Summary
Här presenterar vi ett protokoll för inspelning av rytmisk neuronalt nätverk theta och gamma-oscillationer från en isolerad hel hippocampalpreparat. Vi beskriver de experimentella stegen från utvinning av hippocampus till detaljer om fält, enhetliga och helcellsplåsterskärmsinspelningar samt optogenetisk stimulering av theta-rytmen.
Abstract
Detta protokoll beskriver förfarandena för beredning och inspelning från den isolerade hela hippocampusen, av WT och transgena möss, tillsammans med senaste förbättringar av metoder och tillämpningar för studiet av theta-oscillationer. En enkel karakterisering av den isolerade hippocampala beredningen presenteras, varigenom sambandet mellan interna hippocampala teta-oscillatorer undersöks tillsammans med pyramidala cellers aktivitet och GABAerga interneuroner, av majs ammoni-1 (CA1) och subikulum (SUB) områden. Sammantaget visar vi att den isolerade hippocampus kan generera inre teta-oscillationer in vitro och att rytmicitet som genereras inom hippocampus kan manipuleras exakt genom optogenetisk stimulering av parvalbumin-positiva (PV) -interuroner. Den in vitro- isolerade hippocampala beredningen erbjuder ett unikt tillfälle att använda samtidiga fält- och intracellulära patch-clampinspelningar från visuellt identifierade neuRons för att bättre förstå mekanismerna som ligger bakom teta rytmgenerationen.
Introduction
Hippokampala tetaoscillationer (4-12 Hz) är bland de mest dominerande formerna av rytmisk aktivitet i däggdjurshjärnan och tros spela nyckelroller i kognitiva funktioner som behandling av spatiotemporala uppgifter och bildande av episodiska minnen 1 , 2 , 3 . Medan flera in vivo- studier som markerar förhållandet mellan theta-modulerade platsceller med rumsnavigations- och lesionsstudier samt kliniska bevis stöder uppfattningen att hippocampala thetaoscillationer är involverade i minnesbildning 4 , 5 , 6 , de mekanismer som är associerade Med generering av hippocampala thetaoscillationer är fortfarande inte fullständigt förstådda. Tidiga in vivo- undersökningar föreslog att thetaaktivitet huvudsakligen berodde på extrinsiska oscillatorer, i synnerhet rytmisk ingångFrån afferenta hjärnstrukturer såsom septum och entorhinal cortex 7 , 8 , 9 , 10 . En roll för inneboende faktorer - intern anslutning av hippocampala neurala nätverk tillsammans med egenskaperna hos hippocampala neuroner - postulerades också baserat på in vitro- observationer 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 . Men förutom några få landmärkestudier 19 , 20 , 21 , svårigheter att utveckla tillvägagångssätt som skulle kunna replikera fysiologiskt realistiska befolkningsaktiviteter i enkel in vitro- skivberedningS har länge försenat mer detaljerad försöksundersökning av hippocampus och relaterade områdets inbyggda förmåga att själv generera thetaoscillationer.
En viktig nackdel med standard in vitro -tunnskärnings experimentell inställning är att den 3D-cellulära och synaptiska organisationen av hjärnstrukturer vanligtvis kompromissas. Detta innebär att många former av samordnade nätverksaktiviteter baserade på rumsligt fördelade cellaggregat, som sträcker sig från lokaliserade grupper (≤1 mm radie) till populationer av neuroner spridda över ett eller flera hjärnområden (> 1 mm), kan inte stödjas. Med tanke på dessa överväganden behövdes en annan typ av tillvägagångssätt för att studera hur tetaoscillationer uppträder i hippocampusen och sprida sig till relaterade kortikala och subkortiska utgångsstrukturer.
Under de senaste åren har den initiala utvecklingen av "komplett septo-hippocampal" -beredningen för att undersöka tvåriktad interaCtioner av de två strukturerna 22 och den efterföljande utvecklingen av "isolerade hippocampus" -beredningen har visat att intrinsiska tetaoscillationer uppträder spontant i hippocampus som saknar extern rytmisk ingång 23 . Värdet av dessa tillvägagångssätt ligger på den inledande insikten att hela funktionella strukturen i dessa regioner behövdes för att fungera som en teta-rytmgenerator in vitro 22 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla procedurer har utförts enligt protokoll och riktlinjer godkända av McGill University Animal Care Committee och Canadian Council on Animal Care.
1. Akut Hippocampus In Vitro Preparation
OBS: Isolering av den intakta hippocampala preparatet innefattar tre huvudsteg: (1) Förberedelse av lösningar och utrustning, (2) Dippektion av hippocampus och (3) Uppställning av det snabba perfusionshastighetssystemet som är nödvändigt för generering av inneboende thetaoscillationer. I det här protokollet är förfarandet i rätt tid - från dissektion till inspelning - särskilt viktigt, eftersom den isolerade hippocampus utgör en så tät, men känslig förberedelse att bibehållande av funktionell anslutning av strukturen in vitro kräver stor omsorg. Att förbereda allt på förhand säkerställer att en tillräcklig nivå av perfusion är tillgänglig så tidigt som möjligt för att minimera cell dAmage och upprätthålla fysiologisk funktion.
- Sackarosbaserad artificiell cerebral spinalvätska (aCSF) lösning
- Förbered 1X lager sackaros lösning som ska användas för dissektion och efter-dissektion inkubation. Kombinera alla komponenter som anges i tabell 1 , förutom CaCl 2 , i 1 liter avjoniserat vatten och förvara vid 4 ° C i upp till 2 veckor.
- Standard aCSF-lösning
- Förbered standard aCSF för högflödesperfusion av den isolerade hippocampusen under elektrofysiologiska inspelningar. För att göra den koncentrerade (5X) stammen aCSF, lösa upp alla komponenter som anges i tabell 2 , förutom CaCl 2 , i 2 liter avjoniserat vatten och förvara vid 4 ° C.
