Summary
Aqui, apresentamos um protocolo para a gravação da teta de rede neuronal rítmica e das oscilações gama de uma preparação isolada do hipocampo inteiro. Descrevemos os passos experimentais da extração do hipocampo para detalhes de gravações de grampos de campo, unidade e toda célula, bem como a estimulação optogenética do ritmo de theta.
Abstract
Este protocolo descreve os procedimentos para a preparação e gravação do hipocampo inteiro isolado, de WT e camundongos transgênicos, além de melhorias recentes em metodologias e aplicações para o estudo das oscilações theta. Uma caracterização simples da preparação isolada do hipocampo é apresentada pelo qual a relação entre os osciladores internamente da teta do hipocampo é examinada em conjunto com a atividade das células piramidais e interneurônios GABAérgicos, nas áreas cornu ammonis-1 (CA1) e subículo (SUB). No geral, mostramos que o hipocampo isolado é capaz de gerar oscilações theta intrínsecas in vitro e que a ritmicidade gerada no hipocampo pode ser manipulada com precisão pela estimulação optogenética de interneurônios com parvalbumina positiva (PV). A preparação de hipocampo isolado in vitro oferece uma oportunidade única de usar gravações simultâneas de grampos e grampos intracelulares de neu visualmente identificadoRons para entender melhor os mecanismos subjacentes à geração de ritmo theta.
Introduction
As oscilações do hipocampo (4 - 12 Hz) estão entre as formas mais predominantes de atividade rítmica no cérebro de mamíferos e acreditam desempenhar papéis fundamentais nas funções cognitivas, como o processamento da informação espaciotemporal e a formação de memórias episódicas 1 , 2 , 3 . Enquanto vários estudos in vivo que realçam a relação das células do quadrado modificadas com estudos espaciais de navegação e lesão, além de evidências clínicas, sustentam a visão de que as oscilações do theta do hipocampo estão envolvidas na formação da memória 4 , 5 , 6 , os mecanismos associados Com a geração das oscilações do theta do hipocampo ainda não são totalmente compreendidas. As primeiras investigações in vivo sugeriram que a atividade theta dependia principalmente de osciladores extrínsecos, em particular a entrada rítmicaA partir de estruturas cerebrais aferentes, como o septo e o córtex entorrinal 7 , 8 , 9 , 10 . Um papel para fatores intrínsecos - conectividade interna das redes neurais do hipocampo juntamente com as propriedades dos neurônios do hipocampo - também foi postulado com base em observações in vitro 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 . No entanto, além de alguns estudos históricos 19 , 20 , 21 , dificuldades no desenvolvimento de abordagens que poderiam replicar atividades de população fisiologicamente realistas em simples preparações de fatia in vitroS têm, durante muito tempo, um exame experimental mais detalhado das habilidades intrínsecas do hipocampo e áreas relacionadas para auto-gerar oscilações theta.
Uma desvantagem importante da configuração experimental padrão de fatias finas in vitro é que a organização celular e sináptica 3D das estruturas cerebrais geralmente está comprometida. Isso significa que muitas formas de atividades de rede concertada baseadas em conjuntos de células espacialmente distribuídos, que vão desde grupos localizados (≤ 1 mm de raio) até populações de neurônios espalhados por uma ou mais áreas cerebrais (> 1 mm), não podem ser suportadas. Diante dessas considerações, era necessário um tipo diferente de abordagem para estudar como as oscilações theta emergem no hipocampo e se propagam para estruturas de saída corticais e subcorticais relacionadas.
Nos últimos anos, o desenvolvimento inicial da preparação "septo-hipocampo completo" para examinar a interação bidirecionalAs citações das duas estruturas 22 e a evolução subseqüente da preparação do "hipocampo isolado" revelaram que as oscilações teta intrínsecas ocorrem espontaneamente no hipocampo que não possui entrada rítmica externa 23 . O valor dessas abordagens reside na visão inicial de que toda a estrutura funcional dessas regiões teve que ser preservada para funcionar como um gerador de ritmo theta in vitro 22 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Todos os procedimentos foram realizados de acordo com protocolos e diretrizes aprovados pelo Comitê de Cuidados com Animais da Universidade McGill e pelo Conselho Canadense de Cuidados com Animais.
1. Preparação intacta de hipocampo agudo
NOTA: O isolamento da preparação intacta do hipocampo envolve três etapas principais: (1) Preparação de soluções e equipamentos, (2) Dissecção do hipocampo e (3) Configuração do sistema de taxa de perfusão rápida necessário para geração de oscilações intrínsecas da teta. Neste protocolo, o desempenho atempado dos procedimentos - desde a dissecação até a gravação - é particularmente importante porque o hipocampo isolado constitui uma preparação tão densa, mas delicada, que a manutenção da conectividade funcional da estrutura in vitro requer um grande cuidado. Preparar tudo antes garante que um nível adequado de perfusão esteja disponível o mais cedo possível para minimizar a célula dMelhore e mantenha a função fisiológica.
- Solução de fluidos cerebrais cerebrais artificiais baseados em sacarose (aCSF)
- Prepare a solução de sacarose de estoque 1X a ser utilizada para a dissecção e incubação pós-dissecção. Combine todos os componentes listados na Tabela 1 , com exceção de CaCl 2 , em 1 L de água desionizada e armazene a 4 ° C por até 2 semanas.
- Solução padrão aCSF
- Prepare o aCSF padrão para perfusão de alta taxa de fluxo do hipocampo isolado durante gravações eletrofisiológicas. Para fazer o concentrado (5X) aCSF, dissolva todos os componentes listados na Tabela 2 , exceto o CaCl 2 , em 2 L de água desionizada e armazene a 4 ° C.
- Prepare o equipamento
- Antes de iniciar a dissecação, coloque a área do banco com uma bandeja de plástico cheia de gelo (30 x 20 x 5 cm), linhas de tubulação conectadas ao carbógeno ePratos de Petri de vidro ee (10 x 2 cm) (Ver Figura 1 ).
