Summary

Isolamento e cultura dei neuroni del midollo spinale da topi neonatali

Published: July 11, 2017
doi:

Summary

Questo studio presenta una tecnica per l'isolamento dei neuroni da topi neonatali WT. Richiede l'attenta disezione del midollo spinale dal topo neonatale, seguita dalla separazione dei neuroni dal tessuto del midollo spinale attraverso la scissione meccanica ed enzimatica.

Abstract

Presentiamo un protocollo per l'isolamento e la cultura dei neuroni del midollo spinale. I neuroni sono ottenuti da topi neonatali C57BL / 6 e sono isolati nel giorno postnatalo 1-3. Un cucciolo di topo, di solito 4-10 cuccioli nati da una coppia di allevamento, viene raccolto per un esperimento e le corde spinali vengono raccolte individualmente da ciascun mouse dopo eutanasia con isoflurano. La colonna vertebrale viene disseccata e poi il midollo spinale viene rilasciato dalla colonna. I cavi spinali vengono quindi macinati per aumentare la superficie di consegna per una proteasi enzimatica che consente di liberare i neuroni e altre cellule dal tessuto. La triturazione viene poi usata per liberare le cellule in soluzione. Questa soluzione viene successivamente frazionata in un gradiente di densità per separare le varie cellule in soluzione, consentendo il isolamento dei neuroni. Circa 1-2,5 x 10 6 neuroni possono essere isolati da un gruppo di letti. I neuroni vengono poi seminati su pozzetti rivestiti di facto adesivoR che permettono una corretta crescita e maturazione. I neuroni richiedono circa 7 giorni per raggiungere la maturità nel mezzo di crescita e coltura e possono poi essere utilizzati per il trattamento e l'analisi.

Introduction

La comprensione della patologia del midollo spinale richiede l'uso di vari modelli, sia a livello macroscopico che microscopico. I modelli animali grandi e piccoli 1 , 2 , 3 sono usati per le indagini in vivo di malattie del midollo spinale e lesioni. Mentre studia questi problemi in vivo ha i suoi meriti, l'analisi del midollo spinale è limitata all'intero homogenato del midollo spinale o alle sezioni del tessuto 4 . Ciò crea qualche ambiguità quando si cerca di isolare risposte e obiettivi specifici nel midollo spinale tra i neuroni residenti e la loro regione circostante. La crescente disponibilità di topi manipolati geneticamente permette di effettuare approfondite indagini sulla biologia a livello cellulare e molecolare. Pertanto, qui viene utilizzato un modello del topo neonatale, che consente lo studio delle proprietà uniche e della biologia dei neuroni del midollo spinale in vitro .

L'isolamento e la manutenzione dei neuroni in vitro non è particolarmente diretto. Esiste una abbondanza relativa di tecniche per l'isolamento dei neuroni dal tessuto corticale dei roditori adulti che sembrano provocare un numero considerevole di neuroni isolati ( ossia milioni) 5 , 6 , 7. Al contrario, la resa dei neuroni dal tessuto del midollo spinale è inferiore a 8 , 9 , 10 , in parte dovuta alla più piccola massa di tessuto. Inoltre, nei topi c'è una relativa poca tecnica di isolamento dei neonatali I neuroni del midollo spinale ei metodi esistenti sono limitati da rese inferiori ai neuroni ( cioè centinaia) 9 o tecniche laboriose e pesanti che richiedono l'isolamento dei topi embrionali 10 .

In questo protocollo, noiUtilizzare una tecnica che consente l'isolamento costoso ed efficace di un numero considerevole di neuroni dai cavi spinali di topi neonatali. Come è comune nelle tecniche precedentemente pubblicate, utilizziamo il papain come una proteasi enzimatica, che consente il rilascio di neuroni dal tessuto del midollo spinale 5 , 6 . Inoltre, utilizziamo un gradiente di densità per la separazione delle cellule raffinate, che è stato precedentemente dimostrato essere efficace 6 , 10 . Mentre il mezzo in cui le cellule sono incubate può variare, nella nostra esperienza e come pubblicato in precedenza 11 , l'integrazione con supplemento di terreno di coltura fresco B27 è risultato essere critico per la longevità del neurone. I neuroni sono tipicamente vitali per un massimo di 10 giorni, permettendo di eseguire il trattamento.