- Förbered utrustningen
- Innan du börjar dissekera, sätt upp bänken med ett isfyllt plastfack (30 x 20 x 5 cm), karbogenkopplade rörledningar och thrEe glas petriskålar (10 x 2 cm) (se figur 1 ).
- Lägga 300 ml sackaroslösning (1X stock) till en 500 ml bägare, bubbla den med karbogen (95% O 2, 5% CO 2) och till Ca2 + [1,2 mM].
- Överför 60 ml av denna sackaroslösning till en petriskål med glas och lämna vid rumstemperatur. Placera resten i en 4 ° C frys i 10-15 min.
- Bubbla den iskalla sackaroslösningen med karbogen genom dissektionen.
- Fyll en andra petriskål (kallkammare) med sackaroslösning (4 ° C) och håll på is.
- Tillsätt 30 ml iskall sackaroslösning till en 50 ml bägare.
2. Hela Hippocampus Dissection
OBS: Metoden för dissektering av den isolerade hippocampus är väsentligen identisk med den som utvecklats och beskrivits ursprungligen 22 , men med ytterligare detaljer och förändringar beträffande peRfusionshastighet och inspelningsteknik.
- Hjärndissektion
- Bedöv musen (P20 - 35) under en avluftningshuvud med en liten pappershandduk blötläggt med 1 ml isofluran (100%) som läggs i buret.
- Dekapitera den bedövade musen och nedsänk snabbt huvudet i iskall sackaroslösning (50 ml bägare, ~ 5 s). Överför på en pappershandduk.
- Använd en skalpell för att göra en medial hud snitt (caudal till rostral) och tryck huden på sidorna för att exponera kraniet.
- Klipp öppna skallen med en liten sax och använd en spatel för att snabbt dra ihop hjärnan och släpp den i petriskålen med iskall sackaroslösning. Tillåt 1-2 minuter för hjärnan att svalna.
- Medan hjärnan återhämtar, tillsätt 2 - 3 ml sackaroslösning på en linspappers täckt Petri (dissektion) maträtt på is.
- Isolering av hippocampus
- Placera hjärnan på dissektionsskålen i en upprätt positionn.
- Ta bort cerebellum och främre cortex med ett rakblad. Klipp hjärnan i halva längs midsagittalplanet och returnera de två isolerade halvkärmen till hållkammaren. Tillåt ytterligare 1 - 2 min för återhämtning.
- Placera en enkel hemisected hjärna upprätt på dissektionsskålen.
- Rotera skålen tills midsagittala strukturer står inför observatören och den inbäddade konturen av septal-komplexet är synligt som ett tunt päronformat skikt av vävnad framför talamusen.
- Håll den hemisekterade hjärnan stadigt med mikrospateln och placera den lilla änden av polytetrafluoretylen (PTFE) -belagd spatel omedelbart bakom (caudal till) septalområdet.
- Sätt in den belagda spateln under septum och flytta spetsen ner tills dissektskålen nås. Avlägsna fibrerna som förbinder septalområdet caudalt. Upprepa samma operation längs den främre kanten av septum och skär de fibrer som ansluter till den främre delen av hjärnan.
- Med spateln lätt håller den inre delen av cortex strax ovanför hippocampus i upprätt läge, använd mikrospateln för att försiktigt dra ner de thalamiska, hypotalamiska och återstående hjärnstammens kärnor. Använd spateln att skära av och ta bort den borttagna vävnaden.
- Vrid den isolerade halvklotet på sin sida och identifiera hippocampusens kontur.
- Sätt in den belagda spateln i lateral ventrikel, under den rostrade änden av dorsal hippocampus.
- Håll spateln i linje med mittskiktet på den hemisekterade hjärnan och skjut den genom den släta konturen av ventrikulära väggar tills spetsen uppstår caudalt.
- Håll spateln under hippocampus och tryck den lätt på de anslutande fibrerna, längs det inre skiktet där hippocampus förenas med den överliggande cortexen. Applicera mikrospateln på utsidan av detta lager och skjut mot den belagda spateln för att skära genom anslutningsfibernlemmar.
- För att slutföra extraktionen, rotera dissektionsskålen och sätt in den belagda spateln under den ventrala hippocampusen. Lätt hålla insidan av den kortikala vikten med spateln och skär genom de entorhina anslutningarna med en snittrörelse mot mikrospateln.
OBS: Hela septohippocampalkomplexet kan avlägsnas genom att placera den belagda spateln under hela hippocampus och dra ut den återstående hjärnvävnaden från under. - När isoleringen är klar håller du hippocampuset på vilan och lägger till en droppe iskall sackaroslösning för att hålla den sval. Ta försiktigt av eventuella kvarvarande cortex och fibrer och separera hippocampus från septum genom att försiktigt applicera ett rakblad genom fornixen.
OBS! Om patch-kläminspelningar ska utföras från pyramidala celler (se avsnitt 4.6 Optogenetisk kontroll) kan den isolerade hippocampus skärs tvärs i 45 ° vinkel för att exponera det pyramidala skiktet av CA1 ("anglE-cut "-förberedelse), utan att kompromissa med det lokala nätverkskretsarna i den återstående delen av hippocampus. - Överför beredningen till rumstemperatursackaroslösning och låt den återhämta sig i 15 - 30 minuter före överföring till inspelningskammaren.
3. Ställ in snabb perfusion för inspelning av den isolerade Hippocampus
- Ställ in det gravitetsmatade perfusionssystemet för att möjliggöra kontinuerlig höghastighetsinflöde av oxygenerad aCSF vid 20-25 ml / min.
- Förbered aCSF (1X) flaskor i förväg och fördjupa dem i ett uppvärmningsbad (~ 30 ° C) minst 15 minuter före experimentets början. Slå på in-line-värmesystemet (30 ° C).
- Använda akvarium bubblers och slangledningar anslutna till en karbogen tank för att syre aCSF under hela experimentet, och tillsätt CaCl 2 [2 mM] före starten av perfusionen.