- Adicionar 300 mL de solução de sacarose (estoque 1X) para um copo de 500 mL, bolha com carbogénio (95% O2, 5% de CO 2) e adicionar Ca 2+ [1,2 mM].
- Transfira 60 mL desta solução de sacarose para uma placa de Petri de vidro e deixe à temperatura ambiente. Coloque o restante em um congelador a 4 ° C durante 10 a 15 min.
- Bolha a solução de sacarose gelada com carbogênio durante a dissecção.
- Encha uma segunda placa de Petri (câmara de retenção a frio) com solução de sacarose (4 ° C) e continue com gelo.
- Adicione 30 mL de solução de sacarose gelada a um copo de 50 mL.
2. Dissecção inteira do hipocampo
NOTA: O método para dissecar o hipocampo isolado é essencialmente idêntico ao desenvolvido e descrito originalmente 22 , mas com detalhes adicionais e mudanças em relação ao peTaxa de rfusão e técnicas de gravação.
- Dissecção cerebral
- Anestesize o mouse (P20 - 35) sob uma chaminé com uma pequena toalha de papel embebida com 1 mL de isoflurano (100%) que é adicionado na gaiola.
- Decapite o mouse anestesiado e submergir rapidamente a cabeça em solução de sacarose gelada (copo de 50 mL, ~ 5 s). Transfira para uma toalha de papel.
- Use um bisturi para fazer uma incisão medial da pele (caudal para rostral) e empurre a pele nos lados para expor o crânio.
- Corte o crânio com uma pequena tesoura e use uma espátula para extrair rapidamente o cérebro e deixá-lo no prato de Petri contendo solução de sacarose gelada. Deixe 1-2 minutos para o cérebro esfriar.
- Enquanto o cérebro está se recuperando, adicione 2 a 3 mL de solução de sacarose em um prato de lentes de vidro coberto com Petri (dissecção) no gelo.
- Isolando o hipocampo
- Coloque o cérebro no prato de dissecção em uma posição verticalN.
- Remova o cerebelo eo córtex frontal com uma lâmina de barbear. Corte o cérebro pela metade ao longo do plano midsagital e retorna os dois hemisférios isolados para a câmara de espera. Permita mais 1 - 2 min para recuperação.
- Coloque o cérebro hemisectado único na vertical na placa de dissecação.
- Gire o prato até as estruturas midsagittal enfrentar o observador e o contorno embutido do complexo septal é visível como uma fina camada de tecido em forma de pera anterior ao tálamo.
- Mantenha o cérebro hemiciculado firme com a microspatula e coloque a pequena extremidade da espátula revestida de politetrafluoroetileno (PTFE) imediatamente atrás (caudal) da área septal.
- Insira a espátula revestida embaixo do septo e mova a ponta para baixo até chegar a placa de dissecação. Segure as fibras que conectam a área septal caudalmente. Repita a mesma operação ao longo da borda anterior do septo e corte as fibras que se conectam à parte frontal do cérebro.
- Com a espátula segurando ligeiramente a parte interna do córtex logo acima do hipocampo em posição vertical, use a microspatula para retirar cuidadosamente os núcleos tálamo, hipotalâmico e do tronco cerebral. Use a espátula para cortar e remover o tecido afastado.
- Transforme o hemisfério isolado do seu lado e identifique o contorno do hipocampo.
- Insira a espátula revestida no ventrículo lateral, embaixo da extremidade rostral do hipocampo dorsal.
- Segure a espátula alinhada horizontalmente com o plano midsagital do cérebro hemi-detrito e deslize-a através do contorno suave das paredes ventriculares até a ponta emergir caudalmente.
- Segure a espátula embaixo do hipocampo e pressione-a ligeiramente sobre as fibras de conexão, ao longo da camada interna, onde o hipocampo se junta ao córtex sobrepente. Aplique a microspatula no lado externo desta camada e deslize contra a espátula revestida para cortar o fioBers.
- Para completar a extração, gire o prato de dissecação e insira a espátula revestida embaixo do hipocampo ventral. Segure levemente o interior da dobra cortical com a espátula e corte através das conexões entorhinais usando um movimento de corte contra a microspatula.
NOTA: Todo o complexo septohipocampal pode ser removido colocando a espátula revestida sob todo o hipocampo e retirando o tecido cerebral restante por baixo. - Uma vez que o isolamento é completo, mantenha o hipocampo descansando no prato e adicione uma gota de solução de sacarose gelada para mantê-lo fresco. Corte cuidadosamente qualquer cortex e fibras restantes e separe o hipocampo do septo aplicando suavemente uma lâmina de barbear através do fórnix.
NOTA: Se as gravações de grampos de patch devem ser realizadas a partir de células piramidais (ver Seção 4.6 Controle optogenético), o hipocampo isolado pode ser cortado transversalmente em um ângulo de 45 ° para expor a camada piramidal de CA1 ("anglE-cut "), sem comprometer os circuitos de rede locais na parte restante do hipocampo. - Transfira a preparação para solução de sacarose à temperatura ambiente e deixe-a recuperar por 15 a 30 min antes de transferir para a câmara de gravação.
3. Configurar a perfusão rápida para gravar o hipocampo isolado
- Configure o sistema de perfusão alimentado por gravidade para permitir uma entrada contínua de alta velocidade de aCSF oxigenado a 20 - 25 mL / min.
- Prepare frascos aCSF (1X) com antecedência e mergulhe-os em um banho de aquecimento (~ 30 ° C) pelo menos 15 minutos antes do início da experiência. Ligue o sistema de aquecimento da solução em linha (30 ° C).
- Use borbulhadores de aquário e linhas de tubagem ligadas a um tanque de carbogénio para oxigenar aCSF ao longo da expericia, e adicionar CaCl2 [2 mM], antes do início da perfusão.
- Pare o fluxo de aCSF e transfira o hipocampo para a câmara de gravação usando a amplaFim de uma pipeta de vidro. Permitir que a preparação saturada de sacarose afunda e se assente no fundo.
