Summary
Ici, nous présentons un protocole pour l'enregistrement du réseau neuronal rythmique theta et les oscillations gamma à partir d'une préparation isolée de l'hippocampe entier. Nous décrivons les étapes expérimentales de l'extraction de l'hippocampe aux détails des enregistrements de pince à lames, à l'unité et à l'ensemble des cellules, ainsi qu'à la stimulation optogénétique du rythme theta.
Abstract
Ce protocole décrit les procédures de préparation et d'enregistrement de l'hippocampe entier isolé, des souris WT et transgéniques, ainsi que des améliorations récentes des méthodologies et des applications pour l'étude des oscillations theta. Une caractérisation simple de la préparation isolée de l'hippocampe est présentée dans laquelle la relation entre les oscillateurs internes de l'thetape de l'hippocampe est examinée conjointement avec l'activité des cellules pyramidales et les interneurones GABAergiques, des domaines cornu ammonis-1 (CA1) et sous -ulum (SUB). Dans l'ensemble, nous montrons que l'hippocampe isolé est capable de générer des oscillations theta intrinsèques in vitro et que la rythmicité générée dans l'hippocampe peut être manipulée avec précision par la stimulation optogénétique des interneurones positives à la parvalbumine (PV). La préparation in vitro isolée de l'hippocampe offre une occasion unique d'utiliser simultanément des enregistrements de pince-plaie intracellulaires et champêtres à partir d'un neu visuellement identifiéAfin de mieux comprendre les mécanismes qui sous-tendent la génération du rythme theta.
Introduction
Les oscillations de l'hippocampal theta (4 à 12 Hz) sont parmi les formes les plus prédominantes d'activité rythmique chez le cerveau mammalien et sont censés jouer un rôle clé dans les fonctions cognitives telles que le traitement de l'information spatio-temporelle et la formation de souvenirs épisodiques 1 , 2 , 3 . Alors que plusieurs études in vivo qui mettent en évidence la relation des cellules place-modulées avec des études de navigation spatiale et des lésions, ainsi que des preuves cliniques, étayent la vision selon laquelle les oscillations de theta de l'hippocampe sont impliquées dans la formation de mémoire 4 , 5 , 6 , les mécanismes associés Avec la génération des oscillations de theta de l'hippocampe sont encore pas complètement compris. Les premières études in vivo ont suggéré que l'activité theta dépendait principalement des oscillateurs extrinsèques, en particulier de l'entrée rythmiqueÀ partir de structures cérébrales afférentes telles que le septum et le cortex entorhinal 7 , 8 , 9 , 10 . Un rôle pour les facteurs intrinsèques - la connectivité interne des réseaux de neurones de l'hippocampe avec les propriétés des neurones de l'hippocampe - a également été postulé sur la base d'observations in vitro 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 . Cependant, en dehors de quelques études marquantes 19 , 20 , 21 , des difficultés dans l'élaboration d'approches qui pourraient reproduire des activités de population physiologiquement réalistes dans une préparation simple de tranche in vitroS ont, depuis longtemps, retardé un examen expérimental plus détaillé des capacités intrinsèques de l'hippocampe et des zones apparentées à l'auto-génération des oscillations theta.
Un inconvénient important de la configuration expérimentale standard de la coupe mince in vitro est que l'organisation cellulaire et synaptique 3D des structures cérébrales est habituellement compromise. Cela signifie que de nombreuses formes d'activités de réseau concertées basées sur des assemblages cellulaires distribués spatialement, allant des groupes localisés (rayon ≤ 1 mm) aux populations de neurones réparties sur une ou plusieurs zones cérébrales (> 1 mm), ne peuvent pas être supportées. Compte tenu de ces considérations, un autre type d'approche était nécessaire pour étudier la façon dont les oscillations theta apparaissent dans l'hippocampe et se propagent à des structures de sortie corticales et subcorticales apparentées.
Au cours des dernières années, le développement initial de la préparation «sépto-hippocampique complète» pour examiner les interiraux bidirectionnelsLes cisions des deux structures 22 et l'évolution qui en a résulté de la préparation du «hippocampe isolé» ont révélé que les oscillations intrinsèques de theta se produisent spontanément dans l'hippocampe dépourvue d'entrée rythmique externe 23 . La valeur de ces approches repose sur l'idée initiale selon laquelle toute la structure fonctionnelle de ces régions devait être préservée afin de fonctionner comme un générateur de rythme theta in vitro 22 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Toutes les procédures ont été effectuées selon les protocoles et les lignes directrices approuvés par le Comité des soins animaux de l'Université McGill et le Conseil canadien sur les soins des animaux.
1. Préparation inactive de l' hippocampe aiguë
REMARQUE: l'isolement de la préparation intacte de l'hippocampe comprend trois étapes majeures: (1) Préparation des solutions et du matériel, (2) Dissection de l'hippocampe et (3) Mise en place du système de vitesse de perfusion rapide nécessaire à la génération d'oscillations intrinsèques Theta. Dans ce protocole, l'exécution en temps voulu des procédures - de la dissection à l'enregistrement - est particulièrement importante car l'hippocampe isolé constitue une préparation si dense, mais délicate, que le maintien de la connectivité fonctionnelle de la structure in vitro nécessite un grand soin. Préparer tout au préalable assure qu'un niveau adéquat de perfusion est disponible le plus tôt possible pour minimiser les cellules dAmage et maintien de la fonction physiologique.
- Solution de fluide céramique cérébral artificiel (aCSF) à base de saccharose
- Préparez la solution de saccharose 1X pour être utilisée pour la dissection et l'incubation post-dissection. Combinez tous les composants énumérés dans le tableau 1 , à l'exception du CaCl 2 , dans 1 L d'eau désionisée et conservez à 4 ° C pendant 2 semaines.
- Solution standard aCSF
- Préparez un aCSF standard pour une perfusion à haut débit de l'hippocampe isolé pendant les enregistrements électrophysiologiques. Pour obtenir le concentré (5X) de stock aCSF, dissolvez tous les composants indiqués dans le Tableau 2 , à l'exception du CaCl 2 , dans 2 L d'eau désionisée et conservez à 4 ° C.
