når det lyser overført lys gjennom hippocampuss.
- Bruk det lave forstørrelsesbrede feltmålet for å se den isolerte hippocampus og plasseringen av LFP-elektroder i bestemte opptakssteder.
MERK: En utforming av det isolerte hippocampale preparatet med flere elektroder plassert i forskjellige opptakssteder er illustrert i figur 2A . - Senk en LFP-elektrode inn i badekaret til den berører overflaten (alveus) av CA1-området.
MERK: Dette gir vanligvis en rask forbigående i AC-koblet opptak som ligner på hva som skjer når elektroden kommer i kontakt med opptaksmediet. En lydmonitor kan være nyttig for å lytte til LFP-kanalsignalet etter dette trinnet.
MERK: Ofte vil tidlige tegn på aktivitet først vises etter 10-15 minutter, derfor er det viktig å ikke gå raskt inn i preparatet. Hvis etter denne perioden overflaten LFP-elektroden fortsatt ikke plukker opp aktivitet, fortsett litt lenger ned gjennom stratum orienseneOg pause jevnlig for å se om noen form for aktivitet oppstår mens du nærmer deg det primære cellelaget. Hvis ingenting oppdages etter ytterligere 5 - 10 min, trekk elektroden forsiktig opp og plasser den andre steder langs samme område. - Forleng LFP-elektroden gjennom pyramidlaget. Vær oppmerksom på at ekstracellulær spikingaktivitet i utgangspunktet øker etter hvert som enhetsutladning fra individuelle nevroner (for det meste pyramidale og inhibitoriske kurvceller) detekteres. Senk elektroden videre og merk at spiking begynner å falme igjen når spissen krysser inn i radiatumet. Vær oppmerksom på at en tydelig synlig nettverksoscillasjon i teta-frekvensområdet (4-12 Hz) blir tydelig og når maksimal amplitude (~ 100 - 300 μV) da opptaksstedet senkes gjennom radiatum.
- For ekstracellulær overvåkning av lokalfeltpotensial (LFP) eller enkeltenhetsaktivitet fra in vitro- isolert hippocampus, bruk glassmikropipetter (1 - 3 MΩ) fylt med aCSF. Ta opp støyaktige AC-koblede feltpotensielle signaler med en patch clamp forsterker av forsterkning x1000, online bandpass filtrering 0,1 - 500 Hz og en samplingshastighet på 5-20 kHz.
- Theta-svingninger på tvers av en enkelt region
- For å teste de spatane egenskapene til spontane theta-svingninger over CA1-regionen, plasser spissen oFa referanse LFP elektrode i et medial CA1-område (medialt plassert langs den langsgående septotemporale akse) og senke den inn i radiatumet som beskrevet tidligere.
- Plasser en annen LFP-elektrode i et CA1-område (200 - 800 μm septal eller temporal fra den første LFP) og observer at CA1 theta-svingninger kan synkronisere over relativt store avstander.
- Theta-svingninger på tvers av lagene
- For å teste egenskapene til theta-oscillasjoner over hippocampale lag, la en referanse LFP elektrode i et CA1 radiatum sted. Start fra like over stratum oriensene, senk en andre elektrode inn i pyramidalcellelaget, og gjennom radiatumet. Se på en gradvis inversjon av LFP-signalet (relativ fase reversering) over det pyramide lag.
MERK: For representative eksempler på disse typer aktivitet, se figur 2B . Eksempler på laminar / dybdeprofiler og Current Source Density (CSD) analyseEr å illustrere stedet for fase reversering i isolert hippocampi har blitt publisert tidligere 23 , 24 , 25 .
- For å teste egenskapene til theta-oscillasjoner over hippocampale lag, la en referanse LFP elektrode i et CA1 radiatum sted. Start fra like over stratum oriensene, senk en andre elektrode inn i pyramidalcellelaget, og gjennom radiatumet. Se på en gradvis inversjon av LFP-signalet (relativ fase reversering) over det pyramide lag.