- Stoppa aCSF-flödet och överför hippocampus till inspelningskammaren med den bredaSlutet av en glaspipett. Låt sackarosmättad beredning sjunka och sedimentera i botten.
- Placera preparatet i mitten av inspelningskammaren (i linje med inloppsaxeln) med den släta ytan på CA1 och SUB på toppen. Stabilisera hippocampus med små vikter vid septal och temporala extremiteter och starta om aCSF-flödet.
4. Elektrofysiologi i den isolerade hippocampusen
- Extracellulär registrering av in vitro hippocampala theta-oscillationer
- För extracellulär övervakning av lokalfältpotential (LFP) eller engångsaktivitet från in vitro- isolerad hippocampus, använd glasmikropipetter (1 - 3 MΩ) fyllda med aCSF. Spela in akustiska AC-kopplade fältpotentialsignaler med en patch-förstärkare av förstärkning x1000, online bandpassfiltrering 0,1-500 Hz och en samplingsfrekvens på 5-20 kHz.
OBS! Det specialbyggda mikroskopet som används i detta protokollÄr utrustad med låga (2,5x) och högförstoringsmål (40X) för lågförstoringsvisning av hippocampus, såväl som infraröd videomikroskopi och epifluorescens för singelcelligenkänning. Komponenterna i detta system inkluderar det upprättiga fluorescensmikroskopet, fluorescensfilterbubblorna, en analog videokamera och digital ramgrabber med bildhanteringsprogram, en anpassad perfusionskammare på scenen ( Figur 2A , inset i) och hög precision mikromanipulatorer för neuronal inspelningar och Optisk fiberplacering. - Använd kameran monterad på mikroskopet och ansluten till en datorskärm för att inspektera hippocampalpreparatet under låg förstoring (2.5X) och kontrollera snabbt att det inte finns några underskärningar eller skador på den yttre ytan. Det diagonalt orienterade arrangemanget av alveusfibrer längs den släta ytan av CA1 bör vara synlig ( Figur 2A , insats ii) när det lyser överfört ljus genom hippocampus.
- Använd objektivet med låg förstoring för att visa den isolerade hippocampus och placeringen av LFP-elektroder på specifika inspelningsplatser.
OBS! En layout av det isolerade hippocampala preparatet med flera elektroder placerade i olika inspelningsställen illustreras i figur 2A . - Lossa en LFP-elektrod i badet tills den berör ytan (alveus) i CA1-området.
OBS! Detta ger vanligtvis en snabb övergång i den AC-kopplade inspelningen som liknar vad som händer när elektroden kommer i kontakt med inspelningsmediet. En ljudmonitor kan vara användbar för att lyssna på LFP-kanalsignalen efter det här steget.
OBS! Oftast kommer tidiga tecken på aktivitet bara att visas efter 10-15 min, därför är det viktigt att inte snabbt gå in i preparatet. Om efter LLP-elektroden fortfarande inte plockar upp aktivitet, fortsätt lite längre ner genom stratum oriensernaOch pausa regelbundet för att se om någon form av aktivitet uppstår när man närmar sig huvudcelllagret. Om inget detekteras efter ytterligare 5 - 10 min, dra försiktigt in elektroden och placera den på andra håll längs samma område. - Förbättra LFP-elektroden genom pyramidskiktet. Observera att den extracellulära spikningsaktiviteten ökar initialt när enskild utmatning från enskilda neuroner (mest pyramidala och hämmande korgceller) detekteras. Sänk elektroden ytterligare och notera att spiking börjar blekna igen när spetsen går in i radiatumet. Observera att en tydligt synlig nätverksoscillering i Theta-frekvensområdet (4-12 Hz) blir uppenbar och når maximal amplitud (~ 100 - 300 μV) då inspelningsplatsen sänks genom radiatum.
- För extracellulär övervakning av lokalfältpotential (LFP) eller engångsaktivitet från in vitro- isolerad hippocampus, använd glasmikropipetter (1 - 3 MΩ) fyllda med aCSF. Spela in akustiska AC-kopplade fältpotentialsignaler med en patch-förstärkare av förstärkning x1000, online bandpassfiltrering 0,1-500 Hz och en samplingsfrekvens på 5-20 kHz.
- Thetaoscillationer över en enda region
- För att testa de spatana egenskaperna hos spontana theta-oscillationer över CA1-regionen, placera spetsen oFa referens LFP-elektrod på en medial CA1-plats (medialt placerad längs den longitudinella septotemporala axeln) och sänka den in i radiatumet som tidigare beskrivits.
- Placera en andra LFP-elektrod i en CA1-plats (200 - 800 μm septal eller temporal från den första LFP) och observera att CA1 theta-oscillationer kan synkronisera över relativt stora avstånd.
- Theta-svängningar över lager
- För att testa egenskaperna hos theta-oscillationer över hippocampala skikt, lämna en referens LFP-elektrod på ett CA1 radiatum-ställe. Börja från strax ovanför stratum orienterna, sänk en andra elektrod i pyramidala cellskiktet och genom radiatumet. Observera en gradvis inversion av LFP-signalen (relativ fasomvandling) över pyramidskiktet.
OBS! För representativa exempel på dessa typer av aktiviteter, se Figur 2B . Exempel på laminära / djupprofiler och strömkällans densitet (CSD) -analysIllustrerar platsen för fasomvandling i isolerad hippocampi har publicerats tidigare 23 , 24 , 25 .
- För att testa egenskaperna hos theta-oscillationer över hippocampala skikt, lämna en referens LFP-elektrod på ett CA1 radiatum-ställe. Börja från strax ovanför stratum orienterna, sänk en andra elektrod i pyramidala cellskiktet och genom radiatumet. Observera en gradvis inversion av LFP-signalen (relativ fasomvandling) över pyramidskiktet.