- Coloque a preparação no centro da câmara de gravação (em linha com o eixo entrada-saída) com a superfície lisa de CA1 e SUB na parte superior. Estabilize o hipocampo com pequenos pesos nas extremidades septais e temporais e reinicie o fluxo de aCSF.
4. Eletrofisiologia no hipocampo isolado
- Gravação extracelular de oscilações intactas do hipocampo in vitro
- Para o monitoramento extracelular do potencial de campo local (LFP) ou atividade de unidade única do hipocampo isolado in vitro , use micropipetas de vidro (1 - 3 MΩ) preenchidas com aCSF. Gravar sinais de potencial de campo acoplados a CA de baixo ruído com um amplificador de grampo de gramatura de ganho x1000, filtragem de passagem de banda on-line 0,1 - 500 Hz e uma taxa de amostragem de 5-20 kHz.
NOTA: O microscópio personalizado usado neste protocoloEstá equipado com objetivos de baixa (2.5X) e alta ampliação (40X) para visão de baixa ampliação do hipocampo, bem como microscopia de video infravermelho e epifluorescência para reconhecimento de célula única. Os componentes deste sistema incluem o microscópio de fluorescência vertical, cubos de filtro de fluorescência, uma câmera de vídeo analógica e captura de quadros digital com software de imagem, uma câmara de perfusão personalizada no estágio ( Figura 2A , inserção i) e micromanipuladores de alta precisão para gravações neuronais e Colocação de fibra óptica. - Use a câmera montada no microscópio e conectada a uma tela do computador para inspecionar a preparação do hipocampo sob baixa ampliação (2.5X) e verifique rapidamente que não haja cortes inferiores ou danos na superfície externa. O arranjo orientado diagonalmente das fibras de alveus ao longo da superfície lisa de CA1 deve ser visível ( Figura 2A , inserção ii) ao brilhar a luz transmitida através do hipocampopus.
- Use o objetivo de campo largo de ampliação baixa para ver o hipocampo isolado e a colocação de eletrodos LFP em locais de gravação específicos.
NOTA: Um layout da preparação isolada do hipocampo com múltiplos eletrodos colocados em diferentes locais de gravação é ilustrado na Figura 2A . - Abaixe um eletrodo LFP no banho até tocar na superfície (alveus) da área CA1.
NOTA: Isso geralmente produz um transiente rápido na gravação acoplada a CA, semelhante ao que acontece quando o eletrodo entra em contato com a mídia de gravação. Um monitor de áudio pode ser útil para ouvir o sinal do canal LFP após essa etapa.
NOTA: Muitas vezes, os primeiros sinais de atividade só aparecerão após 10-15 minutos, portanto, é importante não avançar rapidamente na preparação. Se, após este período, o eletrodo LFP da superfície ainda não estiver pegando atividade, avançar um pouco mais para baixo através dos estranhos oriensE paie periodicamente para ver se surge alguma forma de atividade ao aproximar-se da camada celular principal. Se nada for detectado após 5 a 10 minutos adicionais, retire cuidadosamente o eletrodo e coloque-o em outro lugar ao longo da mesma região. - Avance o eletrodo LFP através da camada piramidal. Observe que a atividade de exclusão extracelular aumenta inicialmente, uma vez que a única unidade de descarga de neurônios individuais (principalmente células de cesta piramidais e inibitórias) é detectada. Abaixe ainda mais o eletrodo e observe que o pico começa a desaparecer novamente à medida que a ponta cruza no radiatum. Observe que uma oscilação de rede claramente visível na faixa theta-frequency (4 - 12 Hz) se torna aparente e atinge a amplitude máxima (~ 100 - 300 μV), pois a localização da gravação é baixada através do radiatum.
- Para o monitoramento extracelular do potencial de campo local (LFP) ou atividade de unidade única do hipocampo isolado in vitro , use micropipetas de vidro (1 - 3 MΩ) preenchidas com aCSF. Gravar sinais de potencial de campo acoplados a CA de baixo ruído com um amplificador de grampo de gramatura de ganho x1000, filtragem de passagem de banda on-line 0,1 - 500 Hz e uma taxa de amostragem de 5-20 kHz.
- Oscilações de Theta em uma única região
- Para testar as propriedades espaciais das oscilações teta espontâneas na região CA1, coloque a ponta oEletrodo LFP de referência em um local CA1 medial (localizado ao longo do eixo septo-temporal longitudinal) e baixe-o para o radiatum como descrito anteriormente.
- Coloque um segundo eletrodo LFP em um site CA1 (200 - 800 μm septal ou temporal da primeira LFP) e observe que as oscilações CAl theta podem sincronizar em distâncias relativamente grandes.
- Oscilações Theta em camadas
- Para testar as propriedades das oscilações theta em camadas do hipocampo, deixe um eléctrodo LFP de referência em um local CA1 radiatum. A partir de apenas acima do estrato oriens, abaixe um segundo eletrodo na camada de células piramidais e através do radiatum. Observe uma inversão gradual do sinal LFP (inversão relativa da fase) através da camada piramidal.
NOTA: Para exemplos representativos desses tipos de atividade, veja a Figura 2B . Exemplos de perfis laminar / profundidade e análise de densidade de fonte atual (CSD)Está ilustrando o local de reversão de fase em hipocampos isolados que foram publicados anteriormente 23 , 24 , 25 .
- Para testar as propriedades das oscilações theta em camadas do hipocampo, deixe um eléctrodo LFP de referência em um local CA1 radiatum. A partir de apenas acima do estrato oriens, abaixe um segundo eletrodo na camada de células piramidais e através do radiatum. Observe uma inversão gradual do sinal LFP (inversão relativa da fase) através da camada piramidal.