- Gamma oscillasjoner og theta-gamma kobling i den intakte hippocampus
- Plasser en feltelektrode ved CA1 / SUB-grensen og senk den inntil den sitter ved grensesnittet mellom pyramidale og molekylære lag. På dette nivået kan et feltpotensial som viser klare gamma-svingninger med endringer i amplitude som faselås til lokal theta-rytme, registreres 24 . Juster skalering for å observere den langsomme tidsskalaen for teta-gamma-koblingen. Legg merke til at gamma-brister forekommer i to forskjellige frekvensbånd, som kan avsløres ved bandpass-filtrering av det pågående LFP-signalet i det langsomme (25 - 50 Hz) og raske gammaområdet (150-250 Hz) (se figur 2C for representert filtrert traser).
- Hele-celle patch clamp opptak under in vitro hippokampale theta oscillasjoner
MERK: I denne delen av protokollen er målet å oppnå visuelt styrte helcellepatchklemmeopptak fra identifiserte interneuroner i isolert hippocampi fra transgene PV-TOM-mus som uttrykker det fluorescerende protein, tdTomato, under kontroll av PV-promotoren (for Flere detaljer se materialer og ref 26 ).- Bruk fluorescensvideo-mikroskopi med lav (2,5x) og høy effekt (40x) forstørrelse for å visualisere tdTomato-positive interneuroner som ligger nær overflaten av et hippocampalt preparat fra en PV-TOM-mus ( figur 3 ). Vær oppmerksom på at mens PV-TOM-neuroner med suksess kan visualiseres og målrettes for patch gjennom alveen (opp til 100 μm), kan ikke-fluorescerende pyramidale celler nås relativt enkelt når hippocampus er forberedt med vinkelsnitteknikken (se Seksjon 2.2.14 notat).
- Under lav forstørrelsesvisning av hippocampus, plasser en LFP-elektrode i CA1 / SUB for å overvåke theta-oscillasjoner mens du forbereder for patch clamp-eksperimenter.
- Bytt til 40X forstørrelse og fordyp målet over målområdet; Senk det til de øverste lagene blir synlige. Manipuler mikroskopets posisjon for å sikre tilstrekkelig åpen tilgang for patchpipett-tilnærming fra motsatt side.
- Under fluorescensmikroskopi velger du en fluorescerende PV-TOM-celle og nærmer den med en patchpipett (2 - 3 MΩ) fylt med standard intracellulær løsning.
- Bruk et munnstykke til å påføre lett positivt trykk på pipetten og overvåke motstanden da elektroden senkes ned på cellen. Når tippen møter målcellen, øker pipettmotstanden og det kommer et klart dunkel som et positivt trykk presser på membranen. Frigjør trykket og kontroller at den aktuelle pulsen flater når en segl begynner å danne. Umiddelbart klForsterker til et hyperpolarisert potensial (-70 mV), og når en GΩ-tetning er oppnådd, ødelegge cellemembranen med en liten mengde negativt trykk påført gjennom pipettholderen.
- En gang i helcellekonfigurasjon, undersøke de fysiologiske egenskapene til identifisert PV-celle under spontane hippocampale oscillasjoner ( Figur 3B ).
- Vær oppmerksom på at intracellulær membranpotensial opptak fra PV-celler kjennetegnes av hurtigsprekkende oppførsel og utbrudd av virkningspotensialer synkronisert med den pågående CA1 / SUB-theta rytmen.
- Bytt til spenningsklemme og hold cellen ved forskjellige membranpotensialer for å karakterisere forholdet mellom eksitatoriske versus inhibitoriske synaptiske strømmer generert av den inneboende rytmiske aktiviteten. Et eksempel på patch clamp opptak fra en pyramidal celle er vist i Figur 3A for sammenligning.
- Optogenetisk kontroll i den isolerte hippocampus MERK: For optogenetisk kontroll av hippocampal nettverksaktivitet benyttes en celletypespesifikk strategi som involverer rytmisk aktivering av PV-holdige GABAergic celler, da disse cellene ble vist å spille en viktig rolle ved synkronisering av hovedcellepopulasjoner i den isolerte hippocampus 25 . Selektivt uttrykk for excitatorisk kanalhodopsin-2 (ChR2) i PV-celler oppnås ved å krysse PV-Cre-muselinjen med mus som konsentrerer uttrykk for ChR2 Cre-avhengig (Ai32), hvorved PV-ChY-mus oppnås. Alternativt kan virale vektorkonstruksjoner ( f.eks . AAVdj-ChETA-eYFP) injiseres i hippocampus av PV-Cre eller PV-TOM-mus (P15-16) for å drive uttrykket av excitatorisk opsin i CA1 / SUB interneurons ( Figur 4A ).
