כאן, אנו מציגים פרוטוקול להקלטת קצבית רשת עצבית theta ו תנודות גמא מ הכנה בהיפוקמפוס שלם מבודד. אנו מתארים את השלבים ניסיוני מן החילוץ של ההיפוקמפוס לפרטים של שדה, יחידית תא שלם קליפת הקלטות מהדק, כמו גם צעדה optogenetic של קצב theta.
פרוטוקול זה מתאר את ההליכים להכנת והקלטה של ההיפוקמפוס כולו מבודד, של WT ו עכברים מהונדס, יחד עם שיפורים האחרונות במתודולוגיות ויישומים לחקר תנודות תטה. אפיון פשוט של ההכנה בהיפוקמפוס מבודדת מוצג לפיה היחסים בין מתנדים תטא בהיפוקמפוס פנימי נבדק יחד עם פעילות של תאים פירמידליים, ו intereurons GABAergic, של Cornu ammonis-1 (CA1) ותת תחומים (SUB) אזורים. בסך הכל, אנו מראים כי ההיפוקמפוס מבודד מסוגל לייצר תנודות תטה מהותי במבחנה וכי קצביות שנוצר בתוך ההיפוקמפוס ניתן מניפולציה מדויקת על ידי גירוי optogenetic של intervalons חיובי parvalbumin (PV). ההכנה במבחנה מבודדת בהיפוקמפוס מציעה הזדמנות ייחודית להשתמש בשדה סימולטני ובתקן תאיים קליפ תיקון של ניאו מזוהה חזותיתRons כדי להבין טוב יותר את המנגנונים מאחורי הדור קצב.
תנודות הטטה בהיפוקמפוס (4-12 Hz) הן בין הצורות השכיחות ביותר של פעילות קצבית במוח היונקי, והן מאמינות כי הן ממלאות תפקידים מרכזיים בתפקודים קוגניטיביים כגון עיבוד מידע spatiotemporal ויצירת זיכרונות אפיזודיים 1 , 2 , 3 . בעוד כמה מחקרים vivo המדגישים את הקשר של תאטה מקום תאים עם הניווט המרחבי ומחקרי הנגע, כמו גם ראיות קליניות, תומכים את הדעה כי תנודות טטה בהיפוקמפוס מעורבים היווצרות זיכרון 4 , 5 , 6 , המנגנונים הקשורים עם הדור של תנודות thta בהיפוקמפוס עדיין לא הבינו לחלוטין. מחקרים מוקדמים בתחום ה- vivo הראו שפעילות התטה תלויה בעיקר במתנדים חיצוניים, ובמיוחד בתשומות קצובותמן המבנים המוחיים כגון מחיצות וקורטקס אנטורהינל 7 , 8 , 9 , 10 . תפקיד של גורמים פנימיים – קישוריות פנימית של רשתות עצביות בהיפוקמפוס יחד עם המאפיינים של נוירונים בהיפוקמפוס – הונח גם על סמך תצפיות חוץ גופית 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 . עם זאת, מלבד כמה מחקרים ציון 19 , 20 , 21 , קשיים בפיתוח גישות שעלולות לשכפל פעילות פיזיולוגית ריאליסטית האוכלוסייה בהכנת פשוטה במבחנה חוץ גופיתS יש, במשך זמן רב, עיכוב בדיקה ניסיונית מפורטת יותר של היכולות המהותיות של ההיפוקמפוס ואת האזורים הקשורים עצמית לייצר תנודות תטה.
חיסרון חשוב של תקן במבחנה דק פרוסה הגדרה ניסיונית היא כי הארגון הסלולר 3D ו הסינפטי של מבנים מוחיים נפגעת בדרך כלל. משמעות הדבר היא כי צורות רבות של פעילויות רשת מתואמות המבוססות על מכלולים תאיים מבוזרים מרחביים, החל מקבוצות מקומיות (רדיוס 1 מ"מ) לאוכלוסיות של נוירונים הפרושות על פני אזור מוח אחד או יותר (> 1 מ"מ), לא ניתן לתמיכה. בהתחשב בשיקולים אלה, נדרש סוג אחר של גישות כדי ללמוד כיצד מופיעות תנודות התטה בהיפוקמפוס, והן מתפשטות למבנים של קליפת המוח וקורטקורט.
בשנים האחרונות, הפיתוח הראשוני של "להשלים septo-hippocampal" הכנה לבחון interaional דו כיווניתCtions של שני מבנים 22 , ואת ההתפתחות שלאחר מכן של ההכנה "ההיפוקמפוס מבודדים", גילו כי תנודות תטה מהותי להתרחש ספונטנית בהיפוקמפוס חסר קלט קצבי חיצוני 23 . הערך של גישות אלה טמון על התובנה הראשונית כי המבנה הפונקציונלי כולו של אזורים אלה היה צריך להישמר על מנת לתפקד כמו מחולל קצב תטה במבחנה 22 .
בעוד הקלטות אלקטרו מפרופילים בהיפוקמפוס חריף מהווים תקן במבחנה טכניקה, השיטות המוצגות כאן שונה באופן משמעותי מן הגישה הקלאסית. שלא כמו ההכנות פרוסת דק שבו שכבות תאים ספציפיים גלויים על פני השטח ניתן לבדוק ישירות, ההכנות בהיפוקמפוס שלם דומים יותר בתצורות vivo</em…
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו נתמכה על ידי המכון הקנדי לבריאות ומחקר מדעי הטבע.
