Summary

الحبل الشوكي العصبونات العزلة والثقافة من الفئران حديثي الولادة

Published: July 11, 2017
doi:

Summary

تقدم هذه الدراسة تقنية لعزل الخلايا العصبية من الفئران حديثي الولادة وت. فإنه يتطلب تشريح دقيق من الحبل الشوكي من الماوس حديثي الولادة، تليها فصل الخلايا العصبية من أنسجة الحبل الشوكي من خلال الانقسام الميكانيكية والانزيمية.

Abstract

نقدم بروتوكول لعزل وثقافة الخلايا العصبية الحبل الشوكي. يتم الحصول على الخلايا العصبية من حديثي الولادة C57BL / 6 الفئران ويتم عزلها في يوم ما بعد الولادة 1-3. يتم جمع القمامة الماوس، وعادة 4-10 الجراء ولدت من زوج تربية واحد، لتجربة واحدة، ويتم جمع الحبال الشوكي بشكل فردي من كل الماوس بعد القتل الرحيم مع إيسوفلوران. يتم تشريح العمود الفقري بها ومن ثم يتم تحرير الحبل الشوكي من العمود. ثم يتم مفرغة الحبل الشوكي لزيادة مساحة سطح التسليم للبروتياز الأنزيمية التي تسمح للخلايا العصبية والخلايا الأخرى أن يطلق سراحه من الأنسجة. ثم يتم استخدام تريتوراتيون لإطلاق الخلايا في حل. هذا الحل في وقت لاحق مجزأة في التدرج الكثافة لفصل الخلايا المختلفة في حل، مما يسمح للعصبية لتكون معزولة. يمكن عزل ما يقرب من 1-2.5 × 10 6 الخلايا العصبية من مجموعة القمامة واحدة. ثم يتم تصنيف الخلايا العصبية على الآبار المغلفة مع فاكتو لاصقةرس التي تسمح للنمو السليم والنضج. وتستغرق الخلايا العصبية حوالي 7 أيام للوصول إلى مرحلة النضج في النمو والثقافة المتوسطة ويمكن استخدامها بعد ذلك للعلاج والتحليل.

Introduction

فهم أمراض الحبل الشوكي يتطلب استخدام نماذج مختلفة، سواء على المستويات المجهرية والميكروسكوبية. وتستخدم النماذج الحيوانية الكبيرة والصغيرة 1 ، 2 ، 3 في التحقيقات في الجسم الحي من مرض الحبل الشوكي والإصابات. في حين دراسة هذه القضايا في الجسم الحي له مزاياه، وتحليل الحبل الشوكي يقتصر على كامل جنون الحبل الشوكي أو أقسام الأنسجة 4 . هذا يخلق بعض الغموض عند محاولة عزل ردود محددة والأهداف في الحبل الشوكي بين الخلايا العصبية المقيمين والدبقية المحيطة بها. زيادة توافر الفئران التلاعب وراثيا يسمح لإجراء تحقيقات أكثر تفصيلا في علم الأحياء على المستويات الخلوية والجزيئية. وهكذا، يتم استخدام نموذج الماوس حديثي الولادة هنا، مما يسمح لدراسة خصائص فريدة من نوعها وعلم الأحياء من الخلايا العصبية الحبل الشوكي في المختبر .

إن "عزل الخلايا العصبية في المختبر وصيانتها ليس واضحا بشكل خاص، وهناك وفرة نسبية من تقنيات عزل العصبونات من الأنسجة القشرية للقوارض البالغة التي يبدو أنها تؤدي إلى عدد كبير من الخلايا العصبية المعزولة ( أي الملايين) 5 ، 6 ، 7. في المقابل، فإن العائد من الخلايا العصبية من أنسجة الحبل الشوكي هو أقل 8 ، 9 ، 10 ، ويرجع ذلك جزئيا إلى كتلة أصغر من الأنسجة.وعلاوة على ذلك، في الفئران، وهناك قلة نسبي من التقنيات لعزل حديثي الولادة والخلايا العصبية الحبل الشوكي، والأساليب القائمة محدودة من قبل انخفاض الخلايا العصبية ( أي المئات) 9 أو التقنيات الشاقة والموارد الثقيلة التي تتطلب عزل الفئران الجنينية 10 .