- Préparer l'équipement
- Avant de commencer la dissection, installez la zone de banc avec un plateau en plastique rempli de glace (30 x 20 x 5 cm), des lignes de tubes en carbogèneEe glass Carrés de pétri (10 x 2 cm) (voir figure 1 ).
- Ajouter 300 mL de solution de saccharose (1X stock) dans un bécher de 500 mL, la faire buller avec du carbogène (95% O 2 , 5% de CO 2 ) et ajouter Ca 2+ [1,2 mM].
- Transférer 60 ml de cette solution de saccharose dans une boîte en Pétri en verre et laisser à température ambiante. Placez le reste dans un congélateur à 4 ° C pendant 10 à 15 min.
- Faire passer la solution de saccharose glacée avec du carbogène tout au long de la dissection.
- Remplir une deuxième boîte de Petri (chambre de maintien à froid) avec une solution de saccharose (4 ° C) et continuer à glacer.
- Ajouter 30 ml d'une solution de saccharose glacée à un bêcher de 50 ml.
2. Dissection entière d'hippocampe
NOTE: La méthode de dissection de l'hippocampe isolé est essentiellement identique à celle développée et décrite à l'origine 22 , mais avec des détails supplémentaires et des changements concernant les peTaux de rfusion et techniques d'enregistrement.
- Dissection du cerveau
- Anesthésier la souris (P20 - 35) sous une hotte avec une petite serviette en papier trempée avec 1 ml d'isoflurane (100%) ajoutée à la cage.
- Décapiter la souris anesthésiée et immerger rapidement la tête dans une solution de saccharose glacée (50 mL de bécher, ~ 5 s). Transférer sur une serviette en papier.
- Utilisez un scalpel pour faire une incision interne de la peau (caudale au rostral) et pousser la peau sur les côtés pour exposer le crâne.
- Couper le crâne avec un petit ciseau et utiliser une spatule pour extraire rapidement le cerveau et le déposer dans la boîte de Petri contenant une solution de saccharose glacée. Laisser 1-2 minutes pour que le cerveau refroidisse.
- Pendant que le cerveau se rétablit, ajoutez 2 à 3 ml de solution de saccharose sur un plat de peinture en poudre (dissection) sur papier glacé sur glace.
- Isoler l'hippocampe
- Placez le cerveau sur le plat de dissection dans une position verticaleN.
- Retirez le cervelet et le cortex frontal avec une lame de rasoir. Couper le cerveau en deux le long du plan midsagittal et retourner les deux hémisphères isolés dans la chambre de retenue. Laissez encore 1 à 2 minutes pour récupérer.
- Placez le cerveau hémisphérique seul debout sur le plat de dissection.
- Faites pivoter le plat jusqu'à ce que les structures midsagittal façent face à l'observateur et le contour intégré du complexe septal soit visible sous la forme d'une mince couche de tissu en forme de poire antérieure au thalamus.
- Tenez le cerveau hémisphérique stable avec la microspatule et placez la petite extrémité de la spatule recouverte de polytétrafluoroéthylène (PTFE) immédiatement derrière (caudale à) la zone septique.
- Insérez la spatule enduit sous le septum et déplacez la pointe vers le bas jusqu'à ce que le plat de dissection soit atteint. Séchez les fibres qui relient la zone septique de manière caudale. Répétez la même opération le long du bord antérieur du septum et coupez les fibres qui se connectent à la partie frontale du cerveau.
- Avec la spatule qui maintient légèrement la partie interne du cortex juste au-dessus de l'hippocampe en position verticale, utilisez la microspatule pour retirer soigneusement les noyaux thalamiques, hypothalamiques et souches du cerveau. Utilisez la spatule pour couper et retirer les tissus étirés.
- Transformez l'hémisphère isolé sur son côté et identifiez le contour de l'hippocampe.
- Insérez la spatule enduit dans le ventricule latéral, sous l'extrémité rostrale de l'hippocampe dorsal.
- Tenez la spatule alignée horizontalement avec le plan midsagittal du cerveau hémisphérique et faites-le glisser dans le contour lisse des parois ventriculaires jusqu'à ce que la pointe émerge caudalement.
- Tenez la spatule sous l'hippocampe et appuyez légèrement sur les fibres de connexion, le long de la couche intérieure où l'hippocampe se joint au cortex superposé. Appliquer la microspatule sur le côté externe de cette couche et glisser contre la spatule enduit pour tranche à travers la connexion.
- Pour compléter l'extraction, faites pivoter le plat de dissection et insérez la spatule enduit sous l'hippocampe ventral. Tenir légèrement l'intérieur du pli cortical avec la spatule et couper les connexions entorhominales en utilisant un mouvement de coupe contre la microspatule.
REMARQUE: Le complexe septo-entamique entier peut être éliminé en plaçant la spatule enduit sous l'hippocampe entier et en retirant le tissu cérébral restant en dessous. - Une fois l'isolement terminé, gardez l'hippocampe reposant sur le plat et ajoutez une goutte de solution de saccharose glacée pour le garder au frais. Découper soigneusement tout cortex et fibres restants et séparer l'hippocampe du septum en appliquant doucement une lame de rasoir à travers le fornix.
REMARQUE: si les enregistrements de pinces de patch doivent être effectués à partir de cellules pyramidales (voir la section 4.6 Contrôle optogénétique), l'hippocampe isolé peut être coupé transversalement à un angle de 45 ° pour exposer la couche pyramidale de CA1 ("anglE-cut "), sans compromettre les circuits du réseau local dans la partie restante de l'hippocampe. - Transférer la préparation à la solution de saccharose à température ambiante et la laisser récupérer pendant 15 à 30 minutes avant de transférer dans la chambre d'enregistrement.
3. Configurer la perfusion rapide pour enregistrer l'hippocampe isolé
- Mettre en place le système de perfusion alimenté par gravité pour permettre l'entrée continue à haute vitesse d'aCSF oxygéné à 20-25 ml / min.
- Préparez les flacons aCSF (1X) à l'avance et immerges-les dans un bain de réchauffement (~ 30 ° C) au moins 15 minutes avant le début de l'expérience. Allumez le système de chauffage en solution en ligne (30 ° C).
- Utilisez des bubblers d'aquarium et des lignes de tubes connectés à un réservoir de carbogène pour oxygéner l'aCSF tout au long de l'expérience et ajoutez CaCl 2 [2 mM] avant le début de la perfusion.