MERK: Denne strategien er tidligere beskrevet 25 .- Plasser en LFP-elektrode i CA1 / SUB-området og la en nærliggende pyramidcelle i den isolerte hippoc-plassenAmpus av en mus som uttrykker den blålysfølsomme excitatoriske opsin ChR2 i PV interneurons.
- Plasser en optisk fiberlampeguide (0,2 - 1 mm diameter) over hippocampalpreparatet og senter det på det registrerte området. Bruk blått lys (473 nm) fra en LED-kilde til optogenetisk stimulering, bestående av lysimpulser (10-20 ms, utløst av et transistor-transistorlogisk signal) eller sinusbølgevolumkommandoer levert ved tetafrekvenser (4-12 Hz).
MERK: Den tilpassede LED-baserte lysstimuleringsenheten er beskrevet andre steder 25 . - Bytt til nåværende klemme og karakteriser pyramidalets aktivitet under spontane teta-svingninger.
- Start stimuleringsprotokollen og registrer lysresponsene. Å se på at feltoscillasjoner og synaptisk aktivitet i den registrerte neuronen blir stadig synkronisert under optogenetisk stimulering, og at rytmisk pacing av PV-celler resulterer i en robust styring av begge frekvenserEncy og kraft av theta-svingninger ( Figur 4 ).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne delen illustrerer eksempler på resultater som kan oppnås ved å studere theta-oscillasjoner i det mus-isolerte hippocampale preparatet in vitro . Disseksjonsprosedyren for ekstraksjon av det isolerte hippocampus er illustrert i figur 1 . Ved hjelp av dette preparatet kan intrinsiske theta-svingninger undersøkes under plassering av flere feltelektroder, innspilling av total aktivitet og synkroniserte synaptiske innganger til nevronpopulasjoner i forskjellige regioner og lag av den isolerte hippocampusen ( figur 2 ). Representative resultater fra samtidig helcellepatchklemme og ekstracellulære opptak presenteres for å karakterisere brenn- og synaptiske egenskaper av spesifikke celletyper under spontane hippocampale theta-oscillasjoner ( Figur 3 ), samt ved optogenetisk manipulering av rytmisk aktivitet (G "> Figur 4).
Figur 1: Disseksjonsprosedyre for isolert intakt hippocampuspreparat.
( A ) Generell visning av disseksjonsoppsettet. Øverst til høyre: karbonatisert iskaldt sukroseoppløsningskolbe (1); Nederst til venstre: Isfylt plastskuff (2) som holder disseksjonsskålen dekket med linsepapir (3); Det kalde holdekammeret inneholder sukroseoppløsning (4); Og et sett med kirurgiske verktøy (5). ( B ) Utsikt over musens hjerne før hemiseksjon på disseksjonsretten. ( C ) Gjenvinning av hemisected hjerne i det kalde holdekammeret og zoomet visning (innsettet) på venstre hjernehalvdel før innsetting av den lille enden av den belagte spatelen under septum. ( D ) Coated spatel plassert under den isolerte hippocampus langs CA1 / SUB-regionen, med den gjenværende hjernenVev er trukket ut fra under. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Konfigurasjon av oppsett for innspilling in vitro Theta-oscillasjoner fra den intakte hippokampepreparasjonen i nedsenket opptakskammer.
( A ) Den isolerte hippocampus er vist med en utforming av hippocampale regioner og flere elektroder plassert i fire forskjellige registreringssteder distribuert septotemporalt (angitt med hvite stjerner). I utsikten over opptakskammerplattformen vist ovenfor (innsats i) er innløpet og utløpet for hurtig perfusjonsstrøm indikert med tallene (1, 2). I det forstørrede bildet av hippocampus vist nedenfor (innsettet ii), plasseres en enkelt elektrode i midtenSepetotemporal CA1 og fibre av alveus er lett synlige, løper diagonalt mot subikulumet. S: septal, T: temporal, f / fx: fimbria-fornix. ( B ) Skjematisk representasjon av organisasjonen av CA1-lag med representative LFP-spor registrert samtidig fra stratum oriens (grå) og stratum radiatum (svart). Merk den inverterte fasen av signaler mellom de to lagene. Alv: stratum alveus, PR: stratum pyramidale, SR: stratum radiatum. SLM: Stratum Lacunosum Moleculare. ( C ) Eksempel LFP-spor som viser spontan theta-svingning registrert fra CA1 / SUB-området (20 sek segment) og 2 sek utvidede segmenter (nedenfor) fra ufiltrert signal; Band-pass filtrert for theta frekvenser (0,5-12 Hz); Sakte gamma (25 - 55 Hz); Og rask gamma (125 - 250 Hz). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Celltypespesifikk aktivitet av pyramidalcelle og PV-interneuron under spontane theta-oscillasjoner i den intakte hippocampale preparat fra en PV-TOM-mus.