- Oscilações gamma e acoplamento theta-gamma no hipocampo intacto
- Coloque um eléctrodo de campo na borda CA1 / SUB e abaixe-o até que ele fique na interface entre as camadas piramidais e moleculares. A este nível, um potencial de campo exibindo oscilações nítidas claras com mudanças na amplitude que o bloqueio de fase ao ritmo theta local pode ser gravado 24 . Ajuste a escala para observar a escala de tempo lenta do acoplamento theta-gamma. Note-se que as explosões de gama ocorrem em duas bandas de freqüência distintas, que podem ser reveladas através da filtragem passa-banda do sinal LFP em curso na faixa lenta (25 - 50 Hz) e gama rápida (150 - 250 Hz) (veja a Figura 2C para o filtro representado Traços).
- Gravação de grampos de patch de células inteiras durante as oscilações de theta do hipocampo in vitro
NOTA: Nesta parte do protocolo, o objetivo é obter gravações de grampos de patch de células inteiras guiadas visualmente de interneurônios identificados em hipocampos isolados de camundongos PV-TOM transgênicos que expressam a proteína fluorescente, tdTomato, sob o controle do promotor PV (para Mais detalhes veja materiais e Ref 26 ).- Use microscopia de vídeo de fluorescência com ampliação baixa (2.5X) e alta potência (40X) para visualizar os interneurônios tdTomato-positivos localizados perto da superfície de uma preparação do hipocampo a partir de um mouse PV-TOM ( Figura 3 ). Note-se que, embora os neurônios PV-TOM possam ser visualizados com sucesso e direcionados para o parto através do alvéoto (até 100 μm), as células piramidais não fluorescentes também podem ser alcançadas com bastante facilidade quando o hipocampo é preparado com a técnica de corte angular (ver Nota da Seção 2.2.14).
- Sob uma visão de baixa ampliação do hipocampo, coloque um eletrodo LFP em CA1 / SUB para monitorar as oscilações theta enquanto se prepara para experimentos de grampos patch.
- Mude para a ampliação 40X e mergulhe o objetivo sobre a região alvo; Abaixe-o até que as camadas superiores se tornem visíveis. Manipule a posição do microscópio para garantir um acesso aberto suficiente para a aproximação da pipeta do lado oposto.
- Sob microscopia de fluorescência, selecione uma célula fluorescente de PV-TOM e aproxime-a com uma pipeta de patch (2 - 3 MΩ) preenchida com solução intracelular padrão.
- Use uma peça de boca para aplicar pressão positiva leve à pipeta e monitore a resistência à medida que o eletrodo é baixado para a célula. Quando a ponta encontra a célula alvo, a resistência da pipeta aumenta e uma covinha transparente aparece quando a pressão positiva empurra a membrana. Solte a pressão e verifique se o pulso atual se aplana quando um selo começa a se formar. Imediatamente clAmplificador para um potencial hiperpolarizado (-70 mV), e uma vez que uma vedação GΩ é alcançada, rompa a membrana celular com uma pequena quantidade de pressão negativa aplicada através do suporte da pipeta.
- Uma vez na configuração de células inteiras, examine as propriedades fisiológicas da célula fotovoltaica identificada durante oscilações espontâneas do hipocampo ( Figura 3B ).
- Observe que a gravação de potencial de membrana intracelular a partir de células fotovoltaicas é caracterizada por comportamento de pico rápido e rajadas de potenciais de ação sincronizados com o ritmo de onda CA1 / SUB contínuo.
- Mude para a tensão-braçadeira e mantenha a célula em diferentes potenciais de membrana para caracterizar a proporção das correntes sinápticas excitatórias versus inibitórias geradas pela atividade rítmica intrínseca. Um exemplo de gravação de grampos patch de uma célula piramidal é mostrado na Figura 3A para comparação.
- Controle optogenético no hipocampo isolado NOTA: Para o controle optogenético da atividade da rede do hipocampo, uma estratégia específica do tipo celular envolvendo ativação rítmica de células GABAérgicas contendo PV é usada aqui, pois essas células mostraram desempenhar um papel importante na sincronização das principais populações celulares no hipocampo isolado 25 . A expressão seletiva da canalrhodopsina-2 excitadora (ChR2) em células fotovoltaicas é conseguida atravessando a linha de mouse PV-Cre com camundongos que expressam constitutivamente ChR2 Cre-dependentemente (Ai32), gerando assim ratos PV-ChY. Alternativamente, as construções de vetores virais ( por exemplo , AAVdj-ChETA-eYFP) podem ser injetadas no hipocampo de ratos PV-Cre ou PV-TOM (P15-16) para direcionar a expressão do opsin excitatório em interneurônios CA1 / SUB ( Figura 4A ).
NOTA: Esta estratégia foi descrita anteriormente 25 .- Coloque um eletrodo LFP na área CA1 / SUB e repare uma célula piramidal próxima no hipoco isoladoAmpus de um mouse que expressa o opsin excitatório sensível à luz azul ChR2 em interneurônios PV.
- Coloque uma guia de luz de fibra óptica (0,2 - 1 mm de diâmetro) acima da preparação do hipocampo e centre-a na região registrada. Use luz azul (473 nm) a partir de uma fonte de LED para estimulação optogenética, consistindo em pulsos de luz (10 - 20 ms, acionados por um sinal de transistor-transistor), ou comandos de tensão de onda sinusoidal entregues nas freqüências de theta (4 - 12 Hz).
NOTA: O conjunto personalizado de estimulação de luz com base em LED foi descrito em outro lugar 25 . - Mude para o grampo atual e caracterize a atividade da piramidal durante oscilações espontâneas da teta.