في هذا البروتوكول، ونحناستخدام تقنية تسمح لعزل فعالة من حيث التكلفة والموارد من عدد كبير من الخلايا العصبية من الحبل الشوكي من الفئران حديثي الولادة. كما هو شائع في التقنيات المنشورة سابقا، ونحن نستخدم غشاء كما الأنزيمية الأنزيمية، مما يسمح للإفراج عن الخلايا العصبية من أنسجة الحبل الشوكي 5 ، 6 . وبالإضافة إلى ذلك، ونحن نستخدم التدرج الكثافة لفصل الخلية المكرر، والتي سبق أن ثبت أن تكون فعالة 6 ، 10 . في حين أن الوسيط الذي يتم فيه حضانة الخلايا يمكن أن تختلف، في تجربتنا وكما نشرت سابقا 11 ، مكملات مع الطازجة B27 تكملة متوسطة الثقافة وقد ثبت أن تكون حاسمة لطول العمر العصبية. الخلايا العصبية هي عادة قابلة للحياة لمدة تصل إلى 10 يوما، مما يسمح للعلاج أن تنفذ.

Protocol

وقد أجريت رعاية وعلاج الحيوانات في هذا الإجراء وفقا للمبادئ التوجيهية للجنة رعاية الحيوان واستخدام المؤسسي في جامعة كولورادو. 1. إعداد الحلول إعداد وتخزين جميع الحلول في درجات ال…

Representative Results

باستخدام هذه التقنية، والقمامة واحدة (4-10 الجراء) يسمح لعزل 1-2.5 10 6 الخلايا العصبية مناسبة للبذر على لوحات الثقافة. عادة، يتم تصنيف البذور 4-8 بئر في التركيز المذكور أعلاه ( أي 300،000 خلية / مل). ويبين الشكل 3 ظهور الخلايا العصبية …

Discussion

هذه التقنية تسمح للثقافة موثوق بها من الخلايا العصبية الحبل الشوكي. بمجرد تحقيق الكفاءة في هذه التقنية، يستغرق حوالي 3.5 ساعة لإكمال. كنا قادرين على تنفيذ العزلة من الخلايا العصبية من 2 ليترز منفصلة (16 الفئران المجموع) في حوالي 4 ساعات. الخطوة الرئيسية في الجدوى هو أن تك…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

المؤلفين ليس لديهم اعترافات.

Materials

Hibernate A Medium – 500 mL Thermo-Fisher A1247501 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/A1247501
Hibernate A Minus Calcium – 500 mL Brainbits HA-Ca http://www.brainbitsllc.com/hibernate-a-minus-calcium/
Glutamax 100X – 100 mL Thermo-Fisher 35050061 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/35050079
B27 Supplement 50X – 10 mL Thermo-Fisher 17504044 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/17504044
Papain, Lyophilized – 100 mg Worthington LS003119 http://www.worthington-biochem.com/pap/cat.html
Neurobasal A Medium – 500 mL Thermo-Fisher 10888022 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10888022
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Thermo-Fisher 15140122 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15140122
Poly-D-lysine hydrobromide – 5 mg Sigma-Aldrich P6407-5MG http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p6407?lang=en&region=US
Mouse Laminin – 1 mg Thermo-Fisher 23017015 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/23017015
Trypan Blue – 20 mL Sigma-Aldrich T8154-20ML http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t8154?lang=en&region=US
OptiPrep Density Gradient Medium – 250 mL Sigma-Aldrich D1556-250ML http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d1556?lang=en&region=US
Dichlorodimethylsilane (DMDCS, Sigma Silicoat) Sigma-Aldrich 440272-100ML http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/440272?lang=en&region=US
Chloroform Sigma-Aldrich 288306-1L http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/288306?lang=en&region=US
Glass Pippette – 9" Sigma-Aldrich 13-678-20C http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/cls7095d9?lang=en&region=US
Pipette bulb – 5 mL Sigma-Aldrich Z186678-3EA http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/z186678?lang=en&region=US&cm_sp=Insite-_-prodRecCold_xviews-_-prodRecCold10-1
BRAND® Petri dish, glass – 60×15 mm Sigma-Aldrich BR455717-10EA http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/br455717?lang=en&region=US
Sterile 24 Well Cell Culture Plate Sigma-Aldrich M8812-100EA http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/m8812?lang=en&region=US
Hausser Hemacytometer (glass counting chamber) Fischer Scientific 02-671-6 https://www.fishersci.com/shop/products/hausser-bright-line-phase-hemacytometer-hemacytometer/026716
Glass Slides – 12 mm sterile cover glass – uncoated Neuvitro GG-12-1.5-Pre http://www.neuvitro.com/german-coverslip-12mm-diameter.htm
NeuN Rabbit Monoclonal Antibody – 100 µL Abcam ab177487 After fixing in paraformaldehyde and blocking with 5% BSA, cells on a 12 mm coverslip were incubated in the antibody diluded to 1:200 for 18 hours in 4 °C
MAP-2 Mouse Monoclonal Antibody – 50 µL Abcam ab11267 After fixing in paraformaldehyde and blocking with 5% BSA, cells on a 12 mm coverslip were incubated in the antibody diluded to 1:500 for 18 hours in 4 °C

