Her presenterer vi en protokoll for opptak av rytmisk nevronnettverk theta og gamma-svingninger fra et isolert helhippocampalpreparat. Vi beskriver de eksperimentelle trinnene fra utvinning av hippocampus til detaljer om felt-, enhetlig og helcelle patch clamp opptak samt optogenetic pacing av theta rytmen.
Denne protokollen skisserer prosedyrene for å forberede og registrere fra den isolerte hele hippocampus, av WT og transgene mus, sammen med nyere forbedringer i metoder og anvendelser for studiet av theta-oscillasjoner. En enkel karakterisering av det isolerte hippocampale preparatet presenteres, hvor forholdet mellom interne hippokampale teta-oscillatorer undersøkes sammen med aktiviteten til pyramidale celler og GABAergiske interneuroner, av cornu ammoni-s (CA1) og subikulum (SUB) områder. Samlet viser vi at den isolerte hippocampus er i stand til å generere indre teta-svingninger in vitro, og at rytmicitet generert i hippocampuset kan manipuleres nøyaktig ved optogenetisk stimulering av parvalbumin-positive (PV) interneuroner. In vitro- isolert hippokamppreparat gir en unik mulighet til å bruke samtidige felt- og intracellulære patch-klemmeopptak fra visuelt identifisert neuRons for bedre å forstå mekanismene som ligger til grund for theta rytmgenerering.
Hippokampale theta-oscillasjoner (4-12 Hz) er blant de mest fremtredende former for rytmisk aktivitet i pattedyrs hjernen, og antas å spille nøkkelrolle i kognitive funksjoner som behandling av spatiotemporale opplysninger og dannelse av episodiske minner 1 , 2 , 3 . Mens flere in vivo- studier som fremhever forholdet mellom theta-modulerte stedceller med romlig navigasjon og lesjonstudier, samt klinisk bevis, støtter synspunktet om at hippokampale theta-svingninger er involvert i minnesdannelse 4 , 5 , 6 , mekanismene forbundet med Med generering av hippocampale theta-svingninger er fortsatt ikke fullt ut forstått. Tidlige in vivo undersøkelser foreslo at thetaaktivitet hovedsakelig var avhengig av ekstrinsiske oscillatorer, særlig rytmisk inngangFra afferente hjernestrukturer som septum og entorhinal cortex 7 , 8 , 9 , 10 . En rolle for inneboende faktorer – intern tilkobling av hippokampale nevrale nettverk sammen med egenskapene til hippocampale nevroner – ble også postulert basert på in vitro observasjoner 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 . Men bortsett fra noen få landemerkeundersøkelser 19 , 20 , 21 , vanskeligheter med å utvikle tilnærminger som kunne replikere fysiologisk realistiske populasjonsaktiviteter i enkel in vitro- skiveforberedelseS har lenge forsinket mer detaljert eksperimentell undersøkelse av hippokampusens indre evner og relaterte områder til selv-genererende theta-svingninger.
En viktig ulempe ved standard in vitro tynn-skiveeksperimentell innstilling er at 3D-cellulær og synaptisk organisering av hjernestrukturer vanligvis blir kompromittert. Dette betyr at mange former for samordnet nettverksvirksomhet basert på romlig distribuerte cellesamlinger, fra lokaliserte grupper (≤1 mm radius) til populasjoner av nevroner spredt over en eller flere hjerner (> 1 mm), ikke kan støttes. På grunn av disse overvektene var det nødvendig med en annen type tilnærming for å studere hvordan theta-svingninger dukker opp i hippocampus og propagere til relaterte kortikale og subkortiske utgangsstrukturer.
I de siste årene har den første utviklingen av "komplett septo-hippocampal" -preparatet undersøkt toveisinteraCtions av de to strukturer 22 og den etterfølgende utviklingen av det "isolerte hippocampus" -preparatet har vist at intrinsiske theta-oscillasjoner forekommer spontant i hippocampus som mangler ekstern rytmisk inngang 23 . Verdien av disse tilnærmingene ligger på den innledende innsikt at hele funksjonelle strukturen i disse områdene måtte bevares for å fungere som en teta rytmegenerator in vitro 22 .
Mens elektrofysiologiske opptak fra akutte hippocampale skiver utgjør en standard in vitro- teknikk, varierer metodene som presenteres her vesentlig fra den klassiske tilnærmingen. I motsetning til de tynne skiverpreparatene hvor spesifikke cellelag er synlige på overflaten og kan undersøkes direkte, er de intakte hippocampale preparatene mer beslektet med in vivo konfigurasjoner der elektrodene senkes til målrettede hjerneområder mens de krysser gjennom individuelle lag. Hippocampus integritet e…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av de kanadiske instituttene for helseforskning og naturvitenskap.