- Comece o protocolo de estimulação e registre as respostas da luz. Considere que as oscilações do campo e a atividade sináptica no neurônio gravado se sincronizam cada vez mais durante a estimulação optogenética e que a estimulação rítmica das células fotovoltaicas resulta em um controle robusto das duas frequênciasIncitação e potência das oscilações theta ( Figura 4 ).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Esta seção ilustra exemplos de resultados que podem ser obtidos estudando oscilações theta na preparação de hipocampo isolado no mouse in vitro . O procedimento de dissecção para extração do hipocampo isolado está ilustrado na Figura 1 . Usando esta preparação, as oscilações teta intrínsecas podem ser examinadas durante a colocação de eletrodos de campo múltiplos, registrando atividade geral e entradas sinápticas sincronizadas para populações neuronais em diferentes regiões e camadas do hipocampo isolado ( Figura 2 ). Os resultados representativos da grampeamento simultâneo de grampos de células inteiras e gravações extracelulares são apresentados para caracterizar as propriedades de disparo e sináptica de tipos celulares específicos durante oscilações espontâneas do hipocampo ( Figura 3 ), bem como durante a manipulação optogenética da atividade rítmica (G "> Figura 4).
Figura 1: Procedimento de dissecação para a preparação isolada de hipocampo intacto.
(A) Vista geral da configuração dissecção. Topo direito: balão de solução de sacarose gelatinizada gelatinada (1); Inferior esquerda: bandeja de plástico cheia de gelo (2) segurando o prato de dissecação coberto com papel de lentes (3); A câmara de retenção a frio contendo solução de sacarose (4); E um conjunto de ferramentas cirúrgicas (5). ( B ) Vista do cérebro do mouse antes da hemisecão no prato de dissecação. ( C ) Recuperação do cérebro hemisecado na câmara de retenção a frio e vista ampliada (inserção) do hemisfério cerebral esquerdo antes de inserir a extremidade pequena da espátula revestida sob o septo. ( D ) Espátula revestida colocada sob o hipocampo isolado, ao longo da região CA1 / SUB, com o cérebro restanteO tecido é puxado para fora por baixo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Configuração da Configuração para Gravação de Ontas Theta in vitro da Preparação Intacta do Hipocampo na Câmara de Gravação Submersa.
(A) O hipocampo é mostrado isolado com um esquema de regiões do hipocampo e múltiplos eléctrodos colocados em quatro locais de gravação diferentes distribuídos septotemporally (indicado por asteriscos branco). Na vista da plataforma da câmara de gravação mostrada acima (inserção i), a entrada e a saída para fluxo de perfusão rápida são indicadas pelos números (1, 2). Na imagem ampliada do hipocampo mostrado abaixo (inserção ii), um único eletrodo é colocado no meioCA1 sepetotécnico e as fibras dos alvéolos são facilmente visíveis, correndo diagonalmente em direção ao subículo. S: septal, T: temporal, f / fx: fimbria-fornix. ( B ) Representação esquemática da organização de camadas CA1 com traços LFP representativos gravados simultaneamente de stratum oriens (cinza) e stratum radiatum (preto). Observe a fase invertida de sinais entre as duas camadas. Alv: stratum alveus, PR: stratum pyramidale, SR: stratum radiatum. SLM: Stratum Lacunosum Moleculare. ( C ) Exemplo de Rastreamento de LFP que mostra oscilação teta espontânea gravada a partir da área CA1 / SUB (segmento de 20 segundos) e segmentos expandidos de 2 segundos (abaixo) de sinal não filtrado; Passagem de banda filtrada para freqüências theta (0,5 - 12 Hz); Gama lenta (25 - 55 Hz); E gama rápida (125 - 250 Hz). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Atividade específica do tipo celular da célula piramidal e PV Interneuron durante as oscilações da teta espontânea na preparação intacta do hipocampo a partir de um mouse PV-TOM.
(A) actividade sináptica gravado a partir de uma célula piramidal durante teta oscilações. Os traços do braço atual (painel esquerdo) mostram disparo espontâneo, mas não rítmico em repouso, e potenciais pós-sinápticos inibitórios (iPSPs) que não estavam claramente sincronizados com a oscilação do LFP lentamente emergente. As gravações de tensão (painel direito) mostram que as correspondentes correntes inibitórias inibitórias (iPSCs) têm seu potencial de reversão em torno de -70 mV. ( B ) Atividade sináptica registrada a partir de um interneurônio PV fluorescente de rápida expansão durante as oscilações de theta. No braçadeira atual (esquerda), esta célula disparou espontaneamente em repouso e foi fortemente conduzida por poções excitatórias rítmicasPotenciais stsinápticos (ePSPs) que foram bloqueados em fase com a oscilação estável do LFP. Nas gravações de tensão-braçadeira (direita), o potencial excitatório de reversão da corrente pós-sináptica foi de aproximadamente 0 mV. Os desenhos esquemáticos em cima mostram a configuração experimental juntamente com a colocação de eléctrodos de parche e campo nas imagens de ampliação CA1 / SUB e alta (40X) da célula piramidal registrada e internurônico PV fluorescente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Potenciais de campo local e gravações simultâneas de pinças de cliques a partir de neurônios piramidais e PV VPN únicos CA1 / SUB durante as oscilações de Theta espontâneas e optogeneticamente no Hipocampo isolado.