References

  1. Qayumi, A. K., et al. Animal model for investigation of spinal cord injury caused by aortic cross-clamping. J Invest Surg. 10 (1-2), 47-52 (1997).
  2. Fang, B., et al. Ischemic preconditioning protects against spinal cord ischemia-reperfusion injury in rabbits by attenuating blood spinal cord barrier disruption. Int J Mol Sci. 14 (5), 10343-10354 (2013).
  3. Taira, Y., Marsala, M. Effect of proximal arterial perfusion pressure on function, spinal cord blood flow, and histopathologic changes after increasing intervals of aortic occlusion in the rat. Stroke. 27 (10), 1850-1858 (1996).
  4. Stoppini, L., Buchs, P. -. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. J Neurosci Methods. 37 (2), 173-182 (1991).
  5. Ahlemeyer, B., Baumgart-Vogt, E. Optimized protocols for the simultaneous preparation of primary neuronal cultures of the neocortex, hippocampus and cerebellum from individual newborn (P0. 5) C57Bl/6J mice. J Neurosci Methods. 149 (2), 110-120 (2005).
  6. Brewer, G. J., Torricelli, J. R. Isolation and culture of adult neurons and neurospheres. Nat Protoc. 2 (6), 1490-1498 (2007).
  7. Banker, G. A., Cowan, W. M. Rat hippocampal neurons in dispersed cell culture. Brain Res. 126 (3), 397-425 (1977).
  8. Graber, D. J., Harris, B. T. Purification and culture of spinal motor neurons from rat embryos. Cold Spring Harb Protoc. 2013 (4), 319-326 (2013).
  9. Anderson, K. N., Potter, A. C., Piccenna, L. G., Quah, A. K., Davies, K. E., Cheema, S. S. Isolation and culture of motor neurons from the newborn mouse spinal cord. Brain Res Prot. 12 (3), 132-136 (2004).
  10. Gingras, M., Gagnon, V., Minotti, S., Durham, H. D., Berthod, F. Optimized protocols for isolation of primary motor neurons, astrocytes and microglia from embryonic mouse spinal cord. J Neurosci Methods. 163 (1), 111-118 (2007).
  11. Brewer, G. J., et al. Optimized survival of hippocampal neurons in B27-supplemented Neurobasal, a new serum-free medium combination. J Neurosci Res. 35 (5), 567-576 (1993).
  12. Fang, B., et al. Ischemic preconditioning protects against spinal cord ischemia-reperfusion injury in rabbits by attenuating blood spinal cord barrier disruption. Int J Mol Sci. 14 (5), 10343-10354 (2013).
  13. Su, M., Zhong, W., Ren, S. Dose-dependent protection of reseveratrol against spinal cord ischemic-reperfusion injury in rats. Trop J Pharm Res. 15 (6), 1225-1233 (2016).
  14. Haapanen, H., et al. Remote ischemic preconditioning protects the spinal cord against ischemic insult: An experimental study in a porcine model. J Thorac Cardiovasc Surg. 151 (3), 777-785 (2016).
  15. Conrad, M. F., Ye, J. Y., Chung, T. K., Davison, J. K., Cambria, R. P. Spinal cord complications after thoracic aortic surgery: long-term survival and functional status varies with deficit severity. J Vasc Surg. 48 (1), 47-53 (2008).
  16. Wong, D. R., et al. Delayed spinal cord deficits after thoracoabdominal aortic aneurysm repair. Ann Thorac Surg. 83 (4), 1345-1355 (2007).
  17. Freeman, K. A., et al. Alpha-2 agonist attenuates ischemic injury in spinal cord neurons. J Surg Res. 195 (1), 21-28 (2015).
  18. Freeman, K. A., et al. Spinal cord protection via alpha-2 agonist-mediated increase in glial cell-line-derived neurotrophic factor. J Thorac Cardiovasc Surg. 149 (2), 578-586 (2015).

Play Video

Cite This Article
Eldeiry, M., Yamanaka, K., Reece, T. B., Aftab, M. Spinal Cord Neurons Isolation and Culture from Neonatal Mice. J. Vis. Exp. (125), e55856, doi:10.3791/55856 (2017).

View Video