- Gamma-oscillationer och teta-gamma-koppling i den intakta hippocampusen
- Placera en fältelektrod vid CA1 / SUB-gränsen och sänk den tills den sitter vid gränssnittet mellan de pyramidala och molekylära skikten. På denna nivå kan en fältpotential som visar tydliga gamma-oscillationer med amplitudförändringar som faslås till den lokala theta-rytmen registreras 24 . Justera skalning för att observera långsam tidsskala för theta-gamma-kopplingen. Observera att gammastörningar förekommer i två separata frekvensband, vilket kan avslöjas genom bandpassfiltrering av den pågående LFP-signalen i det långsamma (25 - 50 Hz) och snabba gammaområdet (150-250 Hz) (se figur 2C för representativt filtrerat spår).
- Hela cellplastklemmeinspelning under in vitro hippocampala theta-oscillationer
ANMÄRKNING: I denna del av protokollet är målet att erhålla visuellt styrda inspelningar med helcellsplåsterklämma från identifierade inreuroner i isolerad hippocampi från transgena PV-TOM-möss som uttrycker det fluorescerande proteinet, tdTomato, under kontroll av PV-promotorn (för Mer detaljer se material och Ref 26 ).- Använd fluorescensvideo-mikroskopi med låg (2,5x) och hög effekt (40X) förstoring för att visualisera tdTomato-positiva internuroner som ligger nära ytan av en hippocampalpreparat från en PV-TOM-mus ( Figur 3 ). Observera att även om PV-TOM-neuroner framgångsrikt kan visualiseras och riktas mot plåster genom alveusen (upp till 100 μm), kan icke-fluorescerande pyramidceller också uppnås relativt enkelt när hippocampusen framställs med vinkelskuren teknik (se Avsnitt 2.2.14 not).
- Under låg förstoringsvy av hippocampus, placera en LFP-elektrod i CA1 / SUB för att övervaka theta-oscillationer under förberedelse för patch-clamp-experiment.
- Byt till 40X förstoring och fördjupa målet över målområdet. Sänk ner den tills de övre skikten blir synliga. Manipulera mikroskopets position för att säkerställa tillräcklig öppen åtkomst för patchpipettinriktning från motsatt sida.
- Vid fluorescensmikroskopi väljer du en fluorescerande PV-TOM-cell och närmar den med en patchpipett (2 - 3 MΩ) fylld med standard intracellulär lösning.
- Använd ett munstycke för att applicera lätt positivt tryck på pipetten och övervaka motståndet när elektroden sänks ner på cellen. När spetsen möter målcellen ökar pipettmotståndet och en klar dimple visas när positivt tryck trycker på membranet. Lossa trycket och kontrollera att strömpulsen flattar ut när en tätning börjar bilda. Omedelbart clAmp till en hyperpolariserad potential (-70 mV) och när en GΩ-tätning uppnås bryts cellmembranet med en liten mängd negativt tryck applicerat genom pipetthållaren.
- En gång i helcells-konfiguration, undersök de fysiologiska egenskaperna hos identifierad PV-cell under spontana hippocampala oscillationer ( Figur 3B ).
- Observera att intracellulär membranpotentialinspelning från PV-celler kännetecknas av snabba uppträdande beteenden och utbrott av åtgärdspotentialer synkroniserade med den pågående CA1 / SUB-teta-rytmen.
- Växla till spänningsklämma och håll cellen vid olika membranpotentialer för att karakterisera förhållandet mellan excitatoriska och hämmande synaptiska strömmar som genereras av den inneboende rytmiska aktiviteten. Ett exempel på patch clamp-inspelning från en pyramidal cell visas i Figur 3A för jämförelse.
- Optogenetisk kontroll i den isolerade hippocampusen OBS: För optogenetisk kontroll av hippocampal nätverksaktivitet används en celltyps specifik strategi som innefattar rytmisk aktivering av PV-innehållande GABAergic celler här eftersom dessa celler visades spela en viktig roll vid synkronisering av huvudcellsbefolkningar i den isolerade hippocampusen 25 . Selektivt uttryck av excitatorisk kanalrhodopsin-2 (ChR2) i PV-celler uppnås genom att korsa PV-Cre-muslinjen med möss som konstitutivt uttrycker ChR2 Cre-beroende (Ai32), varigenom PV-ChY-möss genereras. Alternativt kan virala vektorkonstruktioner ( t.ex. AAVdj-ChETA-eYFP) injiceras i hippocampus av PV-Cre eller PV-TOM-möss (P15-16) för att driva uttrycket av excitatorisk opsin i CA1 / SUB-interurons ( Figur 4A ).
OBS: Denna strategi har beskrivits tidigare 25 .- Placera en LFP-elektrod i CA1 / SUB-området och lappa en närliggande pyramidalcell i den isolerade hippocAmpus av en mus som uttrycker det blåljuskänsliga excitatoriska opsinet ChR2 i PV-interneuroner.
- Placera en optisk fiberljusguide (0,2-1 mm diameter) ovanför hippocampalpreparatet och centrera den på det inspelade området. Använd blått ljus (473 nm) från en LED-källa för optogenisk stimulering, bestående av ljuspulser (10-20 ms, utlösad av en transistortransistorlogisk signal) eller sinusvågspänningskommandon levererade vid theta-frekvenser (4-12 Hz).
OBS! Den anpassade LED-baserade ljusstimuleringsenheten har beskrivits någon annanstans 25 . - Byt till nuvarande klämma och karaktäriserar pyramidernas aktivitet under spontana tetaoscillationer.