( Um B ) Caracterização de um neurônio piramidal que mostra as propriedades típicas do Spike regular (RS) (superior) e alta ampliação (40X) da célula gravada (inferior). ( C ) Gravação de corrente de corrente da amostra da mesma célula em potencial de membrana despolarizada (preto) juntamente com o sinal LFP (cinza) e mostrando IPSPs rítmicos sincronizados durante a oscilação espontânea (esquerda) e durante a estimulação de luz de frequência de onda (6 Hz) ( certo). O padrão de estimulação de luz (sombreamento azul) é representado em cima dos traços de tensão. ( D ) Spectrograma e espectro de potência da forma de onda LFP antes, durante e após uma simulação de luz de 6 Hz (linha de base, estimulação, pós). ( E ) Imagens de campo brilhante e de fluorescência de baixa ampliação do isolatPreparação de hipocampo mostrando fluorescência de eYFP (em verde) localizada na região CA1 / SUB. ( F ) Caracterização de etapas atuais mostrando o comportamento de Fast-Spiking (FS) de um interneurônio PV-TOM gravado (imagem de fluorescência 40X abaixo). ( G ) Gravação de potencial de membrana mostrando grandes EPSPs e disparo rítmico da célula fotográfica gravada sincronizada com o sinal LFP durante a oscilação espontânea do campo (esquerda) e durante a estimulação de luz (direita) a 3 Hz. ( H ) Média de Disparo de Campo (FTA) de picos de células PV sobre o sinal CA1 / SUB LFP. A descarga da célula fotovoltaica em múltiplos ensaios (centrada nos picos da LFP) foi convertida em FTA de picos registrados durante a oscilação espontânea (linha de base) e durante a estimulação de luz (stim). Gráficos médios e inferiores mostram as parcelas de espetadas e histogramas de probabilidade de pico (a probabilidade média é mostrada em vermelho). Os gráficos mais altos mostram gráficos do sinal LFP médio que aumentou em potência durante o ligHt estimulação em paralelo com disparo altamente sincronizado da célula fotovoltaica fase-bloqueada para o pico da oscilação LFP. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| SOLUÇÃO DE SUCROSE (1X) PARA HIPPOCAMPUS ISOLADO | |||
| (Solução de estoque) | |||
| Composto | MW | Final Conc. (milímetros) | Quantidade para 1 L (g) |
| Sacarose | 342.3 | 252 | 86,26 g |
| NaHCO 3 | 84.01 | 24 | 2,020 g |
| glicose | 180,2 | 10 | |
| KCl | 74,55 | 3 | 0,223 g |
| MgSO 4 | 120,4 | 2 | 0,241 g |
| NaH 2 PO 4 | 120 | 1,25 | 0,150 g |
| CaCl 2 .2H2O [1 M] stock | 147 | 1.2 | 120 μL / 0,1 L * |
| * Adicionar 360 uL de CaCl2 [1 M] durante 0,3 L de solução de sacarose oxigenado | |||
| PH = 7,4 quando oxigenado, Osm 310 - 320 | |||
Tabela 1.
| SOLUÇÃO DE ACSF STANDARD (5X) PARA PERFUSÃO | |||
| (Solução de estoque) | |||
| Composto | MW | Final Conc. (milímetros) | Quantidade para 2 L 5X |
| NaCl | 58,44 | 126 | 73.6 |
| NaHCO 3 | 84.01 | 24 | 20.2 |
| glicose | 180,2 | 10 | 18 |
| KCl | 74,55 | ♦ 4.5 | 3.355 |
| MgSO 4 | 120,4 | 2 | 2.41 |
| NaH 2 PO 4 | 120 | 1,25 | 1,5 |
| Ascorbato | 176.1 | 0,4 | 0,705 |
| CaCl 2 .2H2O [1 M] stock | 147 | 2 | 2 mL / L * |
| * Adicionar 2 ml de CaCl 2 [1 M] durante 1 L aCSF (1x) solução oxigenada | |||
| PH = 7,4 quando oxigenado, Osm 310 - 320 | |||
| ♦ Um [K + ] o ligeiramente elevado é usado para esta solução de aCSF (em comparação com o KCl normal aCSF 2,5 mM) para aumentar a excitabilidade das redes do hipocampo e facilitar o surgimento das oscilações theta. | |||
Mesa 2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Embora as gravações eletrofisiológicas de fatias agudas do hipocampo constituam uma técnica in vitro padrão, os métodos aqui apresentados diferem substancialmente da abordagem clássica. Ao contrário das preparações finas em fatias onde as camadas celulares específicas são visíveis na superfície e podem ser examinadas diretamente, as preparações intactas do hipocampo são mais parecidas com as configurações in vivo onde os eletrodos são abaixados em regiões cerebrais direcionadas enquanto atravessam camadas individuais. A integridade do hipocampo é preservada juntamente com conectividade funcional e propriedades das populações neuronais locais. Isso fornece uma ferramenta complexa e poderosa para investigar pequenas e grandes oscilações de rede no hipocampo. Por exemplo, a combinação de circuitos pré-conectados e as propriedades específicas do tipo celular na rede produzem ondas tete e gamma rítmicas geradas intrinsecamente e espontaneamente que imitam características importantes da hipocaminaAtividade mpal in vivo . Usando os métodos apresentados neste protocolo, o hipocampo pode ser extraído rapidamente do cérebro do roedor e permanecer viável por várias horas em um ambiente aCSF de fluxo rápido. As técnicas eletrofisiológicas básicas são facilmente aplicadas para investigar como a atividade síncrona e a função sináptica de tipos neuronais específicos influenciam a dinâmica do hipocampo.
O nosso procedimento proporcionou a primeira oportunidade de explorar sistematicamente a dinâmica das oscilações de potencial de campo local em todo o eixo septo-temporal (dorso-ventral) do hipocampo in vitro (ver Refs 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27 , 28 ). Na rede e nos níveis fisiológicos, a preparação intacta preserva: 1) O sistema operacional synaInterações entre as células necessárias para suportar de forma confiável as oscilações da rede intrínseca com a faixa de freqüência e o perfil das ondas de theta in vivo , 2) A mudança acentuada na fase relativa da oscilação de theta ao nível do estrato pyramidale, 3) A distribuição espacial e a coerência da theta Oscilação no hipocampo e sua interação com os ritmos locais de freqüência gama, 4) a relação amplitude-fase das ondas theta / gamma e 5) a associação temporal específica da célula principal e internuron com as oscilações theta do potencial de campo.
Enquanto a ausência de entrada externa ao hipocampo pode parecer uma limitação da técnica, também permite o estudo da dinâmica interna do hipocampo de maneira que não pode ser realizada in vivo . Além disso, as entradas externas podem ser imitadas pela estimulação optogenética de terminais de fibra específicos e vias aferentes. Os preparativos intactos oferecem novas possibilidades de estudoComo as atividades da rede se propagam e interagem em redes de grande escala que envolvem o hipocampo e outras estruturas conectadas. Como tal, uma aplicação principal da técnica de preparação intacta é a investigação da conectividade de rede funcional dentro ou entre regiões cerebrais. O uso do hipocampo intacto in vitro deve, portanto, não só fornecer mais informações sobre propriedades celulares e de rede do hipocampo, mas também esclarecer sobre como elas interagem para moldar processamento, integração e geração de informações dentro do cérebro.
