Ici, nous présentons un protocole pour l'enregistrement du réseau neuronal rythmique theta et les oscillations gamma à partir d'une préparation isolée de l'hippocampe entier. Nous décrivons les étapes expérimentales de l'extraction de l'hippocampe aux détails des enregistrements de pince à lames, à l'unité et à l'ensemble des cellules, ainsi qu'à la stimulation optogénétique du rythme theta.
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Dans cet article
Résumé
Résumé
Ce protocole décrit les procédures de préparation et d'enregistrement de l'hippocampe entier isolé, des souris WT et transgéniques, ainsi que des améliorations récentes des méthodologies et des applications pour l'étude des oscillations theta. Une caractérisation simple de la préparation isolée de l'hippocampe est présentée dans laquelle la relation entre les oscillateurs internes de l'thetape de l'hippocampe est examinée conjointement avec l'activité des cellules pyramidales et les interneurones GABAergiques, des domaines cornu ammonis-1 (CA1) et sous -ulum (SUB). Dans l'ensemble, nous montrons que l'hippocampe isolé est capable de générer des oscillations theta intrinsèques in vitro et que la rythmicité générée dans l'hippocampe peut être manipulée avec précision par la stimulation optogénétique des interneurones positives à la parvalbumine (PV). La préparation in vitro isolée de l'hippocampe offre une occasion unique d'utiliser simultanément des enregistrements de pince-plaie intracellulaires et champêtres à partir d'un neu visuellement identifiéAfin de mieux comprendre les mécanismes qui sous-tendent la génération du rythme theta.
Introduction
Les oscillations de l'hippocampal theta (4 à 12 Hz) sont parmi les formes les plus prédominantes d'activité rythmique chez le cerveau mammalien et sont censés jouer un rôle clé dans les fonctions cognitives telles que le traitement de l'information spatio-temporelle et la formation de souvenirs épisodiques 1 , 2 , 3 . Alors que plusieurs études in vivo qui mettent en évidence la relation des cellules place-modulées avec des études de navigation spatiale et des lésions, ainsi que des preuves cliniques, étayent la vision selon laquelle les oscillations de ....
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Protocole
Toutes les procédures ont été effectuées selon les protocoles et les lignes directrices approuvés par le Comité des soins animaux de l'Université McGill et le Conseil canadien sur les soins des animaux.
1. Préparation inactive de l' hippocampe aiguë
REMARQUE: l'isolement de la préparation intacte de l'hippocampe comprend trois étapes majeures: (1) Préparation des solutions et du matériel, (2) Dissection de l'hippocampe et (3) Mise en place du système de vitesse de perfusion rapide nécessaire à la génération d'oscillations intrinsèques Theta. Dans ce protocole, l'exécution en ....
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Résultats
Cette section illustre des exemples de résultats qui peuvent être obtenus en étudiant les oscillations theta dans la préparation d'hippocampe isolée sur la souris in vitro . La procédure de dissection pour extraire l'hippocampe isolé est illustrée à la figure 1 . En utilisant cette préparation, les oscillations theta intrinsèques peuvent être examinées pendant le placement de plusieurs électrodes de champ, enregistrant l'activité g.......
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Discussion
Bien que les enregistrements électrophysiologiques à partir de tranches d'hippocampe aiguë constituent une technique standard in vitro , les méthodes présentées ici diffèrent sensiblement de l'approche classique. Contrairement aux préparations en tranche mince où des couches cellulaires spécifiques sont visibles à la surface et peuvent être examinées directement, les préparations intactes d'hippocampe sont plus proches des configurations in vivo où les électrodes sont abaissées dan.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs ne déclarent aucun intérêt commercial ou financier concurrent.