- Start stimuleringsprotokollet och registrera ljusresponserna. Observera att fältoscillationer och synaptisk aktivitet i den inspelade neuron blir alltmer synkroniserade under optogenisk stimulering och att rytmisk stimulering av PV-celler resulterar i en robust styrning av båda frekvensernaEnce och kraft av theta-oscillationer ( Figur 4 ).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Detta avsnitt illustrerar exempel på resultat som kan erhållas genom att studera theta-oscillationer i det mus-isolerade hippocampala preparatet in vitro . Dissektionsförfarandet för extraktion av den isolerade hippocampusen illustreras i figur 1 . Med hjälp av denna beredning kan intrinsiska thetaoscillationer undersökas vid placering av flera fältelektroder, inspelning av övergripande aktivitet och synkroniserade synaptiska ingångar till neuronpopulationer i olika regioner och lager av den isolerade hippocampusen ( Figur 2 ). Representativa resultat från samtidiga helcellsplastklem och extracellulära inspelningar presenteras för att karakterisera bränn- och synaptiska egenskaper hos specifika celltyper under spontana hippokampala teta-oscillationer ( Figur 3 ), liksom vid optogenetisk manipulation av rytmisk aktivitet (G "> Figur 4).
Figur 1: Dissektionsprocedur för den isolerade intakta hippocampusberedningen.
( A ) Allmän bild av dissektionsinstallationen. Överst till höger: karbonatiserad iskall sackaroslösningskolv (1); Nedre vänster: Isfylld plastfack (2) som håller dissektskålen täckt med linspapper (3); Den kalla hållningskammaren innehållande sackaroslösning (4); Och en uppsättning kirurgiska verktyg (5). ( B ) Utsikt över musens hjärna före hemisektion på dissektionsskålen. C ) Återhämtning av hemisected hjärna i kallkammare och zoomad vy (insats) på vänstra hjärnhalven innan du sätter in den lilla änden av den belagda spateln under septum. ( D ) Belagd spatel placerad under den isolerade hippocampus längs CA1 / SUB-regionen med den återstående hjärnanVävnad dras ut från under. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Konfiguration av inställningen för inspelning in vitro- theta-oscillationer från den intakta hippocampala beredningen i den nedsänkta inspelningskammaren.
( A ) Den isolerade hippocampus visas med en layout av hippocampala regioner och multipelelektroder placerade i fyra olika inspelningsställen fördelade septotemporalt (indikeras av vita asterisker). I bilden av inspelningskammarplattformen som visas ovan (insats i) indikeras inloppet och utloppet för snabbperfusionsflödet med siffrorna (1, 2). I den förstorade bilden av hippocampus som visas nedan (insats ii) placeras en enda elektrod i mittenSepetotemporala CA1 och fibrer av alveusen är lätt synliga och löper diagonalt mot subikulatet. S: septal, T: temporal, f / fx: fimbria-fornix. ( B ) Schematisk representation av organisationen av CA1-skikt med representativa LFP-spår som spelas in samtidigt från stratum oriens (grå) och stratum radiatum (svart). Notera den inverterade fasen av signaler mellan de två skikten. Alv: stratum alveus, PR: stratum pyramidale, SR: stratum radiatum. SLM: Stratum Lacunosum Moleculare. ( C ) Exempel LFP-spår som visar spontan theta-oscillation inspelad från CA1 / SUB-området (20 ss segment) och 2 sek expanderade segment (nedan) från ofiltrerad signal; Bandpass passeras för theta-frekvenser (0,5-12 Hz); Långsam gamma (25 - 55 Hz); Och snabbt gamma (125-250 Hz). Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Specifik aktivitet hos celltyp av pyramidalcell och PV-interneuron under spontana theta-oscillationer i den intakta hippocampala beredningen från en PV-TOM-mus.
(A) Synaptic aktivitet registrerades från en pyramidal cell under theta svängningar. Spänningsspår (vänster panel) visar spontan men inte rytmisk avfyra i vila och hämmande postsynaptiska potentialer (iPSPs) som inte klart synkroniserades med den långsamt växande LFP-oscillationen. Spänningsklämma inspelningar (höger panel) visar att motsvarande hämmande postsynaptiska strömmar (iPSCs) har sin reverseringspotential kring -70 mV. ( B ) Synaptisk aktivitet inspelad från en snabbspikande fluorescerande PV interneuron under theta-oscillationer. I nuvarande klämma (vänster) brände denna cell spontant i vila och drivs starkt av rytmisk excitatorisk poStsynaptiska potentialer (ePSPs) som faslåses med den stabila LFP-oscillationen. I spännings-kläminspelningar (höger) var den excitatoriska postsynaptiska strömomkastningspotentialen ungefär 0 mV. Schematiska ritningar ovanpå visar experimentinställningen tillsammans med placering av patch- och fältelektroder i CA1 / SUB och high (40X) förstoringsbilderna av den inspelade pyramidcellen och fluorescerande PV interneuron. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Lokala fältpotential och samtidiga patch-inspelningar från enda CA1 / SUB-pyramidala och PV-neuroner under spontana och optogenetiskt drivna Theta-oscillationer i den isolerade hippocampusen.