As oscilações da rede rítmica que envolvem a sinalização eletroquímica coordenada de grandes conjuntos neuronais atuam como um mecanismo central para codificar, armazenar e transferir informações dentro e entre áreas cerebrais. As oscilações do hipocampo são consideradas cruciais para o processamento de informações, codificações e memória espaciotemporais. Por outro lado, pensa-se que a disfunção do hipocampo está subjacente a distúrbiosH como doença de Alzheimer e esquizofrenia, que estão associados a padrões de oscilação alterados 29 . Como tal, o estudo das oscilações do hipocampo autogeradas utilizando preparações intactas do hipocampo tornou-se um meio renovado para elucidar as propriedades básicas da função e disfunção do sistema nervoso.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Os autores declaram que não há interesses comerciais ou financeiros concorrentes.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pelos Institutos canadenses de Pesquisa em Saúde e Ciências Naturais.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Sodium Chloride | Sigma Aldrich | S9625 | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S9378 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma Aldrich | S5761 | |
| NaH2PO4 - sodium phosphate monobasic | Sigma Aldrich | S8282 | |
| Magnesium sulfate | Sigma Aldrich | M7506 | |
| Potassium Chloride | Sigma Aldrich | P3911 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma Aldrich | G7528 | |
| Calcium chloride dihydrate | Sigma Aldrich | C5080 | |
| Sodium Ascorbate | Sigma Aldrich | A7631-25G | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Standard Dissecting Scissors | Fisher Scientific | 08-951-25 | brain extraction |
| Scalpel Handle #4, 14 cm | WPI | 500237 | brain extraction |
| Filter forceps, flat jaws, straight (11 cm) | WPI | 500456 | brain extraction |
| Paragon Stainless Steel Scalpel Blades #20 | Ultident | 02-90010-20 | brain extraction |
| Fine Point Curved Dissecting Scissors | Thermo Fisher Scientific | 711999 | brain extraction |
| Teflon (PTFE) -coated thin spatula | VWR | 82027-534 | hippocampal preparation |
| Hayman Style Microspatula | Fisher Scientific | 21-401-25A | hippocampal preparation |
| Lab spoon | Fisher Scientific | 14-375-20 | hippocampal preparation |
| Borosilicate Glass Pasteur Pipets | Fisher Scientific | 13-678-20A | hippocampal preparation |
| Droper | Fisher Scientific | hippocampal preparation | |
| Razor blades Single edged | VWR | 55411-055 | hippocampal preparation |
| Lens paper (4 x 6") | VWR | 52846-001 | hippocampal preparation |
| Glass petri dishes (100 x 20 mm) | VWR | 25354-080 | hippocampal preparation |
| Plastic tray for ice; size 30 x 20 x 5 cm | n.a. | n.a. | hippocampal preparation |
| Single Inline Solution Heater | Warner Instruments | SH-27B | perfusion system |
| Aquarium air stones for bubbling | n.a. | n.a. | perfusion system |
| Tygon E-3603 tubing (ID 1/16 OD 1/8) | Fisherbrand | 14-171-129 | perfusion system |
| Electric Skillet | Black & Decker | n.a. | perfusion system |
| 95% O2/5% CO2 gas mixture (carbogen) | Vitalaire | SG466204A | perfusion system |
| Glass bottles/flasks (4 x 1 L) | n.a. | n.a. | perfusion system |
| Submerged recording Chamber | custom design (FM) | n.a. | Commercial alternative may be used |
| Glass pipettes (1.5/0.84 OD/ID (mm) ) | WPI | 1B150F-4 | electrophysiology |
| Hum Bug 50/60 Hz Noise Eliminator | Quest Scientific | Q-Humbug | electrophysiology |
| Multiclamp 700B patch-clamp amplifier | Molecular devices | MULTICLAMP | electrophysiology |
| Multiclamp 700B Commander Program | Molecular devices | MULTICLAMP | electrophysiology |
| Digital/Analogue converter | Molecular devices | DDI440 | electrophysiology |
| PCLAMP10 | Molecular devices | PCLAMP10 | electrophysiology |
| Vibration isolation table | Newport | n.a. | electrophysiology |
| Micromanipulators (manually operated ) | Siskiyou | MX130 | electrophysiology (LFP) |
| Micromanipulators (automated) | Siskiyou | MC1000e | electrophysiology (patch) |
| Audio monitor | A-M Systems | Model 3300 | electrophysiology |
| Micropipette/Patch pipette puller | Sutter | P-97 | electrophysiology |
| Custom-built upright fluorescence microscope | Siskiyou | n.a. | Imaging |
| Analogue video camera | COHU | 4912-2000/0000 | Imaging |
| Digital frame grabber with imaging software | EPIX, Inc | PIXCI-SV7 | Imaging |
| Olympus 2.5X objective | Olympus | MPLFLN | Imaging |
| Olympus 40X water immersion objective | Olympus | UIS2 LUMPLFLN | Imaging |
| Custom-made Light-Emitting Diode (LED) system | custom | n.a. | optogenetic stimulation (Amhilon et al., 2015) |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Animals | |||
| PV::Cre (KI) mice | Jackson Laboratory | stock number 008069 | Allow Cre-directed gene expression in PV interneurons |
| Constitutive-conditional Ai9 mice (R26-lox-stop-lox-tdTomato (KI)) | Jackson Laboratory | stock number 007905 | Express TdTomato following Cre-mediated recombination |
| Ai32 mice (R26-lox-stop-lox-ChR2(H134R)-EYFP | Jackson Laboratory | stock number 012569 |
Express the improved channelrhodopsin-2/EYFP fusion protein following exposure to Cre recombinase |
| PVChY mice | In house breeding | n.a. | Offspring obtained from cross-breeding the PV-Cre line with Ai32 mice (R26-lox-stop-lox-ChR2(H134R)-EYFP |
References
- Buzsaki, G. Theta rhythm of navigation: link between path integration and landmark navigation, episodic and semantic memory. Hippocampus. 15 (7), 827-840 (2005).