- Arrêtez le flux d'aCSF et transférez l'hippocampe à la chambre d'enregistrement en utilisant le largeFin d'une pipette en verre. Permettre à la préparation saturée de saccharose de couler et de s'installer en bas.
- Placez la préparation au centre de la chambre d'enregistrement (en ligne avec l'axe d'entrée-sortie) avec la surface lisse de CA1 et SUB sur le dessus. Stabilisez l'hippocampe avec de petits poids aux extrémités septal et temporelles et relancez le flux d'aCSF.
4. Électrophysiologie dans l'Hippocampe isolé
- Enregistrement extracellulaire des oscillations hippocampiques theta in vitro
- Pour la surveillance extracellulaire du potentiel de champ local (LFP) ou de l'activité unitaire de l'hippocampe isolé in vitro , utiliser des micropipettes en verre (1 à 3 MΩ) remplies d'aCSF. Enregistrez des signaux de potentiel de champ à couplage AC à faible bruit avec un amplificateur à extension de patch de gain x1000, un filtrage passe-bande en ligne de 0,1 à 500 Hz et un taux d'échantillonnage de 5 à 20 kHz.
REMARQUE: Le microscope personnalisé utilisé dans ce protocoleEst équipé d'objectifs bas (2.5X) et de grand grossissement (40X) pour une vision à faible grossissement de l'hippocampe, ainsi que d'une microscopie vidéo infrarouge et d'une épifluorescence pour la reconnaissance d'une seule cellule. Les composants de ce système comprennent le microscope à fluorescence verticale, les cubes de filtre à fluorescence, une caméra vidéo analogique et un capteur de trame numérique avec un logiciel d'imagerie, une chambre de perfusion personnalisée sur scène ( Figure 2A , inset i) et des micromanipulateurs de haute précision pour les enregistrements neuronaux et Placement en fibre optique. - Utilisez la caméra montée sur le microscope et reliée à un écran d'ordinateur pour inspecter la préparation de l'hippocampe sous un faible grossissement (2.5X) et vérifiez rapidement qu'il n'y a pas de contre-dépouille ou d'endommagement de la surface externe. L'agencement orienté en diagonale des fibres d'alvéole le long de la surface lisse de CA1 devrait être visible ( Figure 2A , encadré ii) lors de la lumière brisée par l'intermédiaire de l'hippocampus.
- Utilisez l'objectif de grand champ à faible grossissement pour voir l'hippocampe isolé et le placement des électrodes LFP dans des emplacements d'enregistrement spécifiques.
REMARQUE: Une disposition de la préparation isolée de l'hippocampe avec de multiples électrodes placées dans des emplacements d'enregistrement différents est illustrée à la figure 2A . - Abaissez une électrode LFP dans le bain jusqu'à ce qu'elle touche la surface (alvéole) de la zone CA1.
REMARQUE: cela produit habituellement un transitoire rapide dans l'enregistrement à couplage AC semblable à ce qui se produit lorsque l'électrode entre en contact avec le support d'enregistrement. Un moniteur audio peut être utile pour écouter le signal du canal LFP après cette étape.
REMARQUE: Souvent, les premiers signes d'activité n'apparaissent qu'après 10 à 15 minutes, il est donc important de ne pas avancer rapidement dans la préparation. Si après cette période, l'électrode LFP de surface ne poursuit pas l'activité, avance un peu plus loin dans les stratum oriensEt faites une pause périodique pour voir si une forme quelconque d'activité survient lorsque vous approchez de la couche cellulaire principale. Si rien n'est détecté après 5 à 10 minutes supplémentaires, retirez soigneusement l'électrode et placez-la ailleurs le long de la même région. - Avancez l'électrode LFP à travers la couche pyramidale. Observez que l'activité de piquant extracellulaire augmente initialement à mesure que l'on détermine une décharge d'une seule unité provenant de neurones individuels (principalement des cellules de panier pyramidales et inhibitrices). Abaissez l'électrode plus loin et notez que les pointes commencent à s'effacer à nouveau lorsque la pointe croise dans le radiatum. Observez qu'une oscillation de réseau clairement visible dans la plage de fréquence theta (4 - 12 Hz) soit apparente et atteigne une amplitude maximale (~ 100 - 300 μV) lorsque l'emplacement d'enregistrement est abaissé par le radiatum.
- Pour la surveillance extracellulaire du potentiel de champ local (LFP) ou de l'activité unitaire de l'hippocampe isolé in vitro , utiliser des micropipettes en verre (1 à 3 MΩ) remplies d'aCSF. Enregistrez des signaux de potentiel de champ à couplage AC à faible bruit avec un amplificateur à extension de patch de gain x1000, un filtrage passe-bande en ligne de 0,1 à 500 Hz et un taux d'échantillonnage de 5 à 20 kHz.
- Les oscillations theta dans une seule région
- Pour tester les propriétés spatiales des oscillations theta spontanées dans la région CA1, placez la pointe oFa référence l'électrode LFP dans un site médical CA1 (localement situé le long de l'axe septo-temporel longitudinal) et l'abaisser dans le radiatum comme décrit précédemment.
- Placez une seconde électrode LFP dans un site CA1 (200 à 800 μm septal ou temporel à partir du premier LFP) et observez que les oscillations theta de CA1 peuvent se synchroniser sur des distances relativement importantes.
- Les oscillations Theta à travers les couches
- Pour tester les propriétés des oscillations theta sur les couches de l'hippocampe, laissez une électrode LFP de référence dans un site CA1 radiatum. À partir de juste au-dessus de la stratum oriens, abaisser une seconde électrode dans la couche de cellules pyramidales et à travers le radiatum. Observez une inversion graduelle du signal LFP (inversion de phase relative) à travers la couche pyramidale.
REMARQUE: pour des exemples représentatifs de ces types d'activité, voir la figure 2B . Exemples de profils laminaires / de profondeur et analyses de densité de source actuelle (CSD)Illustre le site d'inversion de phase dans les hippocampies isolés qui ont déjà été publiés 23 , 24 , 25 .