( A B ) Karaktärisering av en pyramidal neuron som visar typiska Regular-Spiking (RS) egenskaper (topp) och hög förstoring (40X) bild av den inspelade cellen (botten). ( C ) Provkällans inspelning av samma cell vid depolariserad membranpotential (svart) tillsammans med LFP-signalen (grå) och synkroniserad rytmisk IPSP under spontan oscillation (vänster) och under teta-frekvens (6 Hz) ljusstimulering ( höger). Mönstret för ljusstimulering (blå skuggning) avbildas ovanpå spänningsspåren. ( D ) Spektrogram och strömspektra av LFP-vågform före, under och efter en 6 Hz-ljussimulering (baslinje, stim, post). ( E ) Ljusfält och fluorescensbilder med låg förstoring av isolatEd hippocampal preparation som visar eYFP fluorescens (i grönt) lokaliserad i CA1 / SUB-regionen. ( F ) Karaktärisering av nuvarande steg som visar Snabbspikning (FS) beteende hos en inspelad PV-TOM interneuron (40X fluorescensbild nedan). ( G ) Membranpotential inspelning som visar stora EPSP och rytmisk avfyring av den inspelade PV-cellen synkroniserad med LFP-signalen under spontan fältoscillering (vänster) och under ljusspänning (höger) vid 3 Hz. ( H ) Fältutlösat medelvärde (FTA) av PV-cellspikar över CA1 / SUB LFP-signalen. Urladdningen av PV-cellen över flera försök (centrerad på LFP-topparna) omvandlades till en FTA av spikar som registrerades under spontan oscillation (baslinje) och under ljushimulering (stim). Mellersta och nedre grafer visar rasterplottar av spikar och spik-sannolikhetshistogram (medel sannolikhet visas i rött). Översta graferna visar diagrammen av den genomsnittliga LFP-signalen som ökade i kraft under ligHt-stimulering parallellt med starkt synkroniserad avfyrning av PV-cellen faslåsad till toppen av LFP-oscillationen. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
| SUCROSE LÖSNING (1X) FÖR ISOLERAD HIPPOCAMPUS | |||
| (Stocklösning) | |||
| Förening | MW | Final Conc. (mM) | Belopp för 1 L (g) |
| sackaros | 342,3 | 252 | 86,26 g |
| NaHCOs 3 | 84,01 | 24 | 2,020 g |
| glukos | 180,2 | 10 | |
| KCI | 74,55 | 3 | 0,223 g |
| MgSO 4 | 120,4 | 2 | 0,241 g |
| NaH 2 PO 4 | 120 | 1,25 | 0,150 g |
| CaCl 2 .2H2O [1 M] lager | 147 | 1,2 | 120 | il / 0,1 L * |
| * Tillsätt 360 μL CaCl 2 [1 M] för 0,3 L syrehaltig sackaroslösning | |||
| PH = 7,4 när det är oxygenat, Osm 310 - 320 | |||
Bord 1.
| STANDARD ACSF LÖSNING (5X) FÖR PERFUSION | |||
| (Stocklösning) | |||
| Förening | MW | Final Conc. (mM) | Belopp för 2 L 5X |
| NaCl | 58,44 | 126 | 73,6 |
| NaHCOs 3 | 84,01 | 24 | 20,2 |
| glukos | 180,2 | 10 | 18 |
| KCI | 74,55 | ♦ 4.5 | 3,355 |
| MgSO 4 | 120,4 | 2 | 2,41 |
| NaH 2 PO 4 | 120 | 1,25 | 1,5 |
| askorbat | 176,1 | 0,4 | 0,705 |
| CaCl 2 .2H2O [1 M] lager | 147 | 2 | 2 ml / l * |
| * Lägg 2 ml CaCl 2 [1 M] för ett L aCSF (1x) syresatt lösning | |||
| PH = 7,4 när det är oxygenat, Osm 310 - 320 | |||
| ♦ En något förhöjd [K + ] o används för denna aCSF-lösning (jämfört med normal aCSF 2,5 mM KCl) för att öka excitabiliteten hos hippocampala nätverk och underlätta uppkomsten av theta-oscillationer. | |||
Tabell 2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Medan elektrofysiologiska inspelningar från akuta hippocampala skivor utgör en standard in vitro- teknik skiljer sig metoderna som presenteras här väsentligen från det klassiska tillvägagångssättet. Till skillnad från de tunna skivberedningarna där specifika cellskikt är synliga vid ytan och kan undersökas direkt, är de intakta hippocampala beredningarna mer besläktade med in vivo- konfigurationer där elektroder sänks ner till riktade hjärnregioner medan de passerar genom enskilda skikt. Hippocampus integritet bevaras tillsammans med funktionell anslutning och egenskaper hos lokala neuronpopulationer. Detta ger ett komplext och kraftfullt verktyg för att undersöka små och stora nätverksoscillationer i hippocampus. Till exempel producerar kombinationen av förkopplade kretsar och celltypsspecifika egenskaper i nätverket inbördes och spontant genererade rytmiska theta- och gamma-oscillationer som efterliknar viktiga särdrag hos hippokasMpal aktivitet in vivo . Med hjälp av de metoder som presenteras i detta protokoll kan hippocampus extraheras snabbt från gnagarehjärnan och förblir livskraftig i flera timmar i en snabbflödande aCSF-miljö. Grundläggande elektrofysiologiska tekniker appliceras enkelt för att undersöka hur synkron aktivitet och synaptisk funktion hos specifika neuronala typer påverkar hippocampal dynamik.
Vår procedur har gett den första möjligheten att systematiskt utforska dynamiken hos lokala fältpotentialoscillationer över hela septotemporala (dorso-ventral) axeln hos hippocampus in vitro (se Refs 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27 , 28 ). På nätet och fysiologiska nivåer bevarar den intakta förberedelsen: 1) FunktionssyraPtic-interaktioner mellan celler som krävs för att på ett tillförlitligt sätt stödja intrinsiska nätverksoscillationer med frekvensområdet och profilen för theta-vågor in vivo , 2) Den skarpa förändringen i relativ fas av theta-oscillation vid nivån av stratumpyramidalen, 3) Thetas spatialfördelning och koherens Oscillation i hippocampus och dess växelverkan med lokala gammafrekvensrytmer, 4) Amplitudfasförhållandet mellan theta / gammavågor och 5) Den specifika tidsmässiga kopplingen av huvudcell- och internuronbränning med fältpotentialtetaoscillationer.
Eftersom frånvaron av extern ingång till hippocampus kan uppträda som en begränsning till tekniken tillåter det också studier av hippocampus interna dynamik på ett sätt som inte kan utföras in vivo . Dessutom kan externa ingångar efterliknas av optogenetisk stimulering av specifika fiberterminaler och avferenta vägar. Inaktiva preparat ger nya möjligheter att studeraHur nätverkets verksamhet sprids och interagerar i storskaliga nätverk med hippocampus och andra sammanhängande strukturer. Som sådan är en huvudanvändning av den intakta preparattekniken undersökning av funktionell nätverksanslutning inom eller mellan hjärnregioner. Användning av in vitro intakt hippocampus bör därför inte bara ge ytterligare information om hippocampusens cellulära och nätverksegenskaper, utan också belysa hur dessa interagerar för att forma behandling, integration och generering av information inom hjärnan.