Protocol

La cura e il trattamento degli animali in questa procedura sono state condotte in conformità con le linee guida del Comitato istituzionale di cura e uso degli animali presso l'Università del Colorado. 1. Preparazione delle soluzioni Preparare e conservare tutte le soluzioni a temperature adeguate, come mostrato nella Tabella 1 . 2. Rivestimenti di pozzetti e diapositive NOTA: i neuroni non aderisc…

Representative Results

Utilizzando questa tecnica, una singola lettiera (4-10 cuccioli) consente l'isolamento di 1-2,5 10 neuroni adatti per l'invaso su piastre di coltura. Tipicamente, 4-8 pozzetti vengono seminati alla concentrazione menzionata sopra ( cioè 300.000 cellule / ml). La Figura 3 mostra l'apparenza dei neuroni a questa concentrazione dopo una settimana di coltura a microscopia leggera di ingrandimento ( a ) e ad alta ( b…

Discussion

Questa tecnica consente la cultura affidabile dei neuroni del midollo spinale. Una volta raggiunta la conoscenza della tecnica, ci vogliono circa 3,5 ore per completare. Siamo stati in grado di effettuare l'isolamento dei neuroni da 2 cucciolate separate (16 topi totali) in circa 4 h. Il passo fondamentale della fattibilità è poter estrarre efficacemente i cavi spinali dai topi. La resa consente di plating diversi pozzetti e per la capacità di testare i neuroni in varie condizioni. Siamo stati in grado di trattar…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Gli autori non hanno alcun riconoscimento.

Materials

Hibernate A Medium – 500 mL Thermo-Fisher A1247501 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/A1247501
Hibernate A Minus Calcium – 500 mL Brainbits HA-Ca http://www.brainbitsllc.com/hibernate-a-minus-calcium/
Glutamax 100X – 100 mL Thermo-Fisher 35050061 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/35050079
B27 Supplement 50X – 10 mL Thermo-Fisher 17504044 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/17504044
Papain, Lyophilized – 100 mg Worthington LS003119 http://www.worthington-biochem.com/pap/cat.html
Neurobasal A Medium – 500 mL Thermo-Fisher 10888022 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10888022
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Thermo-Fisher 15140122 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15140122
Poly-D-lysine hydrobromide – 5 mg Sigma-Aldrich P6407-5MG http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p6407?lang=en&region=US
Mouse Laminin – 1 mg Thermo-Fisher 23017015 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/23017015
Trypan Blue – 20 mL Sigma-Aldrich T8154-20ML http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t8154?lang=en&region=US
OptiPrep Density Gradient Medium – 250 mL Sigma-Aldrich D1556-250ML http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d1556?lang=en&region=US
Dichlorodimethylsilane (DMDCS, Sigma Silicoat) Sigma-Aldrich 440272-100ML http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/440272?lang=en&region=US
Chloroform Sigma-Aldrich 288306-1L http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/288306?lang=en&region=US
Glass Pippette – 9" Sigma-Aldrich 13-678-20C http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/cls7095d9?lang=en&region=US
Pipette bulb – 5 mL Sigma-Aldrich Z186678-3EA http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/z186678?lang=en&region=US&cm_sp=Insite-_-prodRecCold_xviews-_-prodRecCold10-1
BRAND® Petri dish, glass – 60×15 mm Sigma-Aldrich BR455717-10EA http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/br455717?lang=en&region=US
Sterile 24 Well Cell Culture Plate Sigma-Aldrich M8812-100EA http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/m8812?lang=en&region=US
Hausser Hemacytometer (glass counting chamber) Fischer Scientific 02-671-6 https://www.fishersci.com/shop/products/hausser-bright-line-phase-hemacytometer-hemacytometer/026716
Glass Slides – 12 mm sterile cover glass – uncoated Neuvitro GG-12-1.5-Pre http://www.neuvitro.com/german-coverslip-12mm-diameter.htm
NeuN Rabbit Monoclonal Antibody – 100 µL Abcam ab177487 After fixing in paraformaldehyde and blocking with 5% BSA, cells on a 12 mm coverslip were incubated in the antibody diluded to 1:200 for 18 hours in 4 °C
MAP-2 Mouse Monoclonal Antibody – 50 µL Abcam ab11267 After fixing in paraformaldehyde and blocking with 5% BSA, cells on a 12 mm coverslip were incubated in the antibody diluded to 1:500 for 18 hours in 4 °C

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Cite This Article
Eldeiry, M., Yamanaka, K., Reece, T. B., Aftab, M. Spinal Cord Neurons Isolation and Culture from Neonatal Mice. J. Vis. Exp. (125), e55856, doi:10.3791/55856 (2017).

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