- Pour tester les propriétés des oscillations theta sur les couches de l'hippocampe, laissez une électrode LFP de référence dans un site CA1 radiatum. À partir de juste au-dessus de la stratum oriens, abaisser une seconde électrode dans la couche de cellules pyramidales et à travers le radiatum. Observez une inversion graduelle du signal LFP (inversion de phase relative) à travers la couche pyramidale.
- Les oscillations gamma et le couplage theta-gamma dans l'hippocampe intact
- Placez une électrode de champ sur la bordure CA1 / SUB et abaissez-la jusqu'à ce qu'elle soit située à l'interface entre les couches pyramidales et moléculaires. À ce niveau, un potentiel de champ affichant des oscillations gamma claires avec des changements d'amplitude que le verrouillage de phase au rythme theta local peut être enregistré 24 . Réglez la mise à l'échelle pour observer l'échelle de temps lente du couplage theta-gamma. Notez que les rafales gamma se produisent dans deux bandes de fréquences distinctes, ce qui peut être révélé par filtrage passe-bande du signal LFP en cours dans la gamme lente (25 - 50 Hz) et gamma rapide (150 - 250 Hz) (voir Figure 2C pour filtre représentatif traces).
- Enregistrement de la pince de patch intégral pendant les oscillations hippocampiques theta in vitro
REMARQUE: dans cette partie du protocole, l'objectif est d'obtenir des enregistrements de pince à patchs à cellules entières visuellement à partir d'interneurones identifiées dans des hippocampies isolés à partir de souris PV-TOM transgéniques exprimant la protéine fluorescente, tdTomato, sous le contrôle du promoteur PV (pour Plus de détails voir les matériaux et Ref 26 ).- Utiliser une microscopie vidéo à fluorescence avec un grossissement faible (2.5X) et une puissance élevée (40X) pour visualiser les interneurones TdTomato-positives situées près de la surface d'une préparation d'un hippocampe à partir d'une souris PV-TOM ( Figure 3 ). Notez que si les neurones PV-TOM peuvent être visualisés avec succès et ciblés pour le patch à travers l'alvéole (jusqu'à 100 μm), les cellules pyramidales non fluorescentes peuvent également être facilement atteintes lorsque l'hippocampe est préparé avec la technique de coupe d'angle (voir Note de la section 2.2.14).
- Sous une vue de faible amplification de l'hippocampe, placez une électrode LFP dans CA1 / SUB pour surveiller les oscillations theta tout en préparant les expériences de patch clamp.
- Passez à un grossissement 40X et immergez l'objectif sur la région cible; Abaissez-le jusqu'à ce que les couches supérieures deviennent visibles. Manipulez la position du microscope pour assurer un accès ouvert suffisant pour l'approche de la pipette patch du côté opposé.
- En microscopie à fluorescence, sélectionnez une cellule fluorescente PV-TOM et approchez-la avec une pipette patch (2 à 3 MΩ) remplie d'une solution intracellulaire standard.
- Utilisez une embouchure pour appliquer une pression positive légère sur la pipette et surveillez la résistance lorsque l'électrode est abaissée sur la cellule. Lorsque la pointe rencontre la cellule cible, la résistance de la pipette augmente et une fossette claire apparaît lorsque la pression positive pousse la membrane. Relâchez la pression et vérifiez que la pression actuelle s'allonge lorsque le joint commence à se former. Immédiatement clÀ un potentiel hyperpolarisé (-70 mV), et une fois qu'un joint d'étanchéité GΩ est atteint, rompre la membrane cellulaire avec une petite quantité de pression négative appliquée à travers le porte-pipette.
- Une fois dans la configuration de cellules entières, examinez les propriétés physiologiques des cellules PV identifiées lors des oscillations spontanées de l'hippocampe ( Figure 3B ).
- Observez que l'enregistrement du potentiel de membrane intracellulaire à partir de cellules photovoltaïques est caractérisé par un comportement rapide et des rafales de potentiels d'action synchronisés avec le rythme théta CA1 / SUB continu.
- Passez à la tension et serrez la cellule à différents potentiels de membrane pour caractériser le rapport des courants synaptiques excitateurs et inhibiteurs générés par l'activité rythmique intrinsèque. Un exemple d'enregistrement de la pince patch à partir d'une cellule pyramidale est illustré à la figure 3A pour comparaison.
- Contrôle optogénétique dans l'hippocampe isolé NOTE: Pour le contrôle optogénétique de l'activité du réseau de l'hippocampe, une stratégie spécifique de type cellulaire impliquant l'activation rythmique de cellules GABAergiques contenant du PV est utilisée ici car ces cellules ont joué un rôle majeur dans la synchronisation des principales populations de cellules dans l'hippocampe isolé 25 . L'expression sélective de la canalrhodopsine-2 excitatrice (ChR2) dans les cellules photovoltaïques est obtenue en traversant la ligne de souris PV-Cre avec des souris exprimant constitutivement ChR2 Cre-dependent (Ai32), générant ainsi des souris PV-ChY. En variante, les constructions de vecteurs viraux ( par exemple , AAVdj-ChETA-eYFP) peuvent être injectées dans l'hippocampe de souris PV-Cre ou PV-TOM (P15-16) pour conduire l'expression de l'opsine excitatrice dans les interneurones CA1 / SUB ( Figure 4A ).
NOTE: Cette stratégie a déjà été décrite 25 .- Placez une électrode LFP dans la zone CA1 / SUB et réparez une cellule pyramidale proche dans l'hippococès isoléAmpleur d'une souris exprime l'opsin excitateur à lumière bleue ChR2 dans les interneurones photovoltaïques.
- Placez un guide de lumière à fibre optique (0,2 - 1 mm de diamètre) au-dessus de la préparation de l'hippocampe et centrez-le sur la région enregistrée. Utilisez la lumière bleue (473 nm) à partir d'une source LED pour la stimulation optogénétique, consistant en des impulsions lumineuses (10-20 ms, déclenchées par un signal logique transistor-transistor) ou des commandes de tension des ondes sinusoïdales livrées aux fréquences (4 à 12 Hz).
REMARQUE: l'assemblage personnalisé de stimulation lumineuse à base de LED a été décrit ailleurs 25 . - Passez à la pince actuelle et caractérisez l'activité de la pyramide lors d'oscillations théta spontanées.