Reagents | |||
Sodium Chloride | Sigma Aldrich | S9625 | |
Sucrose | Sigma Aldrich | S9378 | |
Sodium Bicarbonate | Sigma Aldrich | S5761 | |
NaH2PO4 – sodium phosphate monobasic | Sigma Aldrich | S8282 | |
Magnesium sulfate | Sigma Aldrich | M7506 | |
Potassium Chloride | Sigma Aldrich | P3911 | |
D-(+)-Glucose | Sigma Aldrich | G7528 | |
Calcium chloride dihydrate | Sigma Aldrich | C5080 | |
Sodium Ascorbate | Sigma Aldrich | A7631-25G | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment | |||
Standard Dissecting Scissors | Fisher Scientific | 08-951-25 | brain extraction |
Scalpel Handle #4, 14cm | WPI | 500237 | brain extraction |
Filter forceps, flat jaws, straight (11cm) | WPI | 500456 | brain extraction |
Paragon Stainless Steel Scalpel Blades #20 | Ultident | 02-90010-20 | brain extraction |
Fine Point Curved Dissecting Scissors | Thermo Fisher Scientific | 711999 | brain extraction |
Teflon (PTFE) -coated thin spatula | VWR | 82027-534 | hippocampal preparation |
Hayman Style Microspatula | Fisher Scientific | 21-401-25A | hippocampal preparation |
Lab spoon | Fisher Scientific | 14-375-20 | hippocampal preparation |
Borosilicate Glass Pasteur Pipets | Fisher Scientific | 13-678-20A | hippocampal preparation |
Droper | Fisher Scientific | hippocampal preparation | |
Razor blades Single edged | VWR | 55411-055 | hippocampal preparation |
Lens paper (4X6 inch) | VWR | 52846-001 | hippocampal preparation |
Glass petri dishes (100 x 20 mm) | VWR | 25354-080 | hippocampal preparation |
Plastic tray for ice; size 30 x 20 x 5 cm | n.a. | n.a. | hippocampal preparation |
Single Inline Solution Heater | Warner Instruments | SH-27B | perfusion system |
Aquarium air stones for bubbling | n.a. | n.a. | perfusion system |
Tygon E-3603 tubing (ID 1/16 OD 1/8) | Fisherbrand | 14-171-129 | perfusion system |
Electric Skillet | Black & Decker | n.a. | perfusion system |
95% O2/5% CO2 gas mixture (carbogen) | Vitalaire | SG466204A | perfusion system |
Glass bottles/flasks (4 x 1 L) | n.a. | n.a. | perfusion system |
Submerged recording Chamber | custom design (FM) | n.a. | Commercial alternative may be used |
Glass pipettes (1.5 / 0.84 OD/ID (mm) ) | WPI | 1B150F-4 | electrophysiology |
Hum Bug 50/60 Hz Noise Eliminator | Quest Scientific | Q-Humbug | electrophysiology |
Multiclamp 700B patch-clamp amplifier | Molecular devices | MULTICLAMP | electrophysiology |
Multiclamp 700B Commander Program | Molecular devices | MULTICLAMP | electrophysiology |
Digital/Analogue converter | Molecular devices | DDI440 | electrophysiology |
PCLAMP10 | Molecular devices | PCLAMP10 | electrophysiology |
Vibration isolation table | Newport | n.a. | electrophysiology |
Micromanipulators (manually operated ) | Siskiyou | MX130 | electrophysiology (LFP) |
Micromanipulators (automated) | Siskiyou | MC1000e | electrophysiology (patch) |
Audio monitor | A-M Systems | Model 3300 | electrophysiology |
Micropipette/Patch pipette puller | Sutter | P-97 | electrophysiology |
Custom-built upright fluorescence microscope | Siskiyou | n.a. | Imaging |
Analogue video camera | COHU | 4912-2000/0000 | Imaging |
Digital frame grabber with imaging software | EPIX, Inc | PIXCI-SV7 | Imaging |
Olympus 2.5x objective | Olympus | MPLFLN | Imaging |
Olympus 40x water immersion objective | Olympus | UIS2 LUMPLFLN | Imaging |
Custom-made light-emitting diode (LED) system | custom | n.a. | optogenetic stimulation (Amhilon et al., 2015) |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Animals | |||
PV::Cre (KI) mice | Jackson Laboratory | stock number 008069 | Allow Cre-directed gene expression in PV interneurons |
Constitutive-conditional Ai9 mice (R26-lox-stop-lox-tdTomato (KI)) | Jackson Laboratory | stock number 007905 | Express TdTomato following Cre-mediated recombination |
Ai32 mice (R26-lox-stop-lox-ChR2(H134R)-EYFP | Jackson Laboratory | stock number 012569 |
Express the improved channelrhodopsin-2/EYFP fusion protein following exposure to Cre recombinase |
PVChY mice | In house breeding | n.a. | Offspring obtained from cross-breeding the PV-Cre line with Ai32 mice (R26-lox-stop-lox-ChR2(H134R)-EYFP |