( A ) Synaptisk aktivitet registrert fra en pyramidcelle under teta-oscillasjoner. Aktuelle klemspor (venstre panel) viser spontan, men ikke rytmisk avfyring i ro, og hemmende postsynaptiske potensialer (iPSPs) som ikke var tydelig synkronisert med langsomt fremkallende LFP-svingning. Spenningsklemmeinnspillinger (høyre panel) viser at de tilsvarende hemmende postsynaptiske strømningene (iPSCs) har sitt reverseringspotensial rundt -70 mV. ( B ) Synaptisk aktivitet registrert fra et raskt spiking fluorescerende PV interneuron under theta oscillasjoner. I strømklemmen (til venstre) ble denne cellen spontant skutt i ro og var sterkt drevet av rytmisk excitatorisk poStsynaptiske potensialer (ePSPs) som var faselåst med den stabile LFP-oscillasjonen. I spenningsklemmeinnspillinger (høyre) var det eksitatoriske postsynaptiske nåværende reverseringspotensialet ca. 0 mV. Skjematiske tegninger på toppen viser eksperimentell oppsett sammen med plassering av patch- og feltelektroder i CA1 / SUB og høy (40X) forstørrelsesbilder av den registrerte pyramidcellen og fluorescerende PV interneuron. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Lokale feltpotensielle og samtidige patchklemmeopptak fra enkle CA1 / SUB-pyramidale og PV-neuroner under spontane og optogenetisk drevne Theta-oscillasjoner i den isolerte hippocampus.
( A B ) Karakterisering av et pyramidalt neuron som viser typiske normal-spiking (RS) egenskaper (topp) og høy forstørrelse (40X) bilde av den registrerte cellen (bunnen). ( C ) Prøve strømklemmeopptak av samme celle ved depolarisert membranpotensial (svart) sammen med LFP-signalet (grå) og viser synkroniserte rytmiske IPSPs under spontan oscillasjon (venstre) og under tetafrekvens (6 Hz) lysstimulering ( Ikke sant). Mønsteret for lysstimulering (blå skygging) er avbildet på toppen av spenningssporene. ( D ) Spektrogram og strømspekter av LFP-bølgeform før, under og etter en 6 Hz lys simulering (baseline, stim, post). ( E ) Lav forstørrelse lysfelt og fluorescensbilder av isolatetEd hippocampal preparat som viser eYFP fluorescens (i grønt) lokalisert i CA1 / SUB-regionen. ( F ) Karakterisering av nåværende trinn som viser FS-oppførsel av et innspilt PV-TOM interneuron (40X fluorescensbilde nedenfor). ( G ) Membranpotensialopptak som viser store EPSP og rytmisk avfyring av den registrerte PV-cellen synkronisert med LFP-signalet under spontan feltoscillering (venstre) og under lysstimulering (høyre) ved 3 Hz. ( H ) Field Triggered Average (FTA) av PV-cellespikes over CA1 / SUB LFP-signalet. Utløpet av PV-cellen over flere forsøk (sentrert på LFP-toppene) ble omgjort til en FTA av pigger registrert under spontan oscillasjon (baseline) og under lysstimulering (stim). Midt- og bunngrafer viser rasterplottene av pigger og spikesannsynlighetshistogrammer (gjennomsnittlig sannsynlighet er vist i rødt). Øverste grafer viser plott av gjennomsnittlig LFP signal som økte i kraft under ligHt stimulering parallelt med høy synkronisert avfyring av PV-cellen faset låst til toppen av LFP-oscillasjonen. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| SUCROSE LØSNING (1X) FOR ISOLERT HIPPOCAMPUS | |||
| (Lagerløsning) | |||
| forbindelse | MW | Final Conc. (mM) | Beløp for 1 L (g) |
| sukrose | 342,3 | 252 | 86,26 g |
| NaHCO3 | 84.01 | 24 | 2,020 g |
| glukose | 180,2 | 10 | |
| KCl | 74.55 | 3 | 0,223 g |
| MgSO4 | 120,4 | 2 | 0,241 g |
| NaH 2PO 4 | 120 | 1,25 | 0,150 g |
| CaCl 2 .2H2O [1 M] lager | 147 | 1.2 | 120 μl / 0,1 l * |
| * Tilsett 360 μL CaCl 2 [1 M] for 0,3 L oksygenert sukroseoppløsning | |||
| PH = 7,4 når oksygenert, Osm 310 - 320 | |||
Tabell 1.