- Commencez le protocole de stimulation et enregistrez les réponses lumineuses. Garder que les oscillations de champ et l'activité synaptique dans le neurone enregistré se synchronisent de plus en plus pendant la stimulation optogénétique et que la stimulation rythmique des cellules photovoltaïques entraîne un contrôle robuste des deux fréquencesLa puissance et la puissance des oscillations theta ( Figure 4 ).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Cette section illustre des exemples de résultats qui peuvent être obtenus en étudiant les oscillations theta dans la préparation d'hippocampe isolée sur la souris in vitro . La procédure de dissection pour extraire l'hippocampe isolé est illustrée à la figure 1 . En utilisant cette préparation, les oscillations theta intrinsèques peuvent être examinées pendant le placement de plusieurs électrodes de champ, enregistrant l'activité globale et les entrées synaptiques synchronisées aux populations neuronales dans différentes régions et couches de l'hippocampe isolé ( Figure 2 ). Les résultats représentatifs de la pince de patch intégrale simultanée et des enregistrements extracellulaires sont présentés pour caractériser les propriétés de tir et de synaptique des types de cellules spécifiques pendant les oscillations spontanées de theta de l'hippocampe ( Figure 3 ), ainsi que lors de la manipulation optogénétique de l'activité rythmique (G "> Figure 4).
Figure 1: Procédure de dissection pour la préparation isolée d'hippocampes intactes.
(A) Vue générale de la configuration de la dissection. Haut à droite: flacon de solution de saccharose glacée carbonée (1); En bas à gauche: plateau en plastique rempli de glace (2) en tenant le plat de dissection recouvert de papier de lentille (3); La chambre de maintien à froid contenant une solution de saccharose (4); Et un ensemble d'outils chirurgicaux (5). ( B ) Vue du cerveau de la souris avant la hémisection sur le plat de dissection. ( C ) Récupération du cerveau hémorragique dans la chambre de maintien à froid et vue agrandie (insertion) de l'hémisphère gauche avant d'insérer la petite extrémité de la spatule enduit sous le septum. ( D ) Spatule enduit placé sous l'hippocampe isolé, le long de la région CA1 / SUB, avec le cerveau restantLe tissu est retiré de dessous. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2: Configuration de la configuration pour l'enregistrement des oscillations Theta in vitro de la préparation intacte de l'hippocampe dans la chambre d'enregistrement submergée.
(A) L'hippocampe isolé est représenté avec une disposition des régions de l' hippocampe et de multiples électrodes placées dans quatre emplacements d'enregistrement différents répartis septotemporally (indiqué par des astérisques blancs). Dans la vue de la plate-forme de chambre d'enregistrement indiquée ci-dessus (insertion i), l'entrée et la sortie pour le flux de perfusion rapide sont indiquées par des nombres (1, 2). Dans l'image agrandie de l'hippocampe indiquée ci-dessous (encart ii), une seule électrode est placée au milieuLe CA1 séparé et les fibres de l'alvéole sont facilement visibles, en diagonale vers le sous-élément. S: septal, T: temporel, f / fx: fimbria-fornix. ( B ) Représentation schématique de l'organisation des couches CA1 avec des traces LFP représentatives enregistrées simultanément à partir de stratum oriens (gris) et stratum radiatum (noir). Notez la phase inversée des signaux entre les deux couches. Alv: stratum alveus, PR: stratum pyramidale, SR: stratum radiatum. SLM: Stratum Lacunosum Moleculare. ( C ) Exemple de trace de LFP montrant l'oscillation theta spontanée enregistrée à partir de la zone CA1 / SUB (segment de 20 secondes) et de 2 secondes de segments étendus (ci-dessous) à partir du signal non filtré; Passage passe-bande pour les fréquences theta (0,5 - 12 Hz); Gamma lent (25 - 55 Hz); Et gamma rapide (125 - 250 Hz). Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3: activité spécifique du type cellulaire de la cellule pyramidale et de l'interneuron photovoltaïque lors d'oscillations spontanées de Theta dans la préparation intacte d'hippocampe à partir d'une souris PV-TOM.
(A) l' activité synaptique enregistrée à partir d' une cellule pyramidale pendant thêta oscillations. Les traces de la pince de courant (panneau de gauche) montrent des coupures spontanées mais non rythmiques au repos et des potentiels postsynaptiques inhibiteurs (iPSP) qui n'ont pas été clairement synchronisés avec l'oscillation lent LFP émergente. Les enregistrements de tension (panneau droit) montrent que les courants post-synaptiques inhibiteurs correspondants (iPSC) ont leur potentiel d'inversion autour de -70 mV. ( B ) Activité synaptique enregistrée à partir d'une interneurone photovoltaïque fluorescente rapide lors des oscillations theta. Dans la pince de courant (gauche), cette cellule déclenche spontanément au repos et a été fortement entraînée par des excitateurs rythmiquesPotentiels stsynaptiques (ePSP) qui ont été verrouillés en phase avec l'oscillation LFP stable. Dans les enregistrements tension-clamp (à droite), le potentiel d'inversion du courant postsynaptique excitant était d'environ 0 mV. Les dessins schématiques en haut montrent la configuration expérimentale avec le placement d'électrodes de patch et de terrain dans les images d'agrandissement CA1 / SUB et haute (40X) de la cellule pyramidale enregistrée et de l'interneurone PV fluorescente. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4: Les enregistrements de puces et de puces simultanées locales à partir de neurones pyramidaux et photovoltaïques isolés CA1 / SUB lors d'oscillations Theta optaque et optogénétiques dans l'hippocampe isolé.