Rytmiska nätverksoscillationer som engagerar den samordnade elektrokemiska signalen av stora neuronella ensembler fungerar som en central mekanism för kodning, lagring och överföring av information inom och över hjärnområden. Hippokampala svängningar anses vara avgörande för behandling av spatiotemporala uppgifter, kodning och minne. Omvänt antas hippocampal dysfunktion att leda till sjukdomar som är framgångsrikaH som Alzheimers sjukdom och schizofreni, som är associerade med förändrade oscillationsmönster 29 . Som sådan har undersökningen av självgenererade hippocampala oscillationer som använder intakta hippocampala preparat blivit ett förnyat medel för att belysa grundläggande egenskaper hos nervsystemet och dysfunktion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar inga konkurrerande kommersiella eller ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av de kanadensiska instituten för hälsovetenskap och naturvetenskap.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Sodium Chloride | Sigma Aldrich | S9625 | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S9378 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma Aldrich | S5761 | |
| NaH2PO4 - sodium phosphate monobasic | Sigma Aldrich | S8282 | |
| Magnesium sulfate | Sigma Aldrich | M7506 | |
| Potassium Chloride | Sigma Aldrich | P3911 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma Aldrich | G7528 | |
| Calcium chloride dihydrate | Sigma Aldrich | C5080 | |
| Sodium Ascorbate | Sigma Aldrich | A7631-25G | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Standard Dissecting Scissors | Fisher Scientific | 08-951-25 | brain extraction |
| Scalpel Handle #4, 14 cm | WPI | 500237 | brain extraction |
| Filter forceps, flat jaws, straight (11 cm) | WPI | 500456 | brain extraction |
| Paragon Stainless Steel Scalpel Blades #20 | Ultident | 02-90010-20 | brain extraction |
| Fine Point Curved Dissecting Scissors | Thermo Fisher Scientific | 711999 | brain extraction |
| Teflon (PTFE) -coated thin spatula | VWR | 82027-534 | hippocampal preparation |
| Hayman Style Microspatula | Fisher Scientific | 21-401-25A | hippocampal preparation |
| Lab spoon | Fisher Scientific | 14-375-20 | hippocampal preparation |
| Borosilicate Glass Pasteur Pipets | Fisher Scientific | 13-678-20A | hippocampal preparation |
| Droper | Fisher Scientific | hippocampal preparation | |
| Razor blades Single edged | VWR | 55411-055 | hippocampal preparation |
| Lens paper (4 x 6") | VWR | 52846-001 | hippocampal preparation |
| Glass petri dishes (100 x 20 mm) | VWR | 25354-080 | hippocampal preparation |
| Plastic tray for ice; size 30 x 20 x 5 cm | n.a. | n.a. | hippocampal preparation |
| Single Inline Solution Heater | Warner Instruments | SH-27B | perfusion system |
| Aquarium air stones for bubbling | n.a. | n.a. | perfusion system |
| Tygon E-3603 tubing (ID 1/16 OD 1/8) | Fisherbrand | 14-171-129 | perfusion system |
| Electric Skillet | Black & Decker | n.a. | perfusion system |
| 95% O2/5% CO2 gas mixture (carbogen) | Vitalaire | SG466204A | perfusion system |
| Glass bottles/flasks (4 x 1 L) | n.a. | n.a. | perfusion system |
| Submerged recording Chamber | custom design (FM) | n.a. | Commercial alternative may be used |
| Glass pipettes (1.5/0.84 OD/ID (mm) ) | WPI | 1B150F-4 | electrophysiology |
| Hum Bug 50/60 Hz Noise Eliminator | Quest Scientific | Q-Humbug | electrophysiology |
| Multiclamp 700B patch-clamp amplifier | Molecular devices | MULTICLAMP | electrophysiology |
| Multiclamp 700B Commander Program | Molecular devices | MULTICLAMP | electrophysiology |
| Digital/Analogue converter | Molecular devices | DDI440 | electrophysiology |
| PCLAMP10 | Molecular devices | PCLAMP10 | electrophysiology |
| Vibration isolation table | Newport | n.a. | electrophysiology |
| Micromanipulators (manually operated ) | Siskiyou | MX130 | electrophysiology (LFP) |
| Micromanipulators (automated) | Siskiyou | MC1000e | electrophysiology (patch) |
| Audio monitor | A-M Systems | Model 3300 | electrophysiology |
| Micropipette/Patch pipette puller | Sutter | P-97 | electrophysiology |
| Custom-built upright fluorescence microscope | Siskiyou | n.a. | Imaging |
| Analogue video camera | COHU | 4912-2000/0000 | Imaging |
| Digital frame grabber with imaging software | EPIX, Inc | PIXCI-SV7 | Imaging |
| Olympus 2.5X objective | Olympus | MPLFLN | Imaging |
| Olympus 40X water immersion objective | Olympus | UIS2 LUMPLFLN | Imaging |
| Custom-made Light-Emitting Diode (LED) system | custom | n.a. | optogenetic stimulation (Amhilon et al., 2015) |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Animals | |||
| PV::Cre (KI) mice | Jackson Laboratory | stock number 008069 | Allow Cre-directed gene expression in PV interneurons |
| Constitutive-conditional Ai9 mice (R26-lox-stop-lox-tdTomato (KI)) | Jackson Laboratory | stock number 007905 | Express TdTomato following Cre-mediated recombination |
| Ai32 mice (R26-lox-stop-lox-ChR2(H134R)-EYFP | Jackson Laboratory | stock number 012569 |
Express the improved channelrhodopsin-2/EYFP fusion protein following exposure to Cre recombinase |
| PVChY mice | In house breeding | n.a. | Offspring obtained from cross-breeding the PV-Cre line with Ai32 mice (R26-lox-stop-lox-ChR2(H134R)-EYFP |
References
- Buzsaki, G. Theta rhythm of navigation: link between path integration and landmark navigation, episodic and semantic memory. Hippocampus. 15 (7), 827-840 (2005).