Remerciements
Ce travail a été soutenu par les Instituts de recherche en santé et sciences naturelles du Canada.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Réactifs <>forts | |||
| Chlorure de sodium | Sigma Aldrich | S9625 | |
| Saccharose | Sigma Aldrich | S9378 | |
| Bicarbonate de sodium | Sigma Aldrich | S5761 | |
| NaH2PO4 - phosphate de sodium monobasique | Sigma Aldrich | S8282 | |
| Sulfate de magnésium | Sigma Aldrich | M7506 | |
| Chlorure de potassium | Sigma Aldrich | P3911 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma Aldrich | G7528 | |
| Chlorure de calcium dihydraté | Sigma Aldrich | C5080 | |
| Ascorbate de sodium | Sigma Aldrich | A7631-25G | |
| Nom | Company | Numéro de catalogue | Comments |
| Equipment | |||
| Standard Dissecting Ciseaux | Fisher Scientific | 08-951-25 | Extraction du cerveau |
| Scalpel Manche #4, 14 cm | WPI | 500237 | extraction du cerveau |
| Filter pinces, mâchoires plates, droites (11 cm) | WPI | 500456 | extraction de cerveau |
| Paragon Lames de scalpel en acier inoxydable #20 | Ultident | 02-90010-20 | extraction de cerveau |
| Ciseaux de dissection incurvés à pointe fine | Thermo Fisher Scientific | 711999 | de cerveau |
| Téflon (PTFE) -spatule fine recouverte de téflon VWR | 82027-534 | préparation de l’hippocampe | |
| Hayman Style Microspatule | Fisher Scientific | 21-401-25A | préparation hippocampique |
| Cuillère de laboratoire | Fisher Scientific | 14-375-20 | préparation hippocampique |
| Verre borosilicaté Pasteur Pipets | Fisher Scientific | 13-678-20A | préparation hippocampique |
| Droper | Fisher Scientific | préparation hippocampique | |
| Lames de rasoir à simple tranchant | VWR | 55411-055 | préparation de l’hippocampe |
| Papier pour lentilles (4 x 6") | VWR | 52846-001 | préparation de l’hippocampe |
| Boîtes de Pétri en verre (100 x 20 mm) | VWR | 25354-080 | préparation de l’hippocampe |
| Plateau en plastique pour la glace ; taille 30 x 20 x 5 cm | n.a.n.a.préparation | l’hippocampe | |
| Solution unique en ligne Chauffage | Warner Instruments | Système de perfusion SH-27B | |
| Pierres à air d’aquarium pour bouillonnement | n.a.n.a.système | de perfusion | |
| Tygon E-3603 tube (ID 1/16 OD 1/8) | Fisherbrand | 14-171-129 | système de perfusion |
| poêle électrique | Noir & Système | perfusion | n.a. |
| 95 % O2/5 % CO2 mélange gazeux (carbogène) ; | Système de perfusion | Vitalaire | SG466204A |
| Flacons/flacons en verre (4 x 1 L) | n.a.n.a.système | de | perfusion |
| Chambre d’enregistrement immergée | conception personnalisée (FM) | n.a.Une | alternative commerciale peut être utilisée |
| Pipettes en verre (1,5/0,84 OD/ID (mm) ) | WPI | 1B150F-4 | électrophysiologie |
| Hum Bug 50/60 Hz Éliminateur de bruit | Quest Scientific | Q-Humbug | électrophysiologie |
| Multiclamp 700B amplificateur patch-clamp | Dispositifs moléculaires | Électrophysiologie | MULTICLAMP |
| Multiclamp 700B Commander Program | Appareils moléculaires | MULTICLAMP | électrophysiologie |
| Convertisseur numérique/analogique Dispositifs | moléculaires | DDI440 | électrophysiologie |
| PCLAMP10 | Dispositifs moléculaires | PCLAMP10 | électrophysiologie |
| Table d’isolation des vibrations ; | Newport | n.a.electrophysiologie | |
| Micromanipulateurs (à commande manuelle) | Siskiyou ; | MX130 | électrophysiologie (LFP) |
| Micromanipulateurs (automatisés) | Siskiyou ; | MC1000e | électrophysiologie (patch) |
| Moniteur audio ; | A-M Systems | Modèle 3300 | Électrophysiologie |
| Micropipette/Patch Extracteur de pipette | Sutter | P-97 | Électrophysiologie |
| Microscope à fluorescence vertical sur mesure | Siskiyou | n.a.Imaging | |
| Caméra vidéo analogique | COHU | 4912-2000/0000 | Imagerie |
| Acquisition d’images numérique avec logiciel d’imagerie | EPIX, Inc | PIXCI-SV7 | Imagerie |
| Objectif Olympus 2.5X | Imagerie | Olympus MPLFLN | Imagerie |
| Objectif à immersion dans l’eau Olympus 40X Olympus | UIS2 LUMPLFLN | Imaging | |
| Système de diodes électroluminescentes (LED) sur mesure ; | stimulation | n.a. | (Amhilon et al., 2015) |
| Name | Company | Catalog Number | >Comments |
| Animals | |||
| PV ::Cre (KI) mice | Jackson Laboratory | stock number 008069 | Autoriser ; Expression génique dirigée par Cre dans les interneurones PV |
| Souris Ai9 constitutive-conditionnelle (R26-lox-stop-lox-tdTomato (KI))Numéro de | Jackson Laboratory | 007905 | Express TdTomato après recombinaison médiée par Cre |
| Souris Ai32 (R26-lox-stop-lox-ChR2(H134R)-EYFP | de stock du | Jackson Laboratory | Exprimer la protéine de fusion channelrhodopsine-2/EYFP améliorée suite à une exposition à Cre souris PVChY recombinase |
| En maison d’élevage | n.a.Progéniture | obtenue par croisement de la lignée PV-Cre avec des souris Ai32 (R26-lox-stop-lox-ChR2(H134R)-EYFP |
Références
- Buzsaki, G. Theta rhythm of navigation: link between path integration and landmark navigation, episodic and semantic memory. Hippocampus. 15 (7), 827-840 (2005).
- Sanders, H., Renno-Costa, C., Idiart, M., Lisman, J.
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Réimpressions et autorisations