(a B ) Caractérisation d'un neurone pyramidal montrant les propriétés typiques de Spike ordinaire (RS) (haut) et l'image de grande amplification (40X) de la cellule enregistrée (en bas). ( C ) Exemple d'enregistrement de la pince de la même cellule au potentiel de la membrane dépolarisée (noir) avec le signal LFP (gris) et montrant des IPSP rythmiques synchronisés pendant l'oscillation spontanée (gauche) et pendant la stimulation de la fréquence de fréquence (6 Hz) ( droite). Le schéma de stimulation de la lumière (ombre bleue) est représenté sur les traces de tension. ( D ) Spectrogramme et spectres de puissance de la forme d'onde LFP avant, pendant et après une simulation de lumière de 6 Hz (ligne de base, stim, post). ( E ) Magnétisme de faible intensité et images de fluorescence de l'isolatPréparation de l'hippocampe montrant la fluorescence eYFP (en vert) localisée dans la région CA1 / SUB. ( F ) La caractérisation des étapes actuelles montrant le comportement de Fast-Spiking (FS) d'une interneurone PV-TOM enregistrée (image de fluorescence 40X ci-dessous). ( G ) Enregistrement du potentiel membranaire montrant des EPSP volumineux et le déclenchement rythmique de la cellule PV enregistrée synchronisée avec le signal LFP pendant l'oscillation du champ spontané (gauche) et pendant la stimulation de la lumière (droite) à 3 Hz. ( H ) Moyenne déclenchée sur le terrain (FTA) des pics de cellules PV sur le signal CA1 / SUB LFP. La décharge de la cellule photovoltaïque sur de multiples essais (centrée sur les sommets LFP) a été convertie en un TCA de pointes enregistrées pendant l'oscillation spontanée (base) et pendant la stimulation de la lumière (stim). Les graphiques du milieu et du bas montrent les parcelles raster des pointes et des histogrammes de probabilité de pointe (la probabilité moyenne est indiquée en rouge). Les graphiques les plus élevés montrent des parcelles du signal LFP moyen qui a augmenté en puissance pendant le ligLa stimulation ht en parallèle avec le déclenchement hautement synchronisé de la cellule photovoltaïque phase-verrouillé au pic de l'oscillation LFP. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
| SUCROSE SOLUTION (1X) POUR HIPPOCAMPUS ISOLÉ | |||
| (Solution stock) | |||
| Composé | MW | Final Conc. (MM) | Montant pour 1 L (g) |
| saccharose | 342,3 | 252 | 86,26 g |
| NaHCO 3 | 84.01 | 24 | 2,020 g |
| glucose | 180,2 | dix | |
| KCl | 74,55 | 3 | 0,223 g |
| MgSO 4 | 120,4 | 2 | 0,241 g |
| NaH 2 PO 4 | 120 | 1,25 | 0,150 g |
| CaCl 2 .2H2O [1 M] stock | 147 | 1.2 | 120 μL / 0,1 L * |
| * Ajouter 360 ul de CaCl2 [1 M] pour 0,3 L oxygéné solution de saccharose | |||
| PH = 7,4 lorsqu'il est oxygéné, Osm 310 - 320 | |||
Tableau 1.
| SOLUTION ACSF STANDARD (5X) POUR PERFUSION | |||
| (Solution stock) | |||
| Composé | MW | Final Conc. (MM) | Montant pour 2 L 5X |
| NaCl | 58,44 | 126 | 73,6 |
| NaHCO 3 | 84.01 | 24 | 20.2 |
| glucose | 180,2 | dix | 18 |
| KCl | 74,55 | ♦ 4.5 | 3.355 |
| MgSO 4 | 120,4 | 2 | 2.41 |
| NaH 2 PO 4 | 120 | 1,25 | 1.5 |
| Ascorbate | 176,1 | 0,4 | 0,705 |
| CaCl 2 .2H2O [1 M] stock | 147 | 2 | 2 mL / L * |
| * Ajouter 2 ml de CaCl 2 [1 M] pour 1 L aCSF (1x) de la solution oxygénée | |||
| PH = 7,4 lorsqu'il est oxygéné, Osm 310 - 320 | |||
| ♦ A légèrement élevée [K +] o est utilisée pour cette solution ACSF ( par rapport à la normale aCSF 2,5 mM de KCl) pour augmenter l' excitabilité de réseaux hippocampiques et faciliter l'émergence de thêta oscillations. | |||
Tableau 2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bien que les enregistrements électrophysiologiques à partir de tranches d'hippocampe aiguë constituent une technique standard in vitro , les méthodes présentées ici diffèrent sensiblement de l'approche classique. Contrairement aux préparations en tranche mince où des couches cellulaires spécifiques sont visibles à la surface et peuvent être examinées directement, les préparations intactes d'hippocampe sont plus proches des configurations in vivo où les électrodes sont abaissées dans des régions cérébrales ciblées tout en traversant des couches individuelles. L'intégrité de l'hippocampe est préservée avec la connectivité fonctionnelle et les propriétés des populations neuronales locales. Cela fournit un outil complexe et puissant pour enquêter sur les oscillations du réseau à petite et grande échelle dans l'hippocampe. Par exemple, la combinaison de circuits pré-câblés et de propriétés spécifiques au type de cellule dans le réseau produit des oscillations théâques et gamma rythmées intrinsèquement et spontanément qui imitent les caractéristiques importantes de l'hippocaActivité mpal in vivo . En utilisant les méthodes présentées dans ce protocole, l'hippocampe peut être extrait rapidement du cerveau des rongeurs et reste viable pendant plusieurs heures dans un environnement aCSF à écoulement rapide. Les techniques électrophysiologiques de base sont facilement appliquées pour étudier comment l'activité synchrone et la fonction synaptique des types neuronaux spécifiques influencent la dynamique de l'hippocampe.
Notre procédure a été la première occasion d'explorer systématiquement la dynamique des oscillations locales du potentiel sur l'ensemble de l'axe septo-temporel (dorso-ventral) de l'hippocampe in vitro (voir les Réf. 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27 , 28 ). Au niveau du réseau et physiologique, la préparation intacte conserve: 1) la fonction synaLes interactions ptiques entre les cellules nécessaires pour supporter de manière fiable les oscillations intrinsèques du réseau avec la gamme de fréquences et le profil des ondes theta in vivo , 2) la variation nette de la phase relative de l'oscillation theta au niveau de la strate pyramidale, 3) la répartition spatiale et la cohérence de la theta L'oscillation dans l'hippocampe et son interaction avec les rythmes locaux de fréquence gamma, 4) la relation amplitude-phase des ondes gamma / gamma et 5) l'association temporelle spécifique de la cellule principale et de l'interneurone avec des oscillations theta du potentiel de champ.