- Sanders, H., Renno-Costa, C., Idiart, M., Lisman, J. Grid Cells and Place Cells: An Integrated View of their Navigational and Memory Function. Trends Neurosci. 38 (12), 763-775 (2015).
- O'Keefe, J., Recce, M. L. Phase relationship between hippocampal place units and the EEG theta rhythm. Hippocampus. 3 (3), 317-330 (1993).
- Winson, J. Loss of hippocampal theta rhythm results in spatial memory deficit in the rat. Science. 201 (4351), 160-163 (1978).
- M'Harzi, M., Jarrard, L. E. Strategy selection in a task with spatial and nonspatial components: effects of fimbria-fornix lesions in rats. Behav Neural Biol. 58 (3), 171-179 (1992).
- Osipova, D., et al. Theta and gamma oscillations predict encoding and retrieval of declarative memory. J Neurosci. 26 (28), 7523-7531 (2006).
- Stumpf, C., Petsche, H., Gogolak, G. The significance of the rabbit's septum as a relay station between the midbrain and the hippocampus. II. The differential influence of drugs upon both the septal cell firing pattern and the hippocampus theta activity. Electroencephalogr Clin Neurophysiol. 14, 212-219 (1962).
- Mitchell, S. J., Ranck, J. B. Generation of theta rhythm in medial entorhinal cortex of freely moving rats. Brain Res. 189 (1), 49-66 (1980).
- Alonso, A., Garcia-Austt, E. Neuronal sources of theta rhythm in the entorhinal cortex of the rat. I. Laminar distribution of theta field potentials. Exp Brain Res. 67 (3), 493-501 (1987).
- Vertes, R. P., Kocsis, B. Brainstem-diencephalo-septohippocampal systems controlling the theta rhythm of the hippocampus. Neuroscience. 81 (4), 893-926 (1997).
- Bland, B. H., Colom, L. V., Konopacki, J., Roth, S. H. Intracellular records of carbachol-induced theta rhythm in hippocampal slices. Brain Res. 447 (2), 364-368 (1988).
- Cobb, S. R., Buhl, E. H., Halasy, K., Paulsen, O., Somogyi, P. Synchronization of neuronal activity in hippocampus by individual GABAergic interneurons. Nature. 378 (6552), 75-78 (1995).
- Williams, J. H., Kauer, J. A. Properties of carbachol-induced oscillatory activity in rat hippocampus. J Neurophysiol. 78 (5), 2631-2640 (1997).
- Chapman, C. A., Lacaille, J. C. Cholinergic induction of theta-frequency oscillations in hippocampal inhibitory interneurons and pacing of pyramidal cell firing. J Neurosci. 19 (19), 8637-8645 (1999).
- Strata, F. Intrinsic oscillations in CA3 hippocampal pyramids: physiological relevance to theta rhythm generation. Hippocampus. 8 (6), 666-679 (1998).
- Kocsis, B., Bragin, A., Buzsaki, G. Interdependence of multiple theta generators in the hippocampus: a partial coherence analysis. J Neurosci. 19 (14), 6200-6212 (1999).
- Fellous, J. M., Sejnowski, T. J. Cholinergic induction of oscillations in the hippocampal slice in the slow (0.5-2 Hz), theta (5-12 Hz), and gamma (35-70 Hz) bands. Hippocampus. 10 (2), 187-197 (2000).
- Gillies, M. J., et al. A model of atropine-resistant theta oscillations in rat hippocampal area CA1. J Physiol. 543 (Pt 3), 779-793 (2002).
- Gloveli, T., et al. Orthogonal arrangement of rhythm-generating microcircuits in the hippocampus. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (37), 13295-13300 (2005).
- Konopacki, J., Eckersdorf, B., Kowalczyk, T., Golebiewski, H. Firing cell repertoire during carbachol-induced theta rhythm in rat hippocampal formation slices. Eur J Neurosci. 23 (7), 1811-1818 (2006).
- Hajos, N., et al. Maintaining network activity in submerged hippocampal slices: importance of oxygen supply. Eur J Neurosci. 29 (2), 319-327 (2009).
- Manseau, F., Goutagny, R., Danik, M., Williams, S. The hippocamposeptal pathway generates rhythmic firing of GABAergic neurons in the medial septum and diagonal bands: an investigation using a complete septohippocampal preparation in vitro. J Neurosci. 28 (15), 4096-4107 (2008).
- Goutagny, R., Jackson, J., Williams, S. Self-generated theta oscillations in the hippocampus. Nat Neurosci. 12 (12), 1491-1493 (2009).
- Jackson, J., Goutagny, R., Williams, S. Fast and slow gamma rhythms are intrinsically and independently generated in the subiculum. J Neurosci. 31 (34), 12104-12117 (2011).
- Amilhon, B., et al. Parvalbumin Interneurons of Hippocampus Tune Population Activity at Theta Frequency. Neuron. 86 (5), 1277-1289 (2015).
- Huh, C. Y., et al. Excitatory Inputs Determine Phase-Locking Strength and Spike-Timing of CA1 Stratum Oriens/Alveus Parvalbumin and Somatostatin Interneurons during Intrinsically Generated Hippocampal Theta Rhythm. J Neurosci. 36 (25), 6605-6622 (2016).
- Gu, N., et al. NMDA-dependent phase synchronization between septal and temporal CA3 hippocampal networks. J Neurosci. 33 (19), 8276-8287 (2013).
- Jackson, J., et al. Reversal of theta rhythm flow through intact hippocampal circuits. Nat Neurosci. 17 (10), 1362-1370 (2014).
- Gonzalez-Burgos, G., Lewis, D. A. GABA neurons and the mechanisms of network oscillations: implications for understanding cortical dysfunction in schizophrenia. Schizophr Bull. 34 (5), 944-961 (2008).