| STANDARD ACSF LØSNING (5X) FOR PERFUSJON | |||
| (Lagerløsning) | |||
| forbindelse | MW | Final Conc. (mM) | Beløp for 2 L 5X |
| NaCl | 58.44 | 126 | 73.6 |
| NaHCO3 | 84.01 | 24 | 20.2 |
| glukose | 180,2 | 10 | 18 |
| KCl | 74.55 | ♦ 4.5 | 3,355 |
| MgSO4 | 120,4 | 2 | 2,41 |
| NaH 2PO 4 | 120 | 1,25 | 1.5 |
| askorbat | 176,1 | 0.4 | 0,705 |
| CaCl 2 .2H2O [1 M] lager | 147 | 2 | 2 ml / l * |
| * Tilsett 2 ml CaCl 2 [1 M] for 1 L aCSF (1x) oksygenert oppløsning | |||
| PH = 7,4 når oksygenert, Osm 310 - 320 | |||
| ♦ En litt forhøyet [K + ] o brukes til denne aCSF-løsningen (sammenlignet med normal aCSF 2,5 mM KCl) for å øke excitabiliteten til hippocampale nettverk og lette fremveksten av theta-svingninger. | |||
Tabell 2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mens elektrofysiologiske opptak fra akutte hippocampale skiver utgjør en standard in vitro- teknikk, varierer metodene som presenteres her vesentlig fra den klassiske tilnærmingen. I motsetning til de tynne skiverpreparatene hvor spesifikke cellelag er synlige på overflaten og kan undersøkes direkte, er de intakte hippocampale preparatene mer beslektet med in vivo konfigurasjoner der elektrodene senkes til målrettede hjerneområder mens de krysser gjennom individuelle lag. Hippocampus integritet er bevart sammen med funksjonell tilkobling og egenskaper hos lokale nevronpopulasjoner. Dette gir et komplekst og kraftig verktøy for å undersøke små og store nettverksoscillasjoner i hippocampus. For eksempel produserer kombinasjonen av prewired-kretser og celletype-spesifikke egenskaper i nettverket iboende og spontant genererte rytmiske theta- og gamma-svingninger som etterligner viktige trekk ved hippokMpal aktivitet in vivo . Ved hjelp av metodene som presenteres i denne protokollen, kan hippocampus ekstraheres raskt fra gnagerehjernen og forbli levedyktig i flere timer i et raskt flytende aCSF-miljø. Grunnleggende elektrofysiologiske teknikker blir lett brukt for å undersøke hvordan synkron aktivitet og synaptisk funksjon av spesifikke neuronale typer påvirker hippocampal dynamikk.
Vår fremgangsmåte har gitt den første muligheten til systematisk å undersøke dynamikken til lokale feltpotensiale svingninger over hele septo-temporal (dorso-ventral) akse i hippocampus in vitro (se Refs 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27 , 28 ). På nettverket og fysiologiske nivåer bevarer det intakte preparatet: 1) Den funksjonelle synaPtiske interaksjoner mellom celler som kreves for å pålidelig støtte intrinsiske nettverksoscillasjoner med frekvensområdet og profilen til theta-bølger in vivo , 2) Den skarpe endringen i relativ fase av theta-oscillasjon ved nivået av stratumpyramidale, 3) Thetas spredning og koherens Oscillasjon i hippocampus og interaksjon med lokale gammafrekvensrytmer, 4) Amplitudfaseforholdet mellom theta / gamma-bølger og 5) Den spesifikke tidsmessige tilknytningen til hovedcellens og interneuron-fyring med feltpotensielle theta-oscillasjoner.