Alors que l'absence d'apport externe à l'hippocampe peut apparaître comme une limitation de la technique, elle permet également d'étudier la dynamique interne de l'hippocampe d'une manière qui ne peut être réalisée in vivo . De plus, les entrées externes peuvent être imitées par la stimulation optogénétique de terminaux de fibres spécifiques et de voies afférentes. Les préparations intactes offrent de nouvelles possibilités d'étudeComment les activités du réseau se propagent et interagissent dans des réseaux à grande échelle impliquant l'hippocampe et d'autres structures connectées. En tant que tel, une application principale de la technique de préparation intacte est l'étude de la connectivité du réseau fonctionnel au sein ou entre les régions du cerveau. L'utilisation de l'hippocampe intact in vitro devrait donc non seulement fournir d'autres informations sur les propriétés cellulaires et réseau de l'hippocampe, mais aussi éclairer la façon dont ces interactions mettent en forme le traitement, l'intégration et la génération d'informations dans le cerveau.
Les oscillations du réseau rythmique qui s'engagent dans la signalisation électrochimique coordonnée des grands ensembles neuronaux servent de mécanisme central pour encoder, stocker et transférer des informations à l'intérieur et à travers les zones cérébrales. Les oscillations de l'hippocampe sont cruciales pour le traitement de l'information spatiotemporelle, du codage et de la mémoire. À l'inverse, on pense que le dysfonctionnement de l'hippocampe sous-tend les troubles sucH comme la maladie d'Alzheimer et la schizophrénie, qui sont associés à des modèles d'oscillation altérés 29 . En tant que tel, l'étude des oscillations autochimiques de l'hippocampe à l'aide de préparations intactes d'hippocampe est devenue un moyen renouvelé d'élucider les propriétés basiques de la fonction et du dysfonctionnement du système nerveux.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Les auteurs ne déclarent aucun intérêt commercial ou financier concurrent.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par les Instituts de recherche en santé et sciences naturelles du Canada.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Sodium Chloride | Sigma Aldrich | S9625 | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S9378 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma Aldrich | S5761 | |
| NaH2PO4 - sodium phosphate monobasic | Sigma Aldrich | S8282 | |
| Magnesium sulfate | Sigma Aldrich | M7506 | |
| Potassium Chloride | Sigma Aldrich | P3911 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma Aldrich | G7528 | |
| Calcium chloride dihydrate | Sigma Aldrich | C5080 | |
| Sodium Ascorbate | Sigma Aldrich | A7631-25G | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Standard Dissecting Scissors | Fisher Scientific | 08-951-25 | brain extraction |
| Scalpel Handle #4, 14 cm | WPI | 500237 | brain extraction |
| Filter forceps, flat jaws, straight (11 cm) | WPI | 500456 | brain extraction |
| Paragon Stainless Steel Scalpel Blades #20 | Ultident | 02-90010-20 | brain extraction |
| Fine Point Curved Dissecting Scissors | Thermo Fisher Scientific | 711999 | brain extraction |
| Teflon (PTFE) -coated thin spatula | VWR | 82027-534 | hippocampal preparation |
| Hayman Style Microspatula | Fisher Scientific | 21-401-25A | hippocampal preparation |
| Lab spoon | Fisher Scientific | 14-375-20 | hippocampal preparation |
| Borosilicate Glass Pasteur Pipets | Fisher Scientific | 13-678-20A | hippocampal preparation |
| Droper | Fisher Scientific | hippocampal preparation | |
| Razor blades Single edged | VWR | 55411-055 | hippocampal preparation |
| Lens paper (4 x 6") | VWR | 52846-001 | hippocampal preparation |
| Glass petri dishes (100 x 20 mm) | VWR | 25354-080 | hippocampal preparation |
| Plastic tray for ice; size 30 x 20 x 5 cm | n.a. | n.a. | hippocampal preparation |
| Single Inline Solution Heater | Warner Instruments | SH-27B | perfusion system |
| Aquarium air stones for bubbling | n.a. | n.a. | perfusion system |
| Tygon E-3603 tubing (ID 1/16 OD 1/8) | Fisherbrand | 14-171-129 | perfusion system |
| Electric Skillet | Black & Decker | n.a. | perfusion system |
| 95% O2/5% CO2 gas mixture (carbogen) | Vitalaire | SG466204A | perfusion system |
| Glass bottles/flasks (4 x 1 L) | n.a. | n.a. | perfusion system |
| Submerged recording Chamber | custom design (FM) | n.a. | Commercial alternative may be used |
| Glass pipettes (1.5/0.84 OD/ID (mm) ) | WPI | 1B150F-4 | electrophysiology |
| Hum Bug 50/60 Hz Noise Eliminator | Quest Scientific | Q-Humbug | electrophysiology |
| Multiclamp 700B patch-clamp amplifier | Molecular devices | MULTICLAMP | electrophysiology |
| Multiclamp 700B Commander Program | Molecular devices | MULTICLAMP | electrophysiology |
| Digital/Analogue converter | Molecular devices | DDI440 | electrophysiology |
| PCLAMP10 | Molecular devices | PCLAMP10 | electrophysiology |
| Vibration isolation table | Newport | n.a. | electrophysiology |
| Micromanipulators (manually operated ) | Siskiyou | MX130 | electrophysiology (LFP) |
| Micromanipulators (automated) | Siskiyou | MC1000e | electrophysiology (patch) |
| Audio monitor | A-M Systems | Model 3300 | electrophysiology |
| Micropipette/Patch pipette puller | Sutter | P-97 | electrophysiology |
| Custom-built upright fluorescence microscope | Siskiyou | n.a. | Imaging |
| Analogue video camera | COHU | 4912-2000/0000 | Imaging |
| Digital frame grabber with imaging software | EPIX, Inc | PIXCI-SV7 | Imaging |
| Olympus 2.5X objective | Olympus | MPLFLN | Imaging |
| Olympus 40X water immersion objective | Olympus | UIS2 LUMPLFLN | Imaging |
| Custom-made Light-Emitting Diode (LED) system | custom | n.a. | optogenetic stimulation (Amhilon et al., 2015) |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Animals | |||
| PV::Cre (KI) mice | Jackson Laboratory | stock number 008069 | Allow Cre-directed gene expression in PV interneurons |
| Constitutive-conditional Ai9 mice (R26-lox-stop-lox-tdTomato (KI)) | Jackson Laboratory | stock number 007905 | Express TdTomato following Cre-mediated recombination |
| Ai32 mice (R26-lox-stop-lox-ChR2(H134R)-EYFP | Jackson Laboratory | stock number 012569 |
Express the improved channelrhodopsin-2/EYFP fusion protein following exposure to Cre recombinase |
| PVChY mice | In house breeding | n.a. | Offspring obtained from cross-breeding the PV-Cre line with Ai32 mice (R26-lox-stop-lox-ChR2(H134R)-EYFP |
References
- Buzsaki, G. Theta rhythm of navigation: link between path integration and landmark navigation, episodic and semantic memory. Hippocampus. 15 (7), 827-840 (2005).