- Sanders, H., Renno-Costa, C., Idiart, M., Lisman, J. Grid Cells and Place Cells: An Integrated View of their Navigational and Memory Function. Trends Neurosci. 38 (12), 763-775 (2015).
- O'Keefe, J., Recce, M. L. Phase relationship between hippocampal place units and the EEG theta rhythm. Hippocampus. 3 (3), 317-330 (1993).
- Winson, J. Loss of hippocampal theta rhythm results in spatial memory deficit in the rat. Science. 201 (4351), 160-163 (1978).
- M'Harzi, M., Jarrard, L. E. Strategy selection in a task with spatial and nonspatial components: effects of fimbria-fornix lesions in rats. Behav Neural Biol. 58 (3), 171-179 (1992).
- Osipova, D., et al. Theta and gamma oscillations predict encoding and retrieval of declarative memory. J Neurosci. 26 (28), 7523-7531 (2006).
- Stumpf, C., Petsche, H., Gogolak, G. The significance of the rabbit's septum as a relay station between the midbrain and the hippocampus. II. The differential influence of drugs upon both the septal cell firing pattern and the hippocampus theta activity. Electroencephalogr Clin Neurophysiol. 14, 212-219 (1962).
- Mitchell, S. J., Ranck, J. B. Generation of theta rhythm in medial entorhinal cortex of freely moving rats. Brain Res. 189 (1), 49-66 (1980).
- Alonso, A., Garcia-Austt, E. Neuronal sources of theta rhythm in the entorhinal cortex of the rat. I. Laminar distribution of theta field potentials. Exp Brain Res. 67 (3), 493-501 (1987).
- Vertes, R. P., Kocsis, B. Brainstem-diencephalo-septohippocampal systems controlling the theta rhythm of the hippocampus. Neuroscience. 81 (4), 893-926 (1997).
- Bland, B. H., Colom, L. V., Konopacki, J., Roth, S. H. Intracellular records of carbachol-induced theta rhythm in hippocampal slices. Brain Res. 447 (2), 364-368 (1988).
- Cobb, S. R., Buhl, E. H., Halasy, K., Paulsen, O., Somogyi, P. Synchronization of neuronal activity in hippocampus by individual GABAergic interneurons. Nature. 378 (6552), 75-78 (1995).
- Williams, J. H., Kauer, J. A. Properties of carbachol-induced oscillatory activity in rat hippocampus. J Neurophysiol. 78 (5), 2631-2640 (1997).
- Chapman, C. A., Lacaille, J. C. Cholinergic induction of theta-frequency oscillations in hippocampal inhibitory interneurons and pacing of pyramidal cell firing. J Neurosci. 19 (19), 8637-8645 (1999).
- Strata, F. Intrinsic oscillations in CA3 hippocampal pyramids: physiological relevance to theta rhythm generation. Hippocampus. 8 (6), 666-679 (1998).
- Kocsis, B., Bragin, A., Buzsaki, G. Interdependence of multiple theta generators in the hippocampus: a partial coherence analysis. J Neurosci. 19 (14), 6200-6212 (1999).
- Fellous, J. M., Sejnowski, T. J. Cholinergic induction of oscillations in the hippocampal slice in the slow (0.5-2 Hz), theta (5-12 Hz), and gamma (35-70 Hz) bands. Hippocampus. 10 (2), 187-197 (2000).
- Gillies, M. J., et al. A model of atropine-resistant theta oscillations in rat hippocampal area CA1. J Physiol. 543 (Pt 3), 779-793 (2002).
- Gloveli, T., et al. Orthogonal arrangement of rhythm-generating microcircuits in the hippocampus. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (37), 13295-13300 (2005).
- Konopacki, J., Eckersdorf, B., Kowalczyk, T., Golebiewski, H. Firing cell repertoire during carbachol-induced theta rhythm in rat hippocampal formation slices. Eur J Neurosci. 23 (7), 1811-1818 (2006).
- Hajos, N., et al. Maintaining network activity in submerged hippocampal slices: importance of oxygen supply. Eur J Neurosci. 29 (2), 319-327 (2009).
- Manseau, F., Goutagny, R., Danik, M., Williams, S. The hippocamposeptal pathway generates rhythmic firing of GABAergic neurons in the medial septum and diagonal bands: an investigation using a complete septohippocampal preparation in vitro. J Neurosci. 28 (15), 4096-4107 (2008).
- Goutagny, R., Jackson, J., Williams, S. Self-generated theta oscillations in the hippocampus. Nat Neurosci. 12 (12), 1491-1493 (2009).
- Jackson, J., Goutagny, R., Williams, S. Fast and slow gamma rhythms are intrinsically and independently generated in the subiculum. J Neurosci. 31 (34), 12104-12117 (2011).
- Amilhon, B., et al. Parvalbumin Interneurons of Hippocampus Tune Population Activity at Theta Frequency. Neuron. 86 (5), 1277-1289 (2015).
- Huh, C. Y., et al. Excitatory Inputs Determine Phase-Locking Strength and Spike-Timing of CA1 Stratum Oriens/Alveus Parvalbumin and Somatostatin Interneurons during Intrinsically Generated Hippocampal Theta Rhythm. J Neurosci. 36 (25), 6605-6622 (2016).
- Gu, N., et al. NMDA-dependent phase synchronization between septal and temporal CA3 hippocampal networks. J Neurosci. 33 (19), 8276-8287 (2013).
- Jackson, J., et al. Reversal of theta rhythm flow through intact hippocampal circuits. Nat Neurosci. 17 (10), 1362-1370 (2014).
- Gonzalez-Burgos, G., Lewis, D. A. GABA neurons and the mechanisms of network oscillations: implications for understanding cortical dysfunction in schizophrenia. Schizophr Bull. 34 (5), 944-961 (2008).