Mens fraværet av ekstern inngang til hippocampus kan virke som en begrensning for teknikken, tillater det også studier av den interne dynamikken til hippocampuset på en måte som ikke kan gjøres in vivo . I tillegg kan eksterne innganger etterlignes ved optogenetisk stimulering av bestemte fiberterminaler og avferente veier. Intakte preparater gir nye muligheter til å studereHvordan nettverksaktiviteter forplanter seg og samhandler i store nettverk som involverer hippocampus og andre tilkoblede strukturer. Som sådan er en hovedanvendelse av den intakte preparatteknikken undersøkelsen av funksjonelt nettverkstilkobling i eller mellom hjernegrupper. Ved hjelp av in vitro intakt hippocampus bør derfor ikke bare gi ytterligere informasjon om hippocampusens cellulære og nettverksegenskaper, men også kaste lys på hvordan disse samhandler for å forme behandling, integrasjon og generering av informasjon i hjernen.
Rytmiske nettverksoscillasjoner som engasjerer den koordinerte elektrokemiske signaleringen av store neuronale ensembler virker som en sentral mekanisme for koding, lagring og overføring av informasjon innenfor og over hjernens områder. Hippokampale svingninger antas å være avgjørende for behandling av spatiotemporal informasjon, koding og minne. Omvendt antas hippocampal dysfunksjon å underlide forstyrrelserH som Alzheimers sykdom og schizofreni, som er forbundet med endrede oscillasjonsmønstre 29 . Som sådan har studien av selv-genererte hippocampale oscillasjoner ved bruk av intakte hippocampale preparater blitt en fornyet måte for å belyse grunnleggende egenskaper av nervesystemfunksjonen og dysfunksjonen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen konkurrerende kommersielle eller økonomiske interesser.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av de kanadiske instituttene for helseforskning og naturvitenskap.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Sodium Chloride | Sigma Aldrich | S9625 | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S9378 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma Aldrich | S5761 | |
| NaH2PO4 - sodium phosphate monobasic | Sigma Aldrich | S8282 | |
| Magnesium sulfate | Sigma Aldrich | M7506 | |
| Potassium Chloride | Sigma Aldrich | P3911 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma Aldrich | G7528 | |
| Calcium chloride dihydrate | Sigma Aldrich | C5080 | |
| Sodium Ascorbate | Sigma Aldrich | A7631-25G | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Standard Dissecting Scissors | Fisher Scientific | 08-951-25 | brain extraction |
| Scalpel Handle #4, 14 cm | WPI | 500237 | brain extraction |
| Filter forceps, flat jaws, straight (11 cm) | WPI | 500456 | brain extraction |
| Paragon Stainless Steel Scalpel Blades #20 | Ultident | 02-90010-20 | brain extraction |
| Fine Point Curved Dissecting Scissors | Thermo Fisher Scientific | 711999 | brain extraction |
| Teflon (PTFE) -coated thin spatula | VWR | 82027-534 | hippocampal preparation |
| Hayman Style Microspatula | Fisher Scientific | 21-401-25A | hippocampal preparation |
| Lab spoon | Fisher Scientific | 14-375-20 | hippocampal preparation |
| Borosilicate Glass Pasteur Pipets | Fisher Scientific | 13-678-20A | hippocampal preparation |
| Droper | Fisher Scientific | hippocampal preparation | |
| Razor blades Single edged | VWR | 55411-055 | hippocampal preparation |
| Lens paper (4 x 6") | VWR | 52846-001 | hippocampal preparation |
| Glass petri dishes (100 x 20 mm) | VWR | 25354-080 | hippocampal preparation |
| Plastic tray for ice; size 30 x 20 x 5 cm | n.a. | n.a. | hippocampal preparation |
| Single Inline Solution Heater | Warner Instruments | SH-27B | perfusion system |
| Aquarium air stones for bubbling | n.a. | n.a. | perfusion system |
| Tygon E-3603 tubing (ID 1/16 OD 1/8) | Fisherbrand | 14-171-129 | perfusion system |
| Electric Skillet | Black & Decker | n.a. | perfusion system |