- Sanders, H., Renno-Costa, C., Idiart, M., Lisman, J. Grid Cells and Place Cells: An Integrated View of their Navigational and Memory Function. Trends Neurosci. 38 (12), 763-775 (2015).
- O'Keefe, J., Recce, M. L. Phase relationship between hippocampal place units and the EEG theta rhythm. Hippocampus. 3 (3), 317-330 (1993).
- Winson, J. Loss of hippocampal theta rhythm results in spatial memory deficit in the rat. Science. 201 (4351), 160-163 (1978).
- M'Harzi, M., Jarrard, L. E. Strategy selection in a task with spatial and nonspatial components: effects of fimbria-fornix lesions in rats. Behav Neural Biol. 58 (3), 171-179 (1992).
- Osipova, D., et al. Theta and gamma oscillations predict encoding and retrieval of declarative memory. J Neurosci. 26 (28), 7523-7531 (2006).
- Stumpf, C., Petsche, H., Gogolak, G. The significance of the rabbit's septum as a relay station between the midbrain and the hippocampus. II. The differential influence of drugs upon both the septal cell firing pattern and the hippocampus theta activity. Electroencephalogr Clin Neurophysiol. 14, 212-219 (1962).
- Mitchell, S. J., Ranck, J. B. Generation of theta rhythm in medial entorhinal cortex of freely moving rats. Brain Res. 189 (1), 49-66 (1980).
- Alonso, A., Garcia-Austt, E. Neuronal sources of theta rhythm in the entorhinal cortex of the rat. I. Laminar distribution of theta field potentials. Exp Brain Res. 67 (3), 493-501 (1987).
- Vertes, R. P., Kocsis, B. Brainstem-diencephalo-septohippocampal systems controlling the theta rhythm of the hippocampus. Neuroscience. 81 (4), 893-926 (1997).
- Bland, B. H., Colom, L. V., Konopacki, J., Roth, S. H. Intracellular records of carbachol-induced theta rhythm in hippocampal slices. Brain Res. 447 (2), 364-368 (1988).
- Cobb, S. R., Buhl, E. H., Halasy, K., Paulsen, O., Somogyi, P. Synchronization of neuronal activity in hippocampus by individual GABAergic interneurons. Nature. 378 (6552), 75-78 (1995).
- Williams, J. H., Kauer, J. A. Properties of carbachol-induced oscillatory activity in rat hippocampus. J Neurophysiol. 78 (5), 2631-2640 (1997).
- Chapman, C. A., Lacaille, J. C. Cholinergic induction of theta-frequency oscillations in hippocampal inhibitory interneurons and pacing of pyramidal cell firing. J Neurosci. 19 (19), 8637-8645 (1999).
- Strata, F. Intrinsic oscillations in CA3 hippocampal pyramids: physiological relevance to theta rhythm generation. Hippocampus. 8 (6), 666-679 (1998).
- Kocsis, B., Bragin, A., Buzsaki, G. Interdependence of multiple theta generators in the hippocampus: a partial coherence analysis. J Neurosci. 19 (14), 6200-6212 (1999).
- Fellous, J. M., Sejnowski, T. J. Cholinergic induction of oscillations in the hippocampal slice in the slow (0.5-2 Hz), theta (5-12 Hz), and gamma (35-70 Hz) bands. Hippocampus. 10 (2), 187-197 (2000).
- Gillies, M. J., et al. A model of atropine-resistant theta oscillations in rat hippocampal area CA1. J Physiol. 543 (Pt 3), 779-793 (2002).
- Gloveli, T., et al. Orthogonal arrangement of rhythm-generating microcircuits in the hippocampus. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (37), 13295-13300 (2005).
- Konopacki, J., Eckersdorf, B., Kowalczyk, T., Golebiewski, H. Firing cell repertoire during carbachol-induced theta rhythm in rat hippocampal formation slices. Eur J Neurosci. 23 (7), 1811-1818 (2006).
- Hajos, N., et al. Maintaining network activity in submerged hippocampal slices: importance of oxygen supply. Eur J Neurosci. 29 (2), 319-327 (2009).
- Manseau, F., Goutagny, R., Danik, M., Williams, S. The hippocamposeptal pathway generates rhythmic firing of GABAergic neurons in the medial septum and diagonal bands: an investigation using a complete septohippocampal preparation in vitro. J Neurosci. 28 (15), 4096-4107 (2008).
- Goutagny, R., Jackson, J., Williams, S. Self-generated theta oscillations in the hippocampus. Nat Neurosci. 12 (12), 1491-1493 (2009).
- Jackson, J., Goutagny, R., Williams, S. Fast and slow gamma rhythms are intrinsically and independently generated in the subiculum. J Neurosci. 31 (34), 12104-12117 (2011).
- Amilhon, B., et al. Parvalbumin Interneurons of Hippocampus Tune Population Activity at Theta Frequency. Neuron. 86 (5), 1277-1289 (2015).
- Huh, C. Y., et al. Excitatory Inputs Determine Phase-Locking Strength and Spike-Timing of CA1 Stratum Oriens/Alveus Parvalbumin and Somatostatin Interneurons during Intrinsically Generated Hippocampal Theta Rhythm. J Neurosci. 36 (25), 6605-6622 (2016).
- Gu, N., et al. NMDA-dependent phase synchronization between septal and temporal CA3 hippocampal networks. J Neurosci. 33 (19), 8276-8287 (2013).
- Jackson, J., et al. Reversal of theta rhythm flow through intact hippocampal circuits. Nat Neurosci. 17 (10), 1362-1370 (2014).
- Gonzalez-Burgos, G., Lewis, D. A. GABA neurons and the mechanisms of network oscillations: implications for understanding cortical dysfunction in schizophrenia. Schizophr Bull. 34 (5), 944-961 (2008).