Reagents | |||
Sodium Chloride | Sigma Aldrich | S9625 | |
Sucrose | Sigma Aldrich | S9378 | |
Sodium Bicarbonate | Sigma Aldrich | S5761 | |
NaH2PO4 – sodium phosphate monobasic | Sigma Aldrich | S8282 | |
Magnesium sulfate | Sigma Aldrich | M7506 | |
Potassium Chloride | Sigma Aldrich | P3911 | |
D-(+)-Glucose | Sigma Aldrich | G7528 | |
Calcium chloride dihydrate | Sigma Aldrich | C5080 | |
Sodium Ascorbate | Sigma Aldrich | A7631-25G | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment | |||
Standard Dissecting Scissors | Fisher Scientific | 08-951-25 | brain extraction |
Scalpel Handle #4, 14cm | WPI | 500237 | brain extraction |
Filter forceps, flat jaws, straight (11cm) | WPI | 500456 | brain extraction |
Paragon Stainless Steel Scalpel Blades #20 | Ultident | 02-90010-20 | brain extraction |
Fine Point Curved Dissecting Scissors | Thermo Fisher Scientific | 711999 | brain extraction |
Teflon (PTFE) -coated thin spatula | VWR | 82027-534 | hippocampal preparation |
Hayman Style Microspatula | Fisher Scientific | 21-401-25A | hippocampal preparation |
Lab spoon | Fisher Scientific | 14-375-20 | hippocampal preparation |
Borosilicate Glass Pasteur Pipets | Fisher Scientific | 13-678-20A | hippocampal preparation |
Droper | Fisher Scientific | hippocampal preparation | |
Razor blades Single edged | VWR | 55411-055 | hippocampal preparation |
Lens paper (4X6 inch) | VWR | 52846-001 | hippocampal preparation |
Glass petri dishes (100 x 20 mm) | VWR | 25354-080 | hippocampal preparation |
Plastic tray for ice; size 30 x 20 x 5 cm | n.a. | n.a. | hippocampal preparation |
Single Inline Solution Heater | Warner Instruments | SH-27B | perfusion system |
Aquarium air stones for bubbling | n.a. | n.a. | perfusion system |
Tygon E-3603 tubing (ID 1/16 OD 1/8) | Fisherbrand | 14-171-129 | perfusion system |
Electric Skillet | Black & Decker | n.a. | perfusion system |
95% O2/5% CO2 gas mixture (carbogen) | Vitalaire | SG466204A | perfusion system |
Glass bottles/flasks (4 x 1 L) | n.a. | n.a. | perfusion system |
Submerged recording Chamber | custom design (FM) | n.a. | Commercial alternative may be used |
Glass pipettes (1.5 / 0.84 OD/ID (mm) ) | WPI | 1B150F-4 | electrophysiology |
Hum Bug 50/60 Hz Noise Eliminator | Quest Scientific | Q-Humbug | electrophysiology |
Multiclamp 700B patch-clamp amplifier | Molecular devices | MULTICLAMP | electrophysiology |
Multiclamp 700B Commander Program | Molecular devices | MULTICLAMP | electrophysiology |
Digital/Analogue converter | Molecular devices | DDI440 | electrophysiology |
PCLAMP10 | Molecular devices | PCLAMP10 | electrophysiology |
Vibration isolation table | Newport | n.a. | electrophysiology |
Micromanipulators (manually operated ) | Siskiyou | MX130 | electrophysiology (LFP) |
Micromanipulators (automated) | Siskiyou | MC1000e | electrophysiology (patch) |
Audio monitor | A-M Systems | Model 3300 | electrophysiology |
Micropipette/Patch pipette puller | Sutter | P-97 | electrophysiology |
Custom-built upright fluorescence microscope | Siskiyou | n.a. | Imaging |
Analogue video camera | COHU | 4912-2000/0000 | Imaging |
Digital frame grabber with imaging software | EPIX, Inc | PIXCI-SV7 | Imaging |
Olympus 2.5x objective | Olympus | MPLFLN | Imaging |
Olympus 40x water immersion objective | Olympus | UIS2 LUMPLFLN | Imaging |
Custom-made light-emitting diode (LED) system | custom | n.a. | optogenetic stimulation (Amhilon et al., 2015) |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Animals | |||
PV::Cre (KI) mice | Jackson Laboratory | stock number 008069 | Allow Cre-directed gene expression in PV interneurons |
Constitutive-conditional Ai9 mice (R26-lox-stop-lox-tdTomato (KI)) | Jackson Laboratory | stock number 007905 | Express TdTomato following Cre-mediated recombination |
Ai32 mice (R26-lox-stop-lox-ChR2(H134R)-EYFP | Jackson Laboratory | stock number 012569 |
Express the improved channelrhodopsin-2/EYFP fusion protein following exposure to Cre recombinase |
PVChY mice | In house breeding | n.a. | Offspring obtained from cross-breeding the PV-Cre line with Ai32 mice (R26-lox-stop-lox-ChR2(H134R)-EYFP |