| 95% O2/5% CO2 gas mixture (carbogen) | Vitalaire | SG466204A | perfusion system |
| Glass bottles/flasks (4 x 1 L) | n.a. | n.a. | perfusion system |
| Submerged recording Chamber | custom design (FM) | n.a. | Commercial alternative may be used |
| Glass pipettes (1.5/0.84 OD/ID (mm) ) | WPI | 1B150F-4 | electrophysiology |
| Hum Bug 50/60 Hz Noise Eliminator | Quest Scientific | Q-Humbug | electrophysiology |
| Multiclamp 700B patch-clamp amplifier | Molecular devices | MULTICLAMP | electrophysiology |
| Multiclamp 700B Commander Program | Molecular devices | MULTICLAMP | electrophysiology |
| Digital/Analogue converter | Molecular devices | DDI440 | electrophysiology |
| PCLAMP10 | Molecular devices | PCLAMP10 | electrophysiology |
| Vibration isolation table | Newport | n.a. | electrophysiology |
| Micromanipulators (manually operated ) | Siskiyou | MX130 | electrophysiology (LFP) |
| Micromanipulators (automated) | Siskiyou | MC1000e | electrophysiology (patch) |
| Audio monitor | A-M Systems | Model 3300 | electrophysiology |
| Micropipette/Patch pipette puller | Sutter | P-97 | electrophysiology |
| Custom-built upright fluorescence microscope | Siskiyou | n.a. | Imaging |
| Analogue video camera | COHU | 4912-2000/0000 | Imaging |
| Digital frame grabber with imaging software | EPIX, Inc | PIXCI-SV7 | Imaging |
| Olympus 2.5X objective | Olympus | MPLFLN | Imaging |
| Olympus 40X water immersion objective | Olympus | UIS2 LUMPLFLN | Imaging |
| Custom-made Light-Emitting Diode (LED) system | custom | n.a. | optogenetic stimulation (Amhilon et al., 2015) |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Animals | |||
| PV::Cre (KI) mice | Jackson Laboratory | stock number 008069 | Allow Cre-directed gene expression in PV interneurons |
| Constitutive-conditional Ai9 mice (R26-lox-stop-lox-tdTomato (KI)) | Jackson Laboratory | stock number 007905 | Express TdTomato following Cre-mediated recombination |
| Ai32 mice (R26-lox-stop-lox-ChR2(H134R)-EYFP | Jackson Laboratory | stock number 012569 |
Express the improved channelrhodopsin-2/EYFP fusion protein following exposure to Cre recombinase |
| PVChY mice | In house breeding | n.a. | Offspring obtained from cross-breeding the PV-Cre line with Ai32 mice (R26-lox-stop-lox-ChR2(H134R)-EYFP |
References
- Buzsaki, G. Theta rhythm of navigation: link between path integration and landmark navigation, episodic and semantic memory. Hippocampus. 15 (7), 827-840 (2005).
- Sanders, H., Renno-Costa, C., Idiart, M., Lisman, J. Grid Cells and Place Cells: An Integrated View of their Navigational and Memory Function. Trends Neurosci. 38 (12), 763-775 (2015).
- O'Keefe, J., Recce, M. L. Phase relationship between hippocampal place units and the EEG theta rhythm. Hippocampus. 3 (3), 317-330 (1993).
- Winson, J. Loss of hippocampal theta rhythm results in spatial memory deficit in the rat. Science. 201 (4351), 160-163 (1978).
- M'Harzi, M., Jarrard, L. E. Strategy selection in a task with spatial and nonspatial components: effects of fimbria-fornix lesions in rats. Behav Neural Biol. 58 (3), 171-179 (1992).
- Osipova, D., et al. Theta and gamma oscillations predict encoding and retrieval of declarative memory. J Neurosci. 26 (28), 7523-7531 (2006).
- Stumpf, C., Petsche, H., Gogolak, G. The significance of the rabbit's septum as a relay station between the midbrain and the hippocampus. II. The differential influence of drugs upon both the septal cell firing pattern and the hippocampus theta activity. Electroencephalogr Clin Neurophysiol. 14, 212-219 (1962).
- Mitchell, S. J., Ranck, J. B. Generation of theta rhythm in medial entorhinal cortex of freely moving rats. Brain Res. 189 (1), 49-66 (1980).
- Alonso, A., Garcia-Austt, E. Neuronal sources of theta rhythm in the entorhinal cortex of the rat. I. Laminar distribution of theta field potentials. Exp Brain Res. 67 (3), 493-501 (1987).
- Vertes, R. P., Kocsis, B. Brainstem-diencephalo-septohippocampal systems controlling the theta rhythm of the hippocampus. Neuroscience. 81 (4), 893-926 (1997).
- Bland, B. H., Colom, L. V., Konopacki, J., Roth, S. H. Intracellular records of carbachol-induced theta rhythm in hippocampal slices. Brain Res. 447 (2), 364-368 (1988).
- Cobb, S. R., Buhl, E. H., Halasy, K., Paulsen, O., Somogyi, P. Synchronization of neuronal activity in hippocampus by individual GABAergic interneurons. Nature. 378 (6552), 75-78 (1995).
- Williams, J. H., Kauer, J. A. Properties of carbachol-induced oscillatory activity in rat hippocampus. J Neurophysiol. 78 (5), 2631-2640 (1997).
- Chapman, C. A., Lacaille, J. C. Cholinergic induction of theta-frequency oscillations in hippocampal inhibitory interneurons and pacing of pyramidal cell firing. J Neurosci. 19 (19), 8637-8645 (1999).
- Strata, F. Intrinsic oscillations in CA3 hippocampal pyramids: physiological relevance to theta rhythm generation. Hippocampus. 8 (6), 666-679 (1998).
- Kocsis, B., Bragin, A., Buzsaki, G. Interdependence of multiple theta generators in the hippocampus: a partial coherence analysis. J Neurosci. 19 (14), 6200-6212 (1999).
- Fellous, J. M., Sejnowski, T. J. Cholinergic induction of oscillations in the hippocampal slice in the slow (0.5-2 Hz), theta (5-12 Hz), and gamma (35-70 Hz) bands. Hippocampus. 10 (2), 187-197 (2000).
- Gillies, M. J., et al. A model of atropine-resistant theta oscillations in rat hippocampal area CA1. J Physiol. 543 (Pt 3), 779-793 (2002).
- Gloveli, T., et al. Orthogonal arrangement of rhythm-generating microcircuits in the hippocampus. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (37), 13295-13300 (2005).
- Konopacki, J., Eckersdorf, B., Kowalczyk, T., Golebiewski, H. Firing cell repertoire during carbachol-induced theta rhythm in rat hippocampal formation slices. Eur J Neurosci. 23 (7), 1811-1818 (2006).
- Hajos, N., et al. Maintaining network activity in submerged hippocampal slices: importance of oxygen supply. Eur J Neurosci. 29 (2), 319-327 (2009).
- Manseau, F., Goutagny, R., Danik, M., Williams, S. The hippocamposeptal pathway generates rhythmic firing of GABAergic neurons in the medial septum and diagonal bands: an investigation using a complete septohippocampal preparation in vitro. J Neurosci. 28 (15), 4096-4107 (2008).
- Goutagny, R., Jackson, J., Williams, S. Self-generated theta oscillations in the hippocampus. Nat Neurosci. 12 (12), 1491-1493 (2009).
- Jackson, J., Goutagny, R., Williams, S. Fast and slow gamma rhythms are intrinsically and independently generated in the subiculum. J Neurosci. 31 (34), 12104-12117 (2011).
- Amilhon, B., et al. Parvalbumin Interneurons of Hippocampus Tune Population Activity at Theta Frequency. Neuron. 86 (5), 1277-1289 (2015).
- Huh, C. Y., et al. Excitatory Inputs Determine Phase-Locking Strength and Spike-Timing of CA1 Stratum Oriens/Alveus Parvalbumin and Somatostatin Interneurons during Intrinsically Generated Hippocampal Theta Rhythm. J Neurosci. 36 (25), 6605-6622 (2016).
- Gu, N., et al. NMDA-dependent phase synchronization between septal and temporal CA3 hippocampal networks. J Neurosci. 33 (19), 8276-8287 (2013).
- Jackson, J., et al. Reversal of theta rhythm flow through intact hippocampal circuits. Nat Neurosci. 17 (10), 1362-1370 (2014).
- Gonzalez-Burgos, G., Lewis, D. A. GABA neurons and the mechanisms of network oscillations: implications for understanding cortical dysfunction in schizophrenia. Schizophr Bull. 34 (5), 944-961 (